Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
Trasfezione di DNA è stato prezioso per le scienze biologiche e con i recenti progressi verso organotipica preparazioni fetta cervello, l'effetto di vari geni eterologhi potrebbe quindi essere indagato facilmente pur mantenendo molti aspetti della biologia in vivo. C'è stato un crescente interesse per trasfettare neuroni terminalmente differenziate per i quali i metodi di trasfezione convenzionali sono stati irto di difficoltà, come basse rese e le perdite significative in vitalità. Trasfezione Biolistic può aggirare molti di questi problemi ma solo di recente è questa tecnica stata modificata in modo che sia suscettibile per l'uso in tessuti dei mammiferi.
Nuove modifiche alla camera di acceleratore hanno migliorato la precisione di tiro della pistola gene e aumentato la sua profondità di penetrazione consentendo anche l'uso di pressione del gas inferiore (50 psi) senza perdita di efficienza di trasfezione oltre a permettere una diffusione mirata regioselettiva della paARTICOLI per entro i 3 mm. Inoltre, questa tecnica è semplice e rapido da eseguire rispetto microiniezioni noiosi. Sia transiente ed espressione stabile sono possibili con nanoparticelle bombardamento cui espressione episomiale può essere rilevato entro 24 ore e la sopravvivenza cellulare ha dimostrato di essere migliore di, o almeno uguale, metodi convenzionali. Questa tecnica ha però un vantaggio fondamentale: permette la trasfezione di essere localizzato all'interno di un singolo raggio trattenuto permettendo così all'utente di isolare anatomicamente effetti del gene eterologo. Qui vi presentiamo un protocollo in profondità per preparare vitale adulti fette organotipiche e li presenta al regioselettiva trasfezione mediante una migliore pistola gene.
Originariamente la tecnica biolistic, una frase turn-of-balistica per "biologici", è stata istituita per particella-mediato trasferimento genico nelle cellule vegetali 1. Questo metodo fisico di trasformazione cellulare micro o nanoparticelle accelera ad alta velocità per superare le barriere fisiche delle membrane cellulari impermeabili al fine di trasportare carichi come il DNA o coloranti. Poiché non dipende da specifici ligandi-recettori e / o le proprietà biochimiche nelle membrane di superficie cellulare, il trasferimento genico mediato da particelle può essere facilmente applicata ad una varietà di sistemi biologici come fettine cerebrali organotipica.
Uso fette organotipiche presentano vantaggi rispetto ad altri in piattaforme vitro in quanto mantengono molte proprietà anatomiche e biochimiche che sono pertinenti al vivo biologia 2-4. Le fette per lo più conservano le caratteristiche architettoniche locali da dove hanno origine e preserve l'attività neurochimica e la connettività delle sinapsi. L'uso di fette di cervello per la ricerca di base, e in sforzi farmaceutiche, ha aumentato in concomitanza con il numero di possibili manipolazioni biotecnologiche per misurare e monitorare i comportamenti neurobiologici del cervello in un contesto in vivo come 3,5-7. I principali vantaggi per l'utilizzo di sistemi di test basati fetta-organotipica è che fornisce controllo sperimentale facile e consente manipolazioni precise di ambienti extracellulari.
Fruttuosamente, sistemi di coltura fetta organotipica sono stati stabiliti da una varietà di regioni del cervello, come, ma non limitato a, la corteccia, midollo spinale, cervelletto e 8-10. Inoltre, un certo numero di co-colture sono state dimostrate, che permetta la valutazione della comunicazione intercellulare tra le regioni cerebrali distali e tra neuroni e cellule patologiche 11,12. Molti protocolli sono già stati istituiti per successfully fette cultura organotipica e in grado di mantenere la redditività a lungo termine e molti studi recenti oggi utilizzano i metodi di interfaccia membrana e le varie modifiche ad esso 13. Questo principio mantiene le fette organotipiche all'interfaccia tra il fluido e l'atmosfera umidificata dell'incubatore posizionando le fette su un filtro a membrana porosa. Il mezzo può quindi fornire nutrienti sufficienti per alimentare le fette organotipiche tramite movimento capillare. In genere le fette sono state preparate dai primi animali postnatali (3-9 giorni; P3 – 9). Tuttavia, i tessuti cerebrali da queste fette di un elevato livello di plasticità cellulare e hanno una resistenza intrinseca alle sollecitazioni meccaniche, che è utile per ottenere colture vitali, ma sinapsi mature e circuiti neuroanatomici non sono pienamente sviluppati in vivo fino a 2 o 3 settimane di età 14. Ad esempio, le osservazioni precedenti avevano mostrato che le fettine di ippocampo ottenute da P0 – 1 neonati, anche se altamente Viable dopo la preparazione, a poco a poco ha perso alcune caratteristiche morfologiche. In sostanza, essi hanno dimostrato di essere inadatto per colture a lungo termine suggeriscono cellule immature erano più probabilità di de-differenziare rispetto alle colture organotipiche da animali più vecchi 15,16. Per questo motivo il nostro metodo è stato ottimizzato per adulti fettine di cervello organotipica in cui la maturazione e lo sviluppo architettonico hanno raggiunto i loro fasi terminali 13,17-21. Tuttavia, questo metodo è adatto per neonato e fette organotipica giovanili anche.
Una volta che le fette organotipiche vitali sono stati prodotti l'intera piastra contenente le fette può essere portato alla biolistic monte e presentata al regioselettiva consegna e trasfezione. Montaggio corretto della pistola genica (come descritto in figura 1), orientate a 90 ° ad una distanza di 10 mm direttamente sulle fette (dall'apertura al tessuto), permette la rapida consegna biolistic dei 40 nm andareparticella ld rivestito carichi. Questi carichi come coloranti e vettori di DNA fluorescenti, così come qualsiasi gene di interesse, vengono prontamente consegnati nelle fette vitali con facilità. Questo metodo descrive così il protocollo necessari per fornire, in maniera regioselettiva, carico rivestito nanoparticelle d'oro nella vitali fettine di cervello organotipica. La canna della pistola gene e il montaggio ottimale può essere visto in Figura 1. Per ulteriori informazioni riguardanti le botte e nanoparticelle migliori balistica, vedere O'Brien, et al. 17.
Parametri successivi sono indicati anche per l'utente di ottimizzare le condizioni quali la corretta quantità di oro consegnato per area di destinazione, definita come microcarrier Caricamento Quantità (MLQ), e per determinare la quantità di DNA caricato per mg di oro, definito come il DNA Loading Rapporto (DLR). Prima di precipitare il DNA su particelle di oro e di caricarle nel tubo Tefzel che comprende le cartucce della pistola gene reale '9 ;, è necessario calcolare la quantità di DNA e oro richiesto per ogni trasfezione che possono differire tra i tessuti e le condizioni (rapporto dovrebbe essere mantenuta tra 1 mg oro e 1 mg di DNA a 1: 5). E 'di vitale importanza per preparare la giusta proporzione di MLQ a DLR altrimenti rivestite di DNA particelle d'oro potrebbero aderire insieme formano più grande agglomerato previsto, che potrebbe ridurre l'omogeneità complessiva della diffusione biolistic come pure i danni incremento tessuti e citotossicità.
Questo metodo mostra i recenti miglioramenti nella consegna biolistic, che sono stati testati e determinati per essere suscettibili per neonati, giovani e adulti fettine di cervello organotipica. Inoltre, sfruttando ridotta diffusione biolistic della canna della pistola gene, l'utente è ora in grado di trasfettare selettivamente una regione puntuale nel cervello. Dopo il tempo di incubazione del caso, l'espressione delle proteine fluorescenti, che raggiunge i suoi tassi massimi tra 24 e 48hr, può essere visualizzato da epifluorescenza e microscopia confocale. Questi fluorofori consentono l'analisi morfologica e la localizzazione delle singole cellule all'interno di strutture biologicamente rilevanti. Tuttavia, la modulazione regioselettiva delle fette organotipiche di altri geni eterologhi può essere monitorato da eventuali altre prove suscettibili di questi preparati. Possibili strategie di lavoro per la consegna del gene localizzato sono presentati in Figura 2.
Il protocollo descrive gli approcci per fornire coloranti e materiali genetici a fette organotipiche adulti utilizzando una pistola gene potenziato. Essenzialmente, i tipi di coloranti e la varietà di possibili geni rendono questo metodo poliedrico e suscettibili di rispondere ad una vasta gamma di questioni biologiche. Il metodo di consegna regioselettiva utilizzato, in questo caso a regione specifica del cervello, apre nuove strade per la sperimentazione come la modulazione del gene eterologo di aree localizzate all'interno di un'architettura biologicamente rilevante non è stata facilmente realizzabile prima. Abbiamo già stabilito che questo metodo può essere utilizzato su fette organotipiche adulti, dove sinapsi mature sono completamente formate, come ha mostrato una migliore sopravvivenza cellulare e l'espressione genica eterologa per molte settimane 13. Con l'avvento di nuove e migliori condizioni di coltura per il cervello dei mammiferi e anche altri tessuti, l'uso di modulazioni genetiche regioselettiva sarà sempre più utile per un'ampia varietà di biocheMICAL analisi.
Come vedremo in evidenza qui e già citato da altri 24, molti fattori diversi possono facilmente influenzare la precisione e l'affidabilità di consegna biolistic. In primo luogo, la preparazione della particella oro legato ai coloranti o DNA deve essere adeguatamente bilanciati per evitare aggregazione e facilitare l'espulsione cartuccia carico. Calcio e spermidina nella soluzione di micro particelle di DNA-oro possono aiutare il legame delle molecole di DNA per le nanoparticelle d'oro. La possibilità per le nanoparticelle di penetrare le cellule sotto pressione ridotta è stato precedentemente determinato 17. In secondo luogo, la pistola genica deve essere montato il più costante possibile con l'angolo e la distanza corretta. Un manometro affidabile è anche necessario per la riproducibilità, per mantenere l'integrità dei tessuti, e per accelerare adeguatamente le particelle d'oro ai loro obiettivi. Infatti, la distanza, l'orientamento e la stabilità delle apparecchiature sono anche fattori cruciali per il targeting e precisione di consegna regioselettiva. Poiché queste strutture cerebrali sono molto piccole, piccole variazioni dell'angolo cottura potrebbe facilmente rendere l'intera procedura meno affidabile. E, infine, la preparazione e la manutenzione delle fette organotipiche vitali sono state irto di difficoltà per molti decenni ancora protocolli abbondanti e affidabili per diversi animali, regioni del cervello, età e co-colture sono attualmente disponibili 2,4,25,26. Tali procedure dovrebbero essere ottimizzato per l'utente prima di presentare i tessuti alle procedure Biolistic. Questo sarà più facilmente consentire all'utente di verificare unbiasedly l'impatto delle particelle Biolistic e l'effetto del gene eterologo sulle proprie culture. A tal fine, l'uso di geni fluorescenti come EYFP e EGFP può consentire sia un romanzo utente per testare la precisione di targeting e anche seguire la vitalità cellulare attraverso l'espressione genica eterologa per un periodo prolungato di tempo 13. Molti dei passaggi critici per affidabilitàe l'uso riproducibile di questo protocollo sono evidenziati nei tre paragrafi seguenti.
Per la trasfezione efficiente, la concentrazione di DNA deve essere adeguata. Concentrazioni troppo basse avrebbero ostacolare la resa di trasfezione mentre le concentrazioni troppo elevate possono causare agglomerazione delle nanoparticelle. Aggregati di oro possono ridurre drasticamente l'efficienza di trasfezione, causare distribuzioni irregolari, e possono portare ad un aumento citotossicità e dello stress ossidativo. Problemi con efficienza rivestimento sono probabilmente a causa della scadenza della soluzione spermidina (dovrebbe essere sostituito ogni 2 o 3 mesi). Per un'adeguata diffusione biolistic, l'etichettatura deve essere pari. Una etichettatura non omogenea della sospensione di nanoparticelle di oro / DNA può essere dovuto alla soluzione PVP. Dovrebbe anche essere sostituito ogni 2 o 3 mesi. Rivestimento delle nanoparticelle d'oro può essere visto su elettroforesi su gel di agarosio come una banda MW superiore 27.
Ogni Syst biologicoem sotto inchiesta così come ogni altro strumento utilizzato potrebbe richiedere piccole variazioni di pressione del gas di raggiungere livelli ottimali di trasfezione e la diffusione biolistic. Il parametro critico è la pressione del polso elio necessaria per togliere la micro o nano-vettori dalla cartuccia di plastica e li spingono nel tessuto. Un alta pressione del gas influenzerà la sopravvivenza delle cellule, perché crea onde d'urto in tutto il bersaglio e disturbare o staccare il tessuto dalla matrice 17. Mirare la canna della pistola genica ed aventi l'apparato esattamente perpendicolare al tessuto è importante per la consegna biolistic accurata. L'area selezionata deve essere collocato direttamente nel centro della canna precisamente 10 mm dal diaframma esterno. Ciò si traduce in un diametro di 3 mm consegna particelle d'oro intorno dell'epicentro. La canna della pistola gene deve essere pulito con etanolo al 70% dopo ogni utilizzo. Per proteggere il tessuto da grandi aggregati di particelle, la canna contiene anche una rete di nylon che shoULD essere sostituiti regolarmente per mantenere prestazioni ottimali. Per sostituire le maglie svitare il tappo quindi inserire una nuova rete di nylon tra il tappo e l'O-ring.
Fluorescente cellule marcate devono essere visibili almeno 1 – 2 giorni dopo la trasfezione intorno all'epicentro. Assenza o disallineamento di etichettatura possono derivare da preparazione inadeguata e l'instabilità del montaggio gene pistola. Le osservazioni di celle utilizzando microscopia confocale dipende da una serie di fattori: la lunghezza d'onda della luce di eccitazione / emissione, dimensioni pinhole, NA della lente obiettivo, indice di rifrazione dei componenti nel percorso ottico, profondità del tessuto, e l'allineamento dei lo strumento. Questi fattori dovrebbero essere ottimizzate per ogni sistema in esame.
I recenti progressi nella biolistics sono stati sfruttati per il successo di questo metodo. La canna gene pistola usata in questo studio è stato modificato in modo da ridurre la pressione necessaria così come imbuto la biolisticmodello di dispersione in un'area più vincolata e specifico 17,19. Altre modifiche barile hanno cercato di limitare la diffusione biolistic e ridurre la pressione di efflusso 28 ancora questa canna della pistola gene progettato su misura progettato dal Dr. O'Brien è un singolo componente montato sulla pistola Helios Gene standard. Successivamente, particelle d'oro sub-micrometriche sono stati utilizzati per ridurre l'invasività di particelle micrometriche che avevamo determinati in precedenza causato danni cellulari e, in definitiva, la perdita di espressione genica eterologa sostenuta. Queste modifiche alla procedura biolistic migliorato la fattibilità complessiva e la riproducibilità del metodo 13. Altri miglioramenti sulla preparazione fetta, come in profondità la risoluzione dei problemi della procedura di affettamento, utilizzando una matrice DMEM-Agarose per preservare il cervello, e numerose altre innovazioni utili in organotipica preparazione fetta cervello precedentemente segnalati 13 ci ha permesso di esplorare l'uso di fette di adulti che hanno sviluppato maturoreti sinaptiche.
Nel nostro studio abbiamo utilizzato principalmente coloranti e geni eterologhi fluorescenti di visualizzare la morfologia delle cellule come una lettura sulla efficienza di trasfezione e la capacità di un'immagine le caratteristiche morfologiche dei neuroni nei tessuti cerebrali del mouse. Il rapporto segnale-rumore della consegna stocastico entro un raggio definito ci ha permesso di isolare completamente il porto dendritiche di una singola cella nel suo contesto originario. Come numerosi sforzi vengono usati per studiare queste caratteristiche morfologiche, mappatura 'connectomics' o per etichettare le singole cellule per varie analisi, questo metodo potrebbe facilmente essere combinato con i protocolli esistenti quali elettrofisiologia e neuriti misurazioni 29,30. Evidentemente, combinazioni di geni eterologhi fluorescenti potrebbero consentire una delimitazione molto più robusto di singole cellule come la distribuzione stocastica delle proteine fluorescenti, e la loro combinazione sarebbe determinare il colore delle singole celle 31,32. L'uso di cellulari promotori specifici come sinapsina e proteina gliale fibrillare acida monte dell'esone gene eterologo può anche limitare l'espressione di sottopopolazioni 33. Infatti, la varietà infinita di materiale genetico può essere consegnato anche in maniera regioselettiva da nanoparticelle d'oro con la stessa procedura. Le regioni totale trasfettate potrebbero quindi essere analizzati con metodi tradizionali, come la dissezione e la presentazione che regione Western immunoblotting per analizzare l'effetto localizzato del gene eterologo.
Miglioramenti delle procedure fetta organotipica saranno inoltre consentire un più ampio uso di tessuti cerebrali per la sperimentazione a lungo termine, nonché permesso l'uso di altri tessuti e co-colture e faciliterebbe le procedure di trasfezione. Lipidi e polimeri di trasfezione sono stati precedentemente segnalati per influenzare l'omeostasi di membrana, interiorizzazione, proteine permeabilità 34 e spesso mostrano molto bassa efficienza di trasfezione terminally differenziata neuroni. Cella gestione mirata carico è anche suscettibile solo alle cellule che esprimono i recettori della superficie cellulare necessari per interiorizzazione, e anche se questo metodo può essere altamente selettivo, si può mancare regioselettività 35 mirati. Vettori virali altrimenti sono spesso difficili e costosi da produrre, richiedono norme rigorose e hanno a volte dimostrato problemi di sicurezza. Consegna Biolistic ha quindi una capacità senza pari di transfettare regioselettivamente neuroni e di altri tipi di cellule all'interno dei tessuti vitali. Come l'oro è non tossici, ulteriori progressi nell'uso della biolistics potrebbe aprire la strada per usi biomedici come la consegna transdermico farmaceutico, non invasiva in vivo consegna del gene, così come le terapie geniche non virali localizzate.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il workshop MRC-LMB per la produzione della canna maggiore gene della pistola. Vorremmo anche ringraziare il Dr. David R. Hampson presso l'Università di Toronto per l'uso di attrezzature e di risorse.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |