Introduction
Da Next-Generation Sequencing (NGS) teknologier er blevet udbredt og mere tilgængeligt, den primære metode til genom-dækkende kortlægning af protein-DNA interaktioner nu kromatin immunpræcipitation efterfulgt af NGS detektion (chip-seq), som gør det muligt opdagelsen af transskription faktor bindingssteder eller mønstre af histon modifikationer. Chip seq er fordelagtig i at yde højt gennemløb data for hele genomet, som kan anvendes til kvantitativ og kvalitativ analyse af protein-DNA-interaktioner ved måling af de berigede DNA-fragmenter. Men der er nogle ulemper i standard chip-seq eksperimenter såsom vanskelighederne med at få nok materiale til at skabe en sekventering bibliotek.
CHIP eksperimenter er opdelt i seks grundlæggende trin, herunder 1) tværbinding protein-DNA-bindende regioner 2) prøveforberedelse, som omfatter cellelysering og klipning chromatinet ved lydbehandling, 3) dannelse af immunkomplekser,4) udfældning af immunkomplekserne, 5) vask af immunkomplekser, og 6) eluering af det berigede materiale og analyse ved qPCR og NGS.
Succesen med en chip assay er afhængig af tre hovedfaktorer: en god kromatin forberedelse, mængden af antigen i den oprindelige prøve, og specificitet og affinitet af antistoffet til dets beslægtede antigen. En væsentlig begrænsning er kravet om høje mængder af udgangsmateriale celleantal for at opnå tilstrækkelig beriget DNA til at skabe en sekventering bibliotek. For forskere, der arbejder med begrænsede prøve beløb, eksempelvis biopsiprøver eller celle subpopulationer, chip-seq eksperimenter er meget udfordrende. Nylige undersøgelser har vist, at chip-seq assays kan udføres, når der arbejdes med en lav mængde af celler 1, 2. Diagenode har udviklet en robot væskehåndtering, der fuldt ud kan automatisere chip seq eksperimenter når der startes med et begrænset antal celler.
Automation givermange fordele i forhold manuel tilberedning af chip-seq prøver da den falder menneskelige fejl, reducerer variation, og reducerer eksperimentel omkostninger. Halvautomatisk protokoller for chromatin immunopræcipitation og forberedelse bibliotek er blevet rapporteret, men ingen af disse undersøgelser har vist data, når anvendelse af lave celleantal 3, 4, 5, 6.
I dette papir en komplet automatiseret workflow er beskrevet for både kromatin immunfældningsforsøg og forberedelse bibliotek analyser i en robot væske håndtering system, der bruger magnetisk perle-baseret teknologi, og som kan tage fat på flere parametre i protokol optimering. Her blev automatiserede chip-seq eksperimenter med succes udført på et begrænset antal celler med det formål at forenkle, standardisere og giver en pålidelig løsning til at studere epigenetiske profiler i små cellepopulationer. Den automatiserede chip protokollen beskrevet i dette papir er optimeret på HeLa-celler ved hjælp af specifikke histon antistoffer og reagenser but arbejdsgangen kan tilpasses til andre cellelinier og antistoffer med tilsvarende eksperimentel optimering.
Protocol
1. Standard CHIP Eksperimenter
- Celleudtagningsmetoden og DNA-protein-tværbinding.
- Grow HeLa-S3-celler til en konfluens på 80% -90%. Fjern kulturmediet, vaskes skålen to gange med 10 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS), og tilføj Trypsin-EDTA (1x) til dyrket plade. Der inkuberes i højst 2 minutter at løsne cellerne fra skålen. Saml celler og vaskes to gange med 10 ml PBS.
BEMÆRK: Længere inkubationstider vil føre til celleskader. - Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 500 xg og resuspender cellerne i 20 ml PBS. Fortsæt at tælle cellerne.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 500 xg, supernatanten fjernes, og der tilsættes 500 pi PBS. Det optimale antal celler til fiksering trin er 10 millioner celler pr 500 pi PBS.
- Tilføj 13,5 pi frisk 37% formaldehyd i hver alikvot på 500 pi af cellesuspension. Fiksere cellerne i 8 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj 57 pi 1,25 M glycin solution at stoppe optagelsen. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur med konstant blanding ved forsigtig vortex. Arbejdet på is fra dette punkt og fremefter.
- Centrifugeres cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 ° C og supernatanten fjernes uden at forstyrre cellepelleten.
- Vask cellerne to gange med 1 ml PBS. Kassér forsigtigt supernatanten og holde cellepelleten på is.
- Grow HeLa-S3-celler til en konfluens på 80% -90%. Fjern kulturmediet, vaskes skålen to gange med 10 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS), og tilføj Trypsin-EDTA (1x) til dyrket plade. Der inkuberes i højst 2 minutter at løsne cellerne fra skålen. Saml celler og vaskes to gange med 10 ml PBS.
- Cellelyse og chromatin klipning
- Tilsæt 10 ml iskold lysepuffer IL1 til cellepelleten (1 ml lysisbuffer pr 1 million celler er det optimale forhold). Pipette op og ned flere gange og inkuberes i 10 minutter ved 4 ° C med forsigtig blanding.
- Centrifuger lysatet i 5 minutter ved 500 xg og 4 ° C. Supernatanten fjernes.
- Der tilsættes 10 ml iskold lyseringspuffer IL2 til lysaterne og bland forsigtigt ved pipettering op og ned. Inkubér lysaterne i 10 minutter ved 4 ° C.
- Centrifugeres i 5 minutter ved 500 xg og 4 ° C og supernatanten fjernes.
- Prepare den komplette forskydning buffer tilsætte 200x protease inhibitor cocktail (PIC) til IS1 klipning buffer. Hold buffer på is i 5 minutter og arbejde på is bagefter. Tilsæt 1 ml af det komplette IS1 klipning buffer til hver 10 millioner celler pellet og bland forsigtigt ved pipettering op og ned. Før sonikering inkubere prøverne på is i 10 min for at reducere viskositeten af prøven.
- Shear 300 pi alikvoter af kromatin ved sonikering under anvendelse af et vandbad-sonikator i 2 til 3 sæt af 10 cyklusser hver. En cyklus består af 30 sek "ON" og 30 sek "OFF" på en høj effektindstilling. Alternativt kan du bruge en pico-lydbehandling enhed med en kortere sonication tid med 5 til 10 cykler af 30 sek "ON", 30 sek "OFF". Kort vortex og spin rørene mellem kørsler. Ved brug af andre typer af sonikatorer Følg tilsvarende producentens anvisninger for kromatin klipning.
- Centrifugeres den forskudte kromatin ved 16.000 xg i 10 min og Collect supernatanten til straks anvendes i IP trin. Alternativt opbevares chromatin ved -80 ° C i op til 2 måneder til fremtidig brug.
- Analyser chromatin klipning effektivitet før immunfældning trin ved hjælp af 1-1,5% TAE agarosegeler eller bionalyzer. Optimale chromatin fragmentstørrelser området mellem 100-600 bp.
2. Lav Cell chip Eksperimenter
- Celleudtagningsmetoden og DNA-protein-tværbinding
- Grow HeLa-S3-celler til en konfluens på 80% -90%. Fjern kulturmediet, vaskes skålen to gange med 10 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS), og tilføj 1x trypsin-EDTA til den dyrkede plade. Der inkuberes i højst 2 minutter at løsne cellerne fra skålen.
BEMÆRK: Længere inkubationstider vil føre til celleskader. - Saml celler ved tilsætning af 1 ml dyrkningsmedium indeholdende serum i en 1 ml centrifugerør. Tæl cellerne.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 500 x g. Bring celleantallettil 10.000 celler pr ml dyrkningsmedium til fiksering.
- Tilføj 27 pi 36,5% frisk tilberedt formaldehyd i hvert rør til fiksering. Vend røret to eller tre gange og inkuberes 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj 115 pi 1,25 M glycin-opløsning til prøven vendes røret to eller tre gange og inkuberes 5 minutter ved stuetemperatur. Arbejdet på is fra dette punkt og fremefter.
- Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten langsomt.
- Vask cellerne med 1 ml iskold HBSS med PIC (200x, slutkoncentration 1x). Vend røret to eller tre gange for at resuspendere cellerne og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Kassér forsigtigt supernatanten og holde cellepelleten på is.
- Grow HeLa-S3-celler til en konfluens på 80% -90%. Fjern kulturmediet, vaskes skålen to gange med 10 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS), og tilføj 1x trypsin-EDTA til den dyrkede plade. Der inkuberes i højst 2 minutter at løsne cellerne fra skålen.
- Cellelyse og chromatin klipning
- 25 pi af komplet Lysis Buffer TL1 (Lysis Buffer TL1 + PIC) pr 10.000 celler og omrør manuelt bunden af røret for at resuspendere cellerne. Inkuber på is i 5 min.
- Tilføj 75 pi komplet HBSS (HBSS + PIC) buffer i hver alikvot indeholdende 10.000 celler.
- Shear 100 ul aliquoter på 10.000 celler ved sonikering i 5 sæt af 5 cyklus hver. En cyklus består af 30 sek "ON" og 30 sek "OFF" på høj effekt indstilling. Alternativt kan du bruge en pico-lydbehandling enhed, der bruges med en kortere sonikering på 5 cykler af 30 sek "ON", 30 sek "OFF". Optimale chromatin fragmentstørrelser området mellem 100-600 bp. Bemærk, at chromatin præparater, celletyper og forskellige sonikatorer kræver separate klipning optimering eksperimenter.
- Centrifuger klippet kromatin ved 14.000 xg i 10 min for at skille sig af med det uopløselige materiale og indsamle supernatanten til straks anvendes i IP trin. Alternativt opbevares chromatin ved -80 ° C i op til 2 måneder til fremtidig brug.
- Analyser chromatin klipning effektivitet før immunfældning trin ved hjælp af 1-1,5% TAE agarosegeler ellerden bionalyzer. Treat prøver med RNase før agarosegelanalyse for at forbedre den visuelle vurdering af klipning. Optimale chromatin fragmentstørrelser området mellem 100-600 bp.
3. Chromatin Immunfældning og Bibliotek Prep
- For standard automatiseret CHIP eksperimenter
- Tilføj 120 pi Chip Buffer H (chip Buffer H + PIC) til 100 pi klippet kromatin. Brug 200 pi for UP og holde 2 pi til 20 pi som input prøve.
- Vælg den automatiske chip 200 pi protokol i automatisering instrument. Den gennemløb af protokollen er 1 til 16 prøver pr løb.
- Kør en automatiseret chip eksperiment bruger, kromatin svarende til 1-2 millioner celler, 1-2 ug af anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 og H3K9me3 chip seq klasse kanin polyklonale antistoffer. Optimale antistof mængder varierer afhængigt af histon modifikation og affinitet og specificity af det tilsvarende antistof.
- Brug lige store mængder af ikke-immunt kanin-IgG som en isotype kontrol-antistof. Alternativt kan du bruge ikke-coatede perler eller specifikt blokeret antistof som CHIP kontroller. Der tilsættes 20 pi protein A-overtrukne magnetiske perler for hver reaktion.
- Brug automatiske histon chip-seq kitreagenser til at udføre automatiserede chip eksperimenter med anti-H3K79me3 og -H3K4me2 polyklonale antistoffer. Brug den ideelle chip-seq kitreagenser til at udføre chip eksperimenter med anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 og -H3K9me3.
- Vælg den automatiske chip-protokollen efter softwareinstruktionerne gennemført i automatisering enhed. Indstil chippen eksperimentelle parametre til 4 timer for antistoffet coating trin og 15 timer for immunfældning trin. Det omvendte tværbindingstrinnet foregår i den automatiserede instrument ved 65 ° C i 4 timer.
- Oprens den omvendte tværbundet DNA på det automatiserede system. Vælg automated protokoller for DNA oprensning med en protokol eller kit ved hjælp af magnetisk perle baseret DNA oprensning. Elueres DNA'et i 25 pi vand.
- Kvantificere immunpræcipiteret DNA ved ekstraktion 10% af immunopræcipiteret DNA. Den immunpræcipiteret DNA udbytte afhænger af kvaliteten af chromatin og antistof, celletype og målet histon modifikation. Kvantificer DNA under anvendelse af et assay kit ifølge producentens anvisninger.
- Analyser af kvaliteten af immunopræcipiteret DNA ved kvantitativ PCR under anvendelse af primere til mindst 1 positive og 1 negativ kontrol genomiske regioner. Brug ikke mere end 10% af den samlede immunopræcipiterede DNA til vurdering CHIP berigelser.
- Forbered qPCR reaktioner. Tilføj 10 pi af en 2x SyberGreen qPCR Master Mix, 1 pi primerblanding, 1-5 pi immunopræcipiteret eller input DNA og sterilt vand op til 20 pi endelige reaktion volumen. QPCR Programmet omfatter et indledende denatureringstrin ved 95 ° Ci 5-10 min afhængig af udbyderen af Taq-polymerase og udglødningstemperaturer bør fastsættes i henhold til de valgte primere.
- Brug automatiseret bibliotek prep protokoller er kompatible med de kommercielt tilgængelige Illumina chip Seq forberedelse bibliotek reagenser til at bygge bibliotekerne ved hjælp af både chip DNA samt den gemte input DNA fra samme kromatin præparatet. Brug 10-20 ng immunopræcipiteret DNA fra hvert antistof for bibliotek forberedelse. Forbered op til 16 automatiserede biblioteker pr løb.
- Sekventere bibliotekerne og generere klynger efter Illumina producentens anvisninger. Udføre primær bioinformatik analyse (klynge filtrering, basen ringer, etc.) efter den standard Illumina rørledningen, filter og tilpasse læser til den seneste humane genom samling (nuværende version er GRCh38) med eland aligner. Brug SICER 7 eller MACS 8 for peak opkald og udfører downstream analyser af toppe wed Homer 9, BEDTools 10 eller foretrukne software.
- For lav celletal automatiseret CHIP eksperimenter
- Tilføj 120 pi komplet chip buffer TC1 (chip Buffer TC1 + PIC) til 100 pi klippet kromatin. Brug 200 pi for UP og holde 20 pi som input.
- Vælg automatiseret chip 200 pi protokol i automation system. Den gennemløb af protokollen er 1 til 16 prøver pr løb.
- Kør en automatiseret chip seq eksperiment hjælp af automatiserede chip reagenser og chip klasse antistoffer optimeret til at virke på lave kromatin mængder. Brug kromatin svarende til 10.000 celler og 100.000 celler, 0,5 ug af anti-H3K27me3, 0,25 ug -H3K4me3, 0,1 ug -H3K27ac, 0,25 ug -H3K9me3 kanin Premium chip-seq kvalitet kanin polyklonale antistoffer. Optimale antistof mængder varierer afhængigt af histon modifikation og affinitet og specificitet af det tilsvarende antistof.
- Brug samme mængde ikke-immun rabbit IgG som en isotype kontrol-antistof. Alternativt kan du bruge ikke-coatede perler eller specifikt blokeret antistof som CHIP kontroller. Tilsæt 10 pi protein A-overtrukne magnetiske perler for hver reaktion.
- Vælg den automatiske chip-protokollen efter softwareinstruktionerne gennemført i automatisering enhed. Indstil chippen eksperimentelle parametre til 4 timer for antistoffet coating trin og 15 timer for immunfældning trin. Det omvendte tværbindingstrinnet foregår i den automatiserede instrument ved 65 ° C i 4 timer.
- Rens omvendt tværbundet DNA ved hjælp af spin-søjler efter producentens anvisninger og elueres i mængder fra 6 pi til 25 pi vand.
- Kvantificer DNA under anvendelse af et kommercielt assay kit. Analysere resultaterne af qPCR anvendelse af primere for positive og negative kontrolregioner at evaluere chippen kvalitet.
- Brug et bibliotek kit forberedelse med optimeret bibliotek forberedelse reagenser til fremstilling biblioteker med lav DNA quanmængder. Brug 30 pg og 300 pg Chip DNA (svarende til 10.000 og 100.000 celler eksperimenter henholdsvis) til biblioteket forberedelse. Forbered biblioteker ved den automatiserede protokol forenelig med bibliotek forberedelse reagenser. Den automatiserede bibliotek prep gennemløb er 1 til 48 biblioteker pr løb.
- Efter afslutningen reparation af dobbeltstrengede DNA-templates, ligere de spaltelige hårnåle-adaptere indeholdende sekvenseringsprimeren sites. Efter DNA udvidelse trin forstærke prøven med den beskrevet i biblioteket forberedelse kit protokol high fidelity amplifikationsmetode.
- Efter bibliotek forstærkning, kvantificere og oprense bibliotekerne efter forberedelse kit retningslinjer biblioteket. Bemærk, at udvælgelsen størrelse efter oprensning ikke nødvendig.
- Sekventere biblioteker og generere klynger i overensstemmelse med producentens anvisninger. Udføre primær bioinformatik analyse (klynge filtrering, basen ringer, etc.) efter standenard producent pipeline, filter, og tilpasse læser til den seneste humane genom samling (nuværende version er GRCh38) med eland 7 aligner. Brug SICER 8 eller MACS 9 for peak opkald og udfører downstream analyser af toppe med Homer, BEDTools 10, eller enhver foretrukne software.
Figur 1. Screenshots af softwaren, der viser, hvordan du opsætter automatiserede chip eksperimenter i IP-Star Compact. Softwaren giver mulighed for at vælge den mængde prøver pr sigt samt at ændre vigtige eksperimentelle parametre (Antibody Coating, IP og vasker ) i henhold til forskerens behov. Den automatiserede procedure tillader teste forskellige forhold i parallel (dvs. forskellige typer og mængder af antistoffer, forskellige typer og mængder af celler og endda forskellige types og mængder af magnetiske kugler i samme løb. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Skærmbilleder af softwaren, der viser, hvordan du opsætter automatiseret forberedelse bibliotek til næste generation sekventering ved hjælp af kit biblioteket i automatiseringssystemet. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Representative Results
Optimering automatiserede chip-seq eksperimenter i otte forskellige histon markører
For at kunne udvikle og validere de automatiske chip-protokoller, chip-seq kvalitet antistoffer, der tidligere blev valideret i manuelle chip-Seq eksperimenter (data ikke vist) blev udvalgt. Følgende chip-seq kvalitet antistoffer blev valgt til denne undersøgelse: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 og -H3K9me3. Specificiteten af alle chip seq karakteren antistoffer er tidligere blevet bekræftet ved dot blot, peptid arrays og Western blot eksperimenter (data ikke vist). Pilot chip qPCR forsøg med stigende antistof beløb blev udført for at bestemme følsomheden af antistoffer (figur 3). qPCR med mindst to positive og to negative mål kontrol blev analyseret og profiler med berigelser af positiv end negativ mål højere end femdoblet er kvalificeret til sekventering exper iments. Det er vigtigt at udføre chip og chip-seq eksperimenter med en høj kvalitet af klippet kromatin. Alle CHIP eksperimenter vist i denne publikation blev udført ved hjælp af friske kromatin. Det er også muligt at fryse de fikserede celler ved -80 ° C, og fortsætte med kromatin forberedelse og forskydning på en anden dag. Imidlertid chromatin fremstillet ud fra frosne fikserede celler kan opføre sig anderledes end kromatin frisklavet og kan derfor skal optimeres for hver chromatin forberedelse sonikering betingelser. Når man arbejder med forskellige celletyper, kan anvendes forskydningskræfter buffere med forskellige detergentsammensætninger (SDS). Celletyper, som primære cellelinier eller celler dyrket i suspension er vanskelige celler at forskyde og vil kræve høje SDS-koncentrationer (1%), mens cellelinier, der er let at forskyde såsom HeLa vil kræve lave SDS-koncentrationer (0,1%) i klipning buffere.
res.jpg "/>
Figur 3. Validering chip-grade-antistoffer ved hjælp af automation system. Chippen blev udført med anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 og -H3K9me3 kanin polyklonale antistoffer på klippet kromatin fra 1 million HeLa-S3-celler afhængig af histon ændringer. Automatiserede CHIP protokoller med arbejder volumener 200 pi blev anvendt i automatisering instrument for antistoftitrering eksperimenter. Antistof mængder på 1, 2, 5 og 10 ug blev testet per chip eksperiment og 2 ug IgG blev anvendt som negativ kontrol i hvert forsøg. Berigelser blev vurderet af qPCR. Resultaterne er vist i% af input (den relative mængde af immunopræcipiteret DNA i forhold til input DNA efter qPCR analyse). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Efter validering og fastlæggelse optima l mængder chip-grade antistoffer, der skal anvendes i automatiseringssystemet blev automatiserede chip seq eksperimenter udført for at generere sekventering profiler for hver histon modifikation (figur 4).
Figur 4. Histondeacetylase chip-seq profiler genereret af automatiserede chip-seq eksperimenter. Figuren viser chippen-seq profiler i forskellige genomiske regioner for H3K4me3, H3K9ac og H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3, og H3K36me3. 4A viser peak fordelingen langs komplette X -chromosome og 4B fordelingen i en 75 kb region omkring GAPDH-genet. 4C viser profiler H3K27me3, H3K36me3 og H3K4me3 i en 500 kb region, der omgiver MYT1 genet og 4D viser fordelingen af H3K9me3 i en 200 kb region omkring ZNF12.large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Histon epigenetiske profiler for seks forskellige histon modifikationer forbundet med genekspression blev genereret (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 og H3K36me3). Figur 4A viser chip-seq profiler langs kromosom X for de forskellige histon markører. Den meget peak korrelation observeret mellem de 6 forskellige histon profiler viser mulighederne i automatiseret system til at generere nøjagtige og pålidelige data. Figur 4B, 4C og 4D viser fordelingen af toppe til forskellige histon ændringer på bestemte genomiske regioner.
Automatiserede kromatin immunpræcipitationseksperimenter ned til 200 celler
Den minimale mængde af celler, som kan anvendes i chip eksperimenter afhænger af kvaliteten af kromatin den specificity og følsomhed af antistoffet og overflod af histon modifikation eller protein undersøgt. Valg af god Chip-seq kvalitet antistoffer er vigtigt, når man arbejder med begrænsede mængder af prøve og udvælgelse af optimale reagenser og forskellige luftfartsselskaber forbedrer effektiviteten af DNA-genopretning og bidrage til succes for chippen eksperiment. For at bestemme den minimale mængde celler, at den automatiske chip-protokollen kan behandle, forskellige mængder af kromatin, antistof og magnetiske perler blev testet i IP-Star automatiseret system ved hjælp af chip reagenser specifikt optimeret til at arbejde med små mængder af kromatin.
Først blev kromatin fra 10.000 celler sonikeret som beskrevet i protokollen. Chippen resultater blev bekræftet af qPCR (figur 5A), som viser væsentlige berigelser med H3K4me3 antistof i positive kontrolregioner og ubetydelig signal i negativ kontrol regioner. Til sammenligning og bevis for konsistens, additional data opnået med H3K27ac, H3K9me3 og H3K27me3 antistoffer, der bruger 10.000 celler tilvejebringes.
Automatiserede CHIP blev udført så for at demonstrere mulighederne i det automatiserede system til at arbejde med små mængder af celler med det samme H3K4me3 antistof. Den automatiserede chip klaret sig godt, hvilket fremgår af en række af ti IP reaktioner, der var reproducerbare og meget sammenlignelige med de manuelle chip resultater (figur 5B). Manuel og automatiseret eksperimenter blev udført, og fordelene ved de automatiserede protokoller blev set at reducere eksperiment til eksperiment variabilitet (figur 5C).
Figur 5. Optimering af chip og Auto CHIP eksperimenter på 10.000 celler Manuelle chip eksperimenter blev udført på 10.000 celler og anvendelse af 0,25 ug H3K4me3, 0,1 ug H3K27ac, 0,5 ug H3K9me3 og 0,25 ug H3K27me3 antistoffer. Identiske mængder af kanin-IgG blev anvendt som en kontrol. QPCR blev udført med primere for to positive loci og to negative loci for hver chip assay. Figur 5A viser genopretning, udtrykt som en procentdel af input (den relative mængde af immunopræcipiteret DNA i forhold til input DNA efter qPCR analyse). Figur 5B viser 10 CHIP reaktioner kørt på IP-Star Compact hjælp 0,25 ug H3K4me3 polyklonale antistof og 0,25 ug kanin IgG som negativ kontrol-antistof. Så qPCR analyse blev udført med primere for den positive loci EIF4A2 promotor og GAPDH TSS og den negative loci Myoglobin exon2 og SAT2. Figuren viser genvinding, udtrykt som en procent af input (relative mængde af immunopræcipiteret DNA i forhold til input DNA efter qPCR analyse). Figur 5C viser H3K4me3 chip data for 10 manuelle chip forsøg i sammenligning med 10 automatiserede CHIP eksperimenter. Error søjler repræsenterer s tandard afvigelser i hver af de ti gentagelser. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
For at forstå følsomheden af de automatiserede chip protokoller blev eksperimenter udført under anvendelse af en mængde af celler, som strakte sig fra 100.000 ned til 200 celler pr IP. Anti-H3K27me3 antistof blev anvendt, da det er en meget almindelig histon modifikation. Brugen af andre histon eller ikke-histon-antistoffer kan kræve mere eller mindre celler, afhængigt af den overflod af epitopen og kvaliteten af antistoffet. Forsøgene blev valideret ved kvantitativ PCR, og det blev observeret, at ved at reducere mængden af perler og antistof baggrund i eksperimenterne reduceres tillader succesfulde chip qPCR resultater med så lidt som 200 celler antistof (figur 6).
Iles / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg "/>
Figur 6. Automatiseret chip assays på 200 celler. Hela-S3-celler og antistof rettet mod H3K27me3. Chromatin blev forskudt fra 1 million celler og serielle fortyndinger af denne kromatin (fra 100.000 til 200 celle ækvivalent) blev anvendt per chip reaktion. 1 ug H3K27me3 og 10 pi protein A-coatede magnetiske perler blev anvendt på 100.000 celler eksperiment, 0,5 ug H3K27me3 og 10 pi perler på 10.000 og 1.000 celler og 0,25 ug H3K27me3 og 5 pi af perler med 500 og 200 celler. 1 ug og 0,5 ug af kanin-IgG blev anvendt som negativ kontrol-antistof, når der udføres forsøg med 100.000 celler og 1.000 celler henholdsvis. 6A viser belægning af TSH2B og GAPDH-generne i% i input. 6B viser relative belægning af TSH2B versus negative GAPDH kontrol genomisk region.
Downstream analyse chip-seq resultater på10.000 celler
For at vurdere den globale kvalitet af de automatiske chip-seq eksperimenter med lave udgangspunkter antal celler, automatiseret chip-seq assays blev udført med 0,25 ug af H3K4me3 antistof på 10.000 HeLa-celler og chip eksperimenter på 100.000 HeLa-S3-celler blev anvendt som positiv kontrol til eksperimentet. De automatiske biblioteker blev fremstillet ved anvendelse af MicroPlex bibliotek forberedelse kitreagenser tilpasset forberedte biblioteker med lave DNA beløb. Bemærk, at selv om det er muligt at udføre vellykkede automatiserede chip eksperimenter med mindre end 10.000 celler, vil mængderne af trukket ned DNA ikke være nok til at forberede biblioteker ved hjælp af kit-reagenser. Cluster generation og sekventering blev udført ifølge producentens anvisninger. Den bioinformatik analyser efter sekventering viser fremragende resultater fra de lave celle nummer chip prøver. Den 30 pg datasæt (svarende til 10.000 celler af udgangsmateriale ) Indeholder lav baggrundsstøj og meget pålidelige berigelse toppe, som er bekræftet af både 300 pg datasæt (svarende til 100.000 celler af udgangsmateriale) og H3K4me3 datasæt genereres af Broad Institute for KODE projekt, der blev anvendt som en ekstern reference. Det er vigtigt at bemærke Top 40 overlap forholdet data, som henviser til en standard metode i KODE 11 projekt, hvor chippen-seq anses reproducerbar hvis sammenligne to datasæt er der mindst en 80% overlapning af de bedste 40% af toppene klassificeret efter betydning score. Den 30 pg datasæt opfylder disse kriterier i forhold til både de 300 pg datasæt (overvejer alle sine toppe, ikke bare den bedste 40%) og de overordnede Institut (tabel 1). De 300 pg datasæt viser næsten identiske toppe til Broad Institute data med en 98% Top 40 overlap ratio (figur 7).
ighres.jpg "/>
Figur 7. chip assays og bibliotek generation på 10.000 celler chip seq eksperimenter blev genereret på 10.000 og 100.000 HeLa-S3-celler under anvendelse H3K4me3 antistof (0,25 pg / pl). De 35 bp tags blev kortlagt det menneskelige genom med eland aligner. Under den efterfølgende peak ringer SICER kunne pålideligt identificere de berigelser fra lave celletal samt fra millioner af celler. De datasæt blev analyseret og sammenlignet med hinanden og til referencedataene genereres af de overordnede Institute. De lave celleprøver er konsekvente og har meget stor lighed. Den 30 pg prøve opfylder Encode kriterier 11 (min. 80% af den øverste 40% af toppene skal overlappe). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Tabel 1.
Discussion
Chromatin immunpræcipitation efterfulgt af sekventering er nu en standard procedure. Her en automatiseret chip seq protokol, der kan generere kromatin epigenetiske profiler med så få som 10.000 celler af udgangsmateriale præsenteres.
Automatisering chip og forberedelse bibliotek assays tillader standardisere chippen optimering procedure og reducere eksperimentel variabilitet. Den flydende håndteringssystem præsenteres her eliminerer mange af de manuelle procedurer, der er forbundet med afslag reducere hænderne på tid til bare 30 min, minimerer prøve tab, og muliggør nøjagtig chip seq med få picogram bibliotekets indgang. For at opnå succes automatiserede chip-seq eksperimenter, er det også afgørende at bruge høj kvalitet klippet kromatin præparater og chip-seq kvalitet antistoffer i hvert forsøg Systemet anvender magnetisk perle-baseret teknologi og giver fleksibilitet til at ændre vigtigste eksperimentelle parametre som inkubation tid til antistoffet frakkeing og immunopræcipitering trin eller ændring af vaskebetingelserne tillader forskeren at foretage alle nødvendige forsøg med chip seq optimering. Det automatiserede system er en "åben" platform, der også muliggør en sammenligning af flere reagenser parallelt til optimering af eksperimentelle betingelser for hver enkelt cellelinie og antistof og muliggør en direkte sammenligning af forskellige typer og koncentrationer af kromatin, forskellige antistoffer og endda forskellige typer af magnetiske perler.
En af begrænsningerne ved det automatiserede system er behovet for at automatisere alle protokoller i mængder, der spænder fra 5 pi til 200 pi. Men miniaturisering af forsøgene i denne automatiserede platform muliggør også, at spare omkostninger i reagenser.
Ud over de protokoller, der er beskrevet i denne undersøgelse, er systemet tilpasses og også automatiserer en række andre magnetisk perle baserede applikationer såsom immunfældning ennd erobringen af methylerede DNA (MeDIP og MethylCap teknologi), immunoudfældning af hydroxylmethylated DNA (hMEDIP), sekventiel kromatin immunoprecipitation (ReChIP), RNA immunoprecipitation (RNA-IP), bisulfit konvertering, og DNA-rensning assays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life technologies | 14190-094 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-100ML | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | |
| 1.25 M Glycine Solution | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Lysis Buffer iL1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Lysis Buffer iL2 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Shearing Buffer iS1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Protease Inhibitors Mix (200x) | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Life technologies | 14175-053 | |
| Lysis Buffer tL1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| ChIP Buffer tC1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| ideal ChIP-seq kit | Diagneode | C01010051 | |
| ChIP-Buffer H | Diagenode | C01010020 | Component of the Auto Histone ChIP-seq kit |
| Auto Histone ChIP-seq kit | Diagenode | C01010020 | |
| Auto True Micro ChIP kit | Diagenode | C01010130 | |
| H3K79me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15310068 | |
| H3K27me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410069 | |
| H3K4me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410030 | |
| H3K4me2 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410035 | |
| H3K9ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410004 | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410200 | |
| H3K36me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410058 | |
| H3K9me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410193 | |
| Rabbit IgG | Diagenode | C15410206 | |
| Protein-A coated paramagnetic beads | Diagenode | C01010020 | |
| Auto IPure | Diagenode | C03010010 | |
| MicroChIP DiaPure columns | Diagenode | C03040001 | |
| Universal SyberGreenMaster Mix 1.25 ml | Diagenode | DMMLD2D100 | |
| Quant-IT dsDNA | Invitrogen | Q32854 | |
| Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA | Illumina | FC-121-3001 | |
| Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| MicroPlex Library Preparation Kit | Diagenode | C05010010 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Illumina Library prep Quantification kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
| IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060001 | |
| Qubit system | Invitrogen | Q32857 | |
| Illumina Hiseq systems | Illumina |
References
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).
- Aldridge, S., et al. AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation. Genome Biology. 14, 124 (2013).
- Farias-Hesson, E., et al. Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms. Journal of Biomedicin., & Biotechnology. 2010, (2010).
- Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms. BioTechniques. 56, 28-35 (2014).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25, Oxford, England. 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
