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Neuroscience

Regioselectiva biolística Focalización en Organotípicos cerebro rebanadas Usando una pistola de genes Modificado

doi: 10.3791/52148 Published: October 24, 2014

Abstract

La transfección de ADN ha sido de gran valor para las ciencias biológicas y con los últimos avances en preparaciones de cortes de cerebro organotípicos, el efecto de varios genes heterólogos por lo tanto podría ser investigado fácilmente manteniendo muchos aspectos de la biología in vivo. Ha habido un interés creciente para transfectar neuronas terminales diferenciadas para las que los métodos de transfección convencionales han estado plagado de dificultades, tales como los bajos rendimientos y pérdidas significativas en la viabilidad. Transfección biolística puede eludir muchas de estas dificultades sin embargo, sólo recientemente se ha modificado esta técnica de modo que es susceptible para su uso en tejidos de mamíferos.

Nuevas modificaciones a la cámara de acelerador han mejorado la precisión de disparo de la pistola de genes y el aumento de sus profundidades de penetración mientras que también permite el uso de presión de gas inferior (50 psi) sin pérdida de eficiencia de la transfección así como permitir un margen regioselectiva enfocada del paARTÍCULOS para dentro de 3 mm. Además, esta técnica es sencillo y rápido de realizar que microinyecciones tediosas. Tanto expresión transitoria y estable son posibles con nanopartículas bombardeo donde la expresión episomal puede ser detectado dentro de 24 horas y la supervivencia de las células ha demostrado ser mejor que, o al menos igual a, métodos convencionales. Esta técnica tiene sin embargo una ventaja crucial: permite la transfección a ser localizados dentro de un solo radio restringido permitiendo así al usuario aislar anatómicamente efectos del gen heterólogo. Aquí presentamos un protocolo detallado para preparar adultos viable rebanadas organotípicos y someterlos a regioselectiva transfección utilizando una pistola de genes mejorada.

Introduction

Originalmente la técnica biolistic, una frase a su vez-de-para "balística biológicos", se estableció para la transferencia génica mediada por partículas en las células vegetales 1. Este método físico de la transformación celular micro o nanopartículas acelera a alta velocidad para superar las barreras físicas de las membranas impermeables a las células con el fin de entregar cargamentos tales como ADN o colorantes. Debido a que no depende de ligando de receptores específicos y / o las propiedades bioquímicas en las membranas de la superficie celular, transferencia de genes mediada por partículas se puede aplicar fácilmente a una variedad de sistemas biológicos, tales como cortes de cerebro organotípicos.

Usando rebanadas organotípicos tienen ventajas sobre otros en las plataformas in vitro ya que mantienen muchas de las propiedades anatómicas y bioquímicas que son pertinentes a la biología in vivo 2-4. Las rebanadas mayoría conservan las características arquitectónicas locales desde donde se han originado y preserve la actividad neuroquímica y la conectividad de las sinapsis. El uso de cortes de cerebro para la investigación básica, y en los esfuerzos farmacéuticos, ha aumentado de forma concomitante con el número de posibles manipulaciones biotecnológicas para medir y monitorear los comportamientos neurobiológicas del cerebro en un in vivo como contexto 3,5-7. Las principales ventajas para el uso de sistemas de ensayo a base de cortes organotípicos es que proporciona control experimental fácil y permite manipulaciones precisas de ambientes extracelulares.

Fructíferamente, sistemas de cultivo de cortes organotípicos se han establecido a partir de una variedad de regiones cerebrales, tales como, pero no limitado a, la corteza, la médula espinal y cerebelo 8-10. Además, un número de cocultivos se ha demostrado, que permiten la evaluación de la comunicación intercelular entre las regiones cerebrales distales así como entre las neuronas y las células patológicas 11,12. Muchos protocolos ya han sido establecidos para successfully rebanadas cultura organotípicos y puede mantener la viabilidad a largo plazo y muchos estudios recientes ahora utilizan los métodos de interfaz de membrana y varias modificaciones a la misma 13. Este principio mantiene las rebanadas organotípicos en la interfaz entre el medio y la atmósfera humidificada de la incubadora colocando las rodajas en un filtro de membrana porosa. El medio puede así proporcionar suficientes nutrientes para alimentar a las rebanadas organotípicos mediante movimiento capilar. Típicamente rebanadas se han preparado a partir de animales postnatales tempranos (3 - 9 días de edad; P3 - 9). Sin embargo, los tejidos del cerebro de estas rebanadas mostrar un alto nivel de plasticidad celular y tienen una resistencia inherente a los esfuerzos mecánicos, que es útil para obtener cultivos viables, sin embargo, las sinapsis maduras y circuitos neuroanatómico no se han desarrollado completamente in vivo hasta 2 a 3 semanas de edad 14. Por ejemplo, las observaciones anteriores habían demostrado que los cortes de hipocampo obtenidas de P0 - 1 neonatos, aunque muy viable siguiente preparación, perdiendo algunas características morfológicas. Esencialmente, ellos demostraron ser inadecuados para cultivos a largo plazo sugieren células inmaduras fueron más propensos a des-diferenciar en comparación con cultivos organotípicos de animales mayores 15,16. Por esta razón, nuestro método ha sido optimizado para los cortes de cerebro organotípicos adultos en la que la maduración y el desarrollo arquitectónico han llegado a sus etapas terminales 13,17-21. Sin embargo, este método también es adecuado para el recién nacido y rebanadas organotípicos juveniles.

Una vez que se han producido las rebanadas organotípicos viables toda la placa que contiene las rebanadas puede ser llevado al monte biolistic y sometido a regioselectiva entrega y transfección. El montaje correcto de la pistola de genes (como se describe en la Figura 1), orientado 90 ° a una distancia de 10 mm directamente sobre las rebanadas (desde la abertura en el tejido), permite el rápido suministro biolístico de los 40 nm irld partículas recubierto cargas. Estas cargas tales como tintes y vectores de ADN fluorescentes, así como cualquier gen de interés, se entregan fácilmente en las rodajas viables con facilidad. Así pues, este método describe el protocolo necesario para ofrecer, de una manera regioselectiva, carga recubierto las nanopartículas de oro en cortes de cerebro organotípicos viables. El cañón de la pistola de genes y montaje óptimo se puede ver en la Figura 1. Para más información sobre las mejores balística barril y nanopartículas, por favor ver O'Brien, et al., 17.

Refinamientos posteriores también están indicados para el usuario para optimizar las condiciones tales como la cantidad apropiada de oro entregado por área objetivo, definida como microportadores Cantidad de carga (MLQ), y para determinar la cantidad de ADN cargado por mg de oro, definido como de relación de ADN Cargando (DLR). Antes de la precipitación de ADN en partículas de oro y cargarlos en el tubo Tefzel que comprende cartuchos de la pistola de genes real '9 ;, es necesario para calcular la cantidad de ADN y el oro requerida para cada transfección que puede diferir ligeramente entre los tejidos y las condiciones (relación debe mantenerse entre 1 mg de oro y 1 g de ADN a 1: 5). Es vital para preparar la proporción adecuada de MLQ a DLR en contrario partículas de oro recubiertas de ADN podrían adherirse entre sí formando más grande que la aglomeración se esperaba, lo que podría reducir la homogeneidad global de la propagación biolistic así como daños incremento del tejido y la citotoxicidad.

Este método muestra las recientes mejoras en el suministro biolístico, que han sido probados y decididos a ser susceptibles de cortes de cerebro organotípicos neonatales, juveniles y adultos. Además, mediante la explotación de propagación reducida biolístico el gen arma de barril, el usuario es ahora capaz de transfectar de forma selectiva una región puntual en el cerebro. Tras el tiempo de incubación apropiado, la expresión de las proteínas fluorescentes, que alcanza sus tasas máximas entre 24 y 48hr, se puede visualizar mediante epifluorescencia y microscopía confocal. Estos fluoróforos permiten el análisis morfológico y la localización de las células individuales dentro de las estructuras biológicamente relevantes. Sin embargo, la modulación regioselectiva de las rebanadas organotípicos por otros genes heterólogos también puede ser controlado por cualquier otra prueba susceptibles de estas preparaciones. Posibles estrategias de trabajo para la entrega de genes localizados se presentan en la Figura 2.

Protocol

El uso de animales y tejidos animales deben adherirse estrictamente a la aprobación del comité ético bajo las reglas y regulaciones locales. Todos los tejidos obtenidos durante este estudio adhirieron a la experimentación animal, el MRC-LMB.

1 Preparación de Materiales y Medios de Cultivo

  1. Preparar todas las soluciones con agua Millipore; utilizar únicamente reactivos de grado analítico. Preparar y almacenar todos los reactivos a temperatura ambiente (a menos que se indique lo contrario).
  2. Hacer 500 ml de solución salina tamponada con HEPES (HEPES 10 mM, NaCl 120 mM pH 7,2). Filtrar a través de una unidad de filtro estéril de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C.
  3. Hacer 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4). Esterilizar en autoclave.
  4. Preparar medio neuronal completándolo DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) con 25 mM HEPES, 10% de suero de ternera fetal, glucosa 30 mM, 1: 100 N2 dopplement, penicilina-estreptomicina 1.100 U / ml; pH 7,2. Filtro con una unidad de filtro estéril de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C.
  5. Hacer disolución de polivinilpirrolidona (PVP) stock con 20 mg de PVP en 1 ml de etanol al 100%. Alícuota de esto en 1 ml cantidades, congelación y almacenar a -20 ° C. Solución de trabajo es de 0,05 mg / ml, por lo tanto, añadir 10 l de solución de PVP de stock para cada 4 ml de etanol al 100%.
  6. Preparar una solución madre 0,05 M espermidina en agua Millipore; ajustar el pH a 7,2.
  7. Hacer una solución de agarosa al 2% en DMEM (2 g de agarosa de grado electroforesis en 100 ml de DMEM en una botella de tapón de rosca esterilizada). Microondas esto hasta que la agarosa se haya disuelto. Guarde en la nevera 4 ° C durante varias semanas, si es necesario.

2 Preparación de Organotípicos rebanadas

  1. La eutanasia a C57 Negro 6 ratones de la edad deseada por asfixia de CO 2 seguido por decapitación. Retire el cerebro usando recortes laterales del cráneo a partir de la foramen magnum y terminando enlos lóbulos olfativos. Levante suavemente el cráneo de la parte posterior para exponer el cerebro.
  2. Cortar entre los lóbulos olfativos y la corteza frontal, y a rostral del cerebelo. Levante ligeramente la parte rostral del cerebro y cortar los nervios ópticos. Por último, retire el cerebro y lo coloca en una placa de Petri llena con solución salina tamponada con HEPES frío de hielo en hielo.
  3. El uso de un microscopio de disección, retire la pia utilizando unas pinzas finas; retirar con cuidado los vasos sanguíneos y meninges alrededor del cerebro.
  4. Coloque el cerebro fresco en un molde receptor pequeño y cubra con la solución de agarosa enfriado ligeramente por encima de RT. Luego enfriar rápidamente el molde a 4 ° C colocándola en hielo.
    NOTA: Procesar las rebanadas lo más rápidamente posible para evitar la pérdida de viabilidad.
  5. Cuando la agarosa se ha fijado (5 - 10 min), retire el cerebro agarosa embebidos del molde (recortar si es necesario) y, a continuación, péguelo en la plataforma vibroslicer. Coloque esto en una cámara vibroslicer contiene hielo estéril PBS frío. Disinfect la cámara de vibroslicer antes de ser utilizado con etanol al 70% para reducir al mínimo las contaminaciones posteriores.
  6. Cortar el cerebro usando un vibroslicer hecha a la medida o su equivalente comercial. El concepto de modelo era diseñar una máquina de cortar el tejido que podría generar movimientos de gran amplitud y alta frecuencia horizontal hasta el borde de la cuchilla y reducir al mínimo las vibraciones verticales.
  7. Usa la frecuencia de oscilación de 90 Hz, a una amplitud de 1,5 - 2,0 mm, y la cuchilla de corte situado en un ángulo de 15 ° con el plano horizontal; establecer el bloque de montaje sosteniendo el cerebro de agarosa embebidos para mover a 1,7 mm / min hacia la cuchilla. Recoger secciones (150 micras) en una cámara que contiene un medio de cultivo frío en hielo (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Ver corte y manipulación de las rodajas de tejido como un video complementario en Arsenault y O'Brien 13.
  8. Con suavidad, coloque las rebanadas en insertos de cultivo celular (0,4 m, diámetro 30 mm) en una bandeja de 6 pocillos múltiples con las med culturaia en el exterior de la pieza de inserción, y se incuban en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2.
    NOTA: Para la viabilidad del tejido adecuado, ser muy suave, mientras que la transferencia y la manipulación de las rebanadas. También, demasiado líquido evitará que las rebanadas organotípicos se adhiera a la membrana del inserto de filtro. Si esto ocurre, retire el exceso de líquido o placa de nuevo.
  9. Aunque rebanadas organotípicos pueden ser cultivadas durante un par de semanas, procederá a la transfección no más de 4 días después de la siembra para obtener los mejores rendimientos de transfección.
    NOTA: Para evitar el crecimiento excesivo de la glía en condiciones de cultivo a largo plazo, el uso AraC o medio libre de suero 2.

3 Preparación de ADN recubierto Micro & Nano-proyectiles

  1. Preparar nano-proyectiles que utilizan partículas de oro de 40 nm de diámetro. Brevemente, se añaden 50 l de 0,05 M espermidina y 10 l de ADN en 1 mg / ml (pEYFP-N1) a 10 mg de partículas de oro.
    1. Añadir calcio y espermidina en la mezcla de solucióntura durante ADN micro-partículas de oro preparación con el fin de ayudar en la unión de moléculas de ADN a las nanopartículas de oro.
      NOTA: La cantidad de ADN utilizado por mg de portadores de oro (DLR), debe oscilar entre 1 y 5 g de ADN por 1 mg de oro. Además, la cantidad de partículas de soporte de oro que se rodará por cartucho (MLQ), debe sí variar de 0,1 a 0,5 mg de oro. El DLR y MLQ deben ser juzgados y optimizados para cada usuario dependiendo del sistema particular bajo investigación, así como el tipo de cañón de partículas y el gen utilizado.
  2. Mezclar utilizando un vórtice mientras que lentamente la adición de 50 l de 1 M de CaCl2 en fracciones de 10 - 15 l. Después de 5 min de agitación con vórtex ocasional, centrifugar a 1000 xg durante 30 segundos y luego eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de partículas de oro en 3,5 ml de 0,075 M PVP.
  3. Dibuje esta suspensión en un tubo (diámetro 2,36 mm interna) usando una jeringa. Colocar el tubo en la estación de preparación de tubos. Permitir elpartículas de oro se asienten y eliminar el sobrenadante por aspiración con una jeringa. Gire el tubo para repartir uniformemente las partículas de oro, que posteriormente fueron secados bajo un flujo constante de nitrógeno a 5 litros por min.
  4. Para crear ADN-balas, cortar el tubo con un cortador de tubo en longitudes de 1 cm. Cualquiera de insertar inmediatamente en el cartucho de pistola de genes o mantener desecado (4 ° C) hasta que se requiera.

4. biolística transfección en Organotípicos rebanadas

  1. Lleve a cabo los siguientes pasos dentro de una campana de flujo laminar estéril.
  2. Inserte una batería de 9 V y un soporte de cartucho vacío en la pistola de genes Helios.
  3. Coloque la pistola de genes para el tanque de helio con la manguera de helio. Fuego 2 - 3 espacios en blanco (ranuras vacías) a 50 psi para presurizar la manguera de helio y los depósitos en la pistola.
  4. Cargar los cartuchos que contienen el oro recubiertas de ADN en los soportes de los cartuchos y cargar el soporte en la pistola de genes.
  5. Desatornille el gen arma espaciador y adjuntarel cañón del arma gen modificado a la pistola de genes.
  6. Usando una pinza estéril, coloque un inserto de filtro que contiene la rebanada organotípico en un plato de plástico estéril.
  7. Retire el medio de rebanadas organotípicos.
  8. Ajuste la presión del gas a 50 psi.
    NOTA: La protección ocular es esencial y protección para los oídos aconsejable.
  9. Coloque la pistola de genes a las distancias apropiadas utilizando el montaje medido a 10 mm. Apuntar con cuidado el centro de la barril en la región deseada para la entrega genética.
  10. Después de la cocción, vuelva a colocar los insertos de nuevo en su plato con medio fresco y devolverlos a las condiciones de crecimiento normales, es decir, 37 ° C con 5% de CO 2 incubadora.
  11. Una vez terminado, cierre el tanque de helio, liberar la presión de la pistola de genes y separar la pistola de genes desde el tanque de helio.
  12. Retire el soporte del cartucho y deseche los cartuchos y limpiar la pistola de genes.
  13. Compruebe el tejido de la morfología y de la penetración exitosa de visualizing las rodajas usando un microscopio invertido. Si el uso de micropartículas, de manera uniforme dispersar el oro; no debe haber áreas densas de partículas de oro se ven en la división. Las nanopartículas debido a su pequeño tamaño no pueden ser vistos como unidades individuales por técnicas de microscopía convencionales.
  14. Después de que el intervalo de tiempo apropiado (normalmente 1 - 2 días), fijar las rebanadas en el 4% de paraformaldehído (PFA) para la observación de la microscopía.
    NOTA: La fijación de PFA no siempre se desea. Para imágenes de células vivas evitar este paso.

5. Fijación y Visualización de cerebro rebanadas

  1. Después de la transfección biolística, lavar rodajas dos veces en PBS durante 2 min.
  2. Fijar rebanadas incubando en recién hecho, hielo frío PFA al 4% en PBS durante 20 min.
  3. Lavar rodajas dos veces en PBS durante 2 min.
  4. Cortar suavemente alrededor de la membrana admite el uso de un bisturí, sin perturbar las rodajas montados en ellos. El uso de fórceps para colocar cada membrana de soporte / rebanada en un portaobjetos de microscopio. Descanse el organotyprebanadas ic en la parte superior de la membrana en el portaobjetos de vidrio.
  5. Añadir una gota de medio de montaje en la parte superior de la rodaja y añadir un cubreobjetos suavemente sin ninguna fuerza directamente en contacto con la rebanada organotípicos.
  6. Asegure el cubreobjetos con una fina capa de barniz de uñas.
  7. Ver las rebanadas en un microscopio adecuado.

6. Aplicaciones Confocal

  1. Visualizar las rodajas mediante el uso de un microscopio confocal láser de barrido vertical con una 60X / 1,4 apertura numérica (NA) de inmersión en aceite de lente de objetivo.
    NOTA: La característica más problemática del microscopio confocal es el tamaño del agujero de alfiler (puesta a 1 UA), que es capaz de aislar y recoger un plano de enfoque, eliminando así el fuera de foco 'bruma' se ve normalmente con una muestra fluorescente. Los detalles finos a menudo son oscurecidas por esta bruma y no pueden ser detectados en un microscopio nonconfocal.
  2. Ajuste el láser de argón a una longitud de onda de excitación de 488 nm y optimizar para la recogida de emitted luz en la banda de entre 500 y 520 nm. Típicamente, recoger imágenes a 1024 x 1024 píxeles y con las pilas de z secciones a intervalos de 0,5 m para abarcar la anchura completa de cada célula nerviosa que se analizó.
    1. Para observar la morfología del núcleo, contador mancha estas células con DAPI (longitud de onda de excitación fijado en 405 nm y de emisión de luz recogida entre 420-4 40 nm). Por último, para el examen de fluorescencia roja, ajuste el láser a 561 nm para la excitación y 565-620 nm para la emisión.
  3. Por lo general, la obtención de imágenes mediante el uso de un zoom 4X exploración que cubrió un área de 57,6 m 2; tamaños de las imágenes estaban en la región de 1.024 x 1.024 píxeles. Record pilas de z secciones en intervalos de 0,5 micras y proyecciones de 5-8 cuadros combinados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Helios gene gun system Bio Rad 165-2431 Gene gun and tube prep station
HEPES  Sigma 83264-100ML-F
NaCl Sigma S7653-250G
KCl Sigma P9333-500G
Na2HPO4 Sigma S7907-100G
KH2PO4 Sigma P9791-100G
0.2 µm sterile filter unit Millipore SCGPU05RE to filter media
DMEM Gibco 21885-025
Fetal calf serum Gibco 10270-098
D-Glucose Sigma G8270-100G
N2 Life Technologies 17502-048
Penicillin/Streptomycin Sigma p4333
Polyvinylpyrrolidone Sigma 856568-100G
Ethanol  Sigma 277649-100ML
Spermidine Sigma S2626
Agarose Bio Rad 161-3100EDU
Vibroslicer Laica VT1200 We used a custom design
Gene gun mount Built in house at U of T
Humidified cell culture incubator
Gold nanoparticles cytodiagnostics G-40-20
pEYFP-N1 Clontech
Tubing cutter Bio Rad 165-2422
Tefzel tubing Bio Rad 165-2441
Barrel Custom made by the LMB
Cell culture insert Millipore PICM0RG50
Paraformaldehyde Sigma 76240 Fluka
Dissecting microscope for convenience
Confocal microscope user defined for usage
Glass slide VWR 2588-CA48323-185
Microcover glass VWR 2448-CA48366-067-1
Vectashield mounting media Vector laboratories H-1400  

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References

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Arsenault, J., Nagy, A., Henderson, J. T., O'Brien, J. A. Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun. J. Vis. Exp. (92), e52148, doi:10.3791/52148 (2014).More

Arsenault, J., Nagy, A., Henderson, J. T., O'Brien, J. A. Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun. J. Vis. Exp. (92), e52148, doi:10.3791/52148 (2014).

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