Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
A transfecção de DNA tem sido inestimável para ciências biológicas e com os recentes avanços em preparações fatia do cérebro organotypic, o efeito de vários genes heterólogos poderia, assim, ser investigado facilmente, mantendo muitos aspectos da biologia in vivo. Tem havido um interesse crescente para transf neurônios terminalmente diferenciadas para que os métodos de transfecção convencionais têm sido repleta de dificuldades, como os baixos rendimentos e perdas significativas para a viabilidade. Biolistic transfecção pode contornar muitas destas dificuldades ainda apenas recentemente esta técnica foi modificada de modo que é favorável para uso em tecidos de mamíferos.
Novas modificações na câmara de acelerador ter maior precisão de tiro da arma do gene e aumentou suas profundidades de penetração ao mesmo tempo, permitindo o uso de menor pressão de gás (50 psi), sem perda de eficiência de transfecção, bem como permitir a propagação regiosseletiva focalizada do paARTIGOS para dentro de 3 mm. Além disso, esta técnica é para a frente e mais rapidamente do que para realizar microinjections fastidiosos. Ambos transitória e expressão estável de nanopartículas são possíveis com bombardeamento onde expressão episómico podem ser detectados dentro de 24 horas e a sobrevivência de células mostrou-se melhor do que, ou igual a, pelo menos, os métodos convencionais. Esta técnica tem contudo uma vantagem importante: ela permite a transfecção para ser localizada dentro de um único raio retido permitindo assim que o utilizador isolar anatomicamente efeitos do gene heterólogo. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para preparar adultos viável fatias organotypic e submetê-los a regiosseletiva transfecção utilizando uma arma gene melhorado.
Originalmente, a técnica de biobalística, uma frase da virada para "balística biológicos", foi criada para a transferência de genes mediada por partículas em células de plantas 1. Este método físico de transformação celular ou nanopartículas micro acelera a velocidade elevada para superar as barreiras físicas das membranas celulares impermeáveis de modo a fornecer cargas, tais como o DNA ou corantes. Porque não dependem de ligando-receptores específicos e / ou as propriedades bioquímicas nas membranas da superfície das células, a transferência de genes mediada por partículas pode ser facilmente aplicado a uma variedade de sistemas biológicos, tais como fatias cerebrais organotípicas.
Usando fatias organotypic têm vantagens sobre outros em plataformas in vitro, uma vez que manter muitas propriedades anatômicas e bioquímicas que são pertinentes para in vivo biologia 2-4. As fatias de conservar a maior parte das características arquitetônicas locais de onde eles se originaram e preserve atividade neuroquímica ea conectividade das sinapses. O uso de fatias do cérebro para a pesquisa básica, e em empreendimentos farmacêuticos, concomitantemente tem aumentado com o número de possíveis manipulações biotecnológicas para medir e monitorar os comportamentos neurobiológicos do cérebro em um in vivo como contexto 3,5-7. As grandes vantagens para a utilização de sistemas de ensaio baseados em organotípicas de fatias é que ele proporciona um controlo fácil e experimental permite manipulações precisas de ambientes extracelulares.
Proveitosamente, sistemas de cultura organotípica fatia foram estabelecidas a partir de uma variedade de regiões cerebrais, tais como, mas não limitado a, o córtex, medula espinhal e cerebelo de 8-10. Além disso, tem sido demonstrado uma série de co-culturas, o que permite a avaliação da comunicação intercelular entre as regiões cerebrais distais, bem como entre os neurônios e células patológicas 11,12. Muitos protocolos já foram estabelecidos para successfully fatias cultura organotypic e pode manter a viabilidade a longo prazo e muitos estudos recentes agora utilizar os métodos de interface membrana e diversas modificações para ele 13. Este princípio mantém as fatias organotípicas na interface entre o meio e uma atmosfera humidificada da incubadora, colocando as fatias em um filtro de membrana porosa. O meio pode, assim, proporcionar nutrientes suficientes para alimentar as fatias organotípicas através movimento capilar. Normalmente fatias foram preparados a partir de animais pós-natal precoce (3-9 dias de idade; P3 – 9). No entanto, a partir de tecidos cerebrais essas fatias apresentam um elevado grau de plasticidade celular e tem uma resistência inerente às solicitações mecânicas, o que é útil para obter culturas viáveis, ainda sinapses maduras e circuitos neuroanatômico não totalmente desenvolvido in vivo, até 2 a 3 semanas de idade 14. Por exemplo, observações anteriores tinham demonstrado que os obtidos a partir de fatias de hipocampo P0 – 1 neonatos, embora altamente VIABle seguinte preparação, foi perdendo algumas características morfológicas. Essencialmente, eles mostraram-se inadequadas para as culturas de longo prazo, sugerindo células imaturas eram mais propensos a de-diferenciada em comparação com culturas organotypic de animais mais velhos 15,16. Por esta razão, o nosso método foi otimizado para fatias de cérebro organotypic adultos em que a maturação e desenvolvimento arquitetônico tenham atingido os seus estágios terminais 13,17-21. No entanto, este método também é adequado para recém-nascidos e fatias organotípicas juvenis.
Uma vez que as fatias organotípicas viáveis foram produzidos toda a placa contendo as fatias pode ser trazido para a montagem biolística e submetidos a entrega regiosselectiva e transfecção. A montagem adequada da pistola de genes (tal como descrito na Figura 1), orientado a 90 °, a uma distância de 10 milímetros directamente sobre as fatias (a partir da abertura para o tecido), permite o fornecimento biolístico rápida dos 40 nm irld cargas de partículas revestidas. Estas cargas, tais como corantes fluorescentes e vectores de ADN, bem como qualquer gene de interesse, são facilmente entregue nas fatias viáveis com facilidade. Este método, portanto, descreve o protocolo necessário para fornecer, de uma maneira regio-selectiva, carga nanopartículas de ouro revestido em fatias de cérebro organotípicas viáveis. O cano da arma gene e montagem ideal pode ser visto na Figura 1. Para mais informações sobre o barril e nanopartículas melhorou balística, consulte O'Brien, et al. 17.
Refinamentos subsequentes também são indicados para o utilizador para optimizar as condições, tais como a quantidade adequada de ouro entregue por área alvo, como definido microtransportador quantidade de carregamento (MLQ), e para determinar a quantidade de ADN carregado por mg de ouro, definido como ADN Carregando Proporção (DLR). Antes de precipitar DNA em partículas de ouro e colocá-los na tubulação Tefzel que compreende os cartuchos da arma gene real '9 ;, é necessário para calcular a quantidade de ADN e de ouro necessária para cada transfecção, que podem diferir um pouco entre os tecidos e condições (proporção deve ser mantida entre 1 mg de ouro e 1 ug de ADN de 1: 5). É vital para preparar a proporção adequada de MLQ a DLR em contrário DNA revestido partículas de ouro poderia aderir juntos formando maior do que a aglomeração esperado, o que poderia reduzir a homogeneidade global da propagação biobalística, bem como danos aumento do tecido e citotoxicidade.
Este método mostra as recentes melhorias na prestação de biobalística, que foram testados e considerados passíveis de fatias do cérebro organotypic neonatais, jovens e adultos. Além disso, através da exploração de spread reduzido biobalística do cano da arma gene, o usuário agora é capaz de transfecção seletivamente uma região pontual no cérebro. Após o tempo de incubação apropriado, a expressão das proteínas fluorescentes, que atinge os seus valores máximos entre 24 e 48h, pode ser visualizada por microscopia confocal e epifluorescência. Estes fluorophores permitir a análise morfológica e localização das células individuais dentro de estruturas biologicamente relevantes. No entanto, a modulação regiosselectiva das fatias organotípicas de outros genes heterólogos também podem ser monitorizadas por quaisquer outros testes passíveis para estas preparações. Possíveis estratégias úteis para a entrega de genes localizados são apresentados na Figura 2.
O protocolo descreve abordagens para entregar corantes e materiais genéticos em fatias organotípicas adultas utilizando uma pistola de genes melhorada. Essencialmente, os tipos de corantes e a variedade de possíveis genes fazem deste método multifacetado e passível de responder a uma grande variedade de questões biológicas. O método de entrega regiosseletiva utilizado, neste caso, a região específica do cérebro, abre novos caminhos para a experimentação como modulação de genes heterólogos de áreas localizadas dentro de uma arquitetura biologicamente relevante não foi facilmente exequível antes. Temos previamente determinado que este método pode ser usado em fatias organotípicas adulto, onde sinapses maduras são totalmente formados, tal como revelou melhoria na sobrevivência de células e expressão de genes heterólogos para muitas semanas 13. Com o advento de novas e melhoradas as condições de cultura para o cérebro de mamíferos, bem como outros tecidos, a utilização de modulação genéticas regiosselectiva se tornará cada vez mais úteis para uma grande variedade de BiocheMical analisa.
Como vamos destacar aqui e anteriormente mencionado por outros 24, muitos fatores diferentes podem facilmente afetar a precisão e confiabilidade de entrega biobalística. Em primeiro lugar, a preparação das partículas de ouro ligados a corantes ou de DNA deve ser adequadamente equilibrado para evitar a agregação e a fim de facilitar a expulsão da carga do cartucho. Cálcio e espermidina na solução de micro partículas de ADN-ouro pode ajudar a ligação das moléculas de ADN para as nanopartículas de ouro. A capacidade para as nanopartículas de penetrar nas células, sob pressão reduzida foi previamente determinado 17. Em segundo lugar, a arma gene deve ser montado o mais estável possível com o ângulo ea distância correta. Um manómetro de confiança é também necessário para a reprodutibilidade, para manter a integridade do tecido, e para acelerar adequadamente as partículas de ouro para os seus objectivos pretendidos. Com efeito, a distância, a orientação, e a estabilidade do equipamento também estão factores cruciais para a targeting e precisão de entrega regiosseletiva. Como estas estruturas cerebrais são muito pequenas, pequenas variações no ângulo de disparo poderia facilmente tornar todo o processo mais confiável. E, finalmente, a preparação e manutenção de fatias organotypic viáveis foram repleta de dificuldades para muitas décadas ainda protocolos abundantes e confiáveis para animais diferentes, regiões do cérebro, idades e co-culturas estão disponíveis 2,4,25,26. Estes procedimentos devem ser antes de submeter os tecidos para procedimentos biolística otimizado pelo usuário. Isto irá mais facilmente permitir ao utilizador verificar unbiasedly o impacto das partículas biolística e o efeito do gene heterólogo nas suas próprias culturas. Para este fim, a utilização de genes fluorescentes tais como EYFP EGFP e tanto pode permitir um novo utilizador para testar a precisão de direccionamento e também a seguir a viabilidade celular através da expressão do gene heterólogo ao longo de um período sustentado de tempo 13. Muitos dos passos críticos para fiávele uso reprodutível deste protocolo são destacados nos três parágrafos seguintes.
Para a transfecção eficaz, a concentração de DNA deve ser apropriado. As concentrações que são muito baixos prejudicaria o rendimento transfecção enquanto que as concentrações muito altas pode causar aglomeração das nanopartículas. Os agregados de ouro pode reduzir drasticamente a eficiência da transfecção, causar distribuições irregulares, e pode levar a um aumento da citotoxicidade e stress oxidativo. Problemas com a eficácia do revestimento são provavelmente devido à expiração da solução espermidina (deve ser substituído a cada 2 a 3 meses). Para uma propagação biobalística adequada, a rotulagem deve ser mesmo. A marcação não-homogénea da suspensão de nanopartículas de ouro / ADN pode ser devido à solução de PVP. Também deve ser substituído cada 2 a 3 meses. Revestimento das nanopartículas de ouro pode ser visto na electroforese em gel de agarose, como uma faixa de MW mais elevado 27.
Cada sist biológicalos sob investigação, bem como cada instrumento diferente usado pode exigir pequenas mudanças na pressão do gás para atingir níveis optimizados de transfecção e propagação biobalística. O parâmetro crítico é a pressão do impulso de hélio necessário para retirar o micro ou nano-transportadores a partir do cartucho de plástico e empurrá-las para o tecido. A pressão do gás de alta vai afetar a sobrevivência da célula, porque vai criar ondas de choque em todo o alvo e interromper ou retirar o tecido da matriz 17. Visando o cano da arma de genes e possuindo o aparelho exatamente perpendicular ao tecido é importante para a entrega precisas biolística. A área seleccionada deve ser colocado no centro do tambor directa, precisamente de 10 mm da abertura exterior. Isto resulta em um diâmetro de 3 mm de distribuição de partículas de ouro em volta do epicentro. O cano da arma gene deve ser limpa com álcool 70% após cada utilização. Para proteger o tecido a partir de grandes agregados de partículas, o tambor também contém uma malha de nylon que should ser substituídas regularmente para manter o desempenho ideal. A fim de substituir as malhas desapertar a tampa, em seguida, inserir uma nova malha de nylon entre a tampa eo O-ring.
Células marcadas por fluorescência deveria ser visível pelo menos 1 – 2 dias após a transfecção em torno do epicentro. Ausência ou desalinhamento de rotulagem pode ser resultado de uma preparação inadequada e instabilidade da montagem arma gene. As observações de células usando microscopia confocal depende de uma série de factores: o comprimento de onda da luz de excitação / emissão, o tamanho do orifício, NA da lente objectiva, de índice de refracção dos componentes no caminho da luz, a profundidade do tecido, e o alinhamento de o instrumento. Esses fatores devem ser otimizados para cada sistema sob investigação.
Recentes avanços em biol�tica foram exploradas para o sucesso deste método. O cano da arma de genes utilizados no presente estudo foi modificado de modo a reduzir a pressão necessária, assim como canalizar o biol�ticapadrão de dispersão para uma forma mais restrita e específica área de 17,19. Outras modificações barril tentaram restringir a disseminação de biobalística e reduzir a pressão de saída 28 ainda este gene cano da arma projetado projetado pelo Dr. O'Brien é um único componente instalado na arma Helios Gene padrão. Subsequentemente, as partículas sub-micrométricas de ouro foram usadas para reduzir a capacidade de invasão das partículas micrométricas que determinaram previamente causado dano celular e em última instância, a perda de expressão do gene heterólogo sustentada. Estas modificações do procedimento de biolística melhorou a viabilidade global e reprodutibilidade do método 13. Outras melhorias na preparação fatia como solução de problemas em profundidade do processo de corte, usando uma matriz de DMEM-Agarose para preservar o cérebro, e vários outros avanços úteis para organotípica preparação fatia do cérebro relatado anteriormente 13 nos permitiu explorar o uso de fatias de adultos que desenvolveram maduraredes sinápticas.
Em nosso estudo, principalmente utilizados corantes e genes heterólogos fluorescentes para visualizar a morfologia das células como uma leitura sobre a eficiência de transfecção e uma capacidade de imagem das características morfológicas dos neurônios nos tecidos cerebrais do rato. A relação sinal-ruído da entrega estocástica dentro de um raio definido nos permitiu isolar completamente porto dendrítica de uma única célula dentro de seu contexto de origem. Como são utilizados numerosos esforços para investigar essas características morfológicas, de mapeamento 'conectonomia "ou para marcar células individuais para várias análises, este método pode ser facilmente combinada com protocolos existentes, tais como eletrofisiologia e neurite medições 29,30. Evidentemente, as combinações de genes heterólogos fluorescentes poderia permitir uma delineação muito mais robusta das células individuais como da distribuição estocástica de proteínas fluorescentes, e a sua combinação poderia determinar a cor das células individuais 31,32. A utilização de promotores específicos de células, como a sinapsina e proteína glial fibrilar ácida a montante do exão do gene heterólogo pode também restringir a expressão de 33 subpopulações. Com efeito, a variedade sem fim de material genético pode também ser administrado de uma maneira regio-selectiva por nanopartículas de ouro, utilizando o mesmo procedimento. As regiões totais transfectadas podia assim ser analisados com os métodos tradicionais, tais como a dissecção e submetendo-a região inmunotransferência para analisar o efeito localizado do gene heterólogo.
As melhorias nos processos fatia organotypic também permitirá uma maior utilização de tecidos do cérebro para a experimentação de longo prazo, bem como permitir o uso de outros tecidos e co-culturas e facilitaria os procedimentos de transfecção. Lipid e transfecção polímero previamente relatado para afetar a homeostase da membrana, internalização, permeabilidade proteína 34 e freqüentemente mostram uma eficiência muito baixa para transf terminally diferenciado neurônios. Direccionamento celular específico de carga é também susceptível apenas a células que expressam os receptores da superfície celular necessários para a internalização, e embora este método pode ser altamente selectivo, que pode faltar regiosselectividade 35 segmentada. Os vetores virais de outra forma são muitas vezes difíceis e caros de produzir, exigem normas rígidas e têm na ocasião demonstrou preocupações com a segurança. Entrega biobalística, portanto, tem uma capacidade inigualável para transf regiosseletivamente neurônios e outros tipos de células dentro dos tecidos viáveis. Como o ouro é não tóxico, mais avanços no uso de biobalística poderia pavimentar o caminho para usos biomédicos, tais como a administração transdérmica farmacêutica, na entrega gene vivo não invasiva, bem como terapias genéticas não virais localizadas.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a oficina MRC-LMB para a produção do cano da arma gene reforçada. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. David R. Hampson na Universidade de Toronto para o uso de equipamentos e recursos.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |