Introduction
Som nästa generations sekvensering (NGS) teknik har blivit vanligare och mer tillgänglig, den primära metoden för genomet hela kartläggning av protein-DNA-interaktioner nu kromatin immunoprecipitation följt av NGS detektion (chip-punkter), vilket möjliggör upptäckten av transkriptionsfaktor bindningsställen eller mönster av histon modifieringar. Chip-punkter är fördelaktigt att tillhandahålla hög genomströmning data för hela genomet som kan användas för kvantitativ och kvalitativ analys av protein-DNA-interaktioner genom mätning av de anrikade DNA-fragment. Det finns emellertid vissa nackdelar i standard ChIP-seq experiment såsom svårigheten att erhålla tillräckligt med material för att skapa en sekvense bibliotek.
CHIP experiment är indelade i sex grundläggande steg inklusive 1) tvärbindande protein-DNA-bindande regionerna 2) provberedning som inkluderar cellysering och klippning av kromatin genom ultraljudsbehandling, 3) bildning av immun,4) utfällning av immun, 5) tvättning av immun, och 6) eluering av anrikade materialet och analys av qPCR och NGS.
Framgången för ett chip-analysen är beroende av tre huvudfaktorer: en bra kromatin förberedelse, mängden antigen i det ursprungliga provet, och specificitet och affinitet av antikroppen för dess besläktade antigen. En viktig begränsning är kravet på höga mängder av utgångscellantal för att erhålla tillräckligt anrikat DNA, vilket skapar en sekvenseringsbibliotek. För forskare som arbetar med begränsade provmängder, såsom biopsiprover eller cell delpopulationer, spån punkter experiment är mycket utmanande. Nyligen genomförda studier har visat att spån artiklar analyser kan utföras när man arbetar med en låg mängd celler 1, 2. Diagenode har utvecklat hanterings ett robotsystem vätska som helt kan automatisera spån punkter experiment vid start med ett begränsat antal celler.
Automation levererarmånga fördelar jämfört manuell beredning av spån artiklar prover som det minskar mänskliga fel, minskar variationen, och minskar experimentell kostnad. Halvautomatiska protokoll för kromatin immunoprecipitation och förberedelse bibliotek har rapporterats men ingen av dessa studier har visat data när du använder låga cellantal 3, 4, 5, 6.
I detta papper en komplett automatiserat arbetsflöde beskrivs både kromatin immunoprecipitation och förberedelse bibliotek analyser i en robotvätskehantering som använder magnetisk pärla baserad teknik och som kan åtgärda flera parametrar i protokolloptimering. Här har automatiserade spån punkter experiment godkänt resultat på ett begränsat antal celler med målet att förenkla, standardisera och ger en tillförlitlig lösning för att studera epigenetiska profiler i små cellpopulationer. Den automatiserade ChIP protokoll som beskrivs i detta dokument har optimerats på HeLa-celler med specifika histon antikroppar och reagenser but arbetsflödet kan anpassas till andra cellinjer och antikroppar med motsvarande experimentell optimering.
Protocol
1. Standard ChIP Experiment
- Cell insamling och DNA-proteintvärbindning.
- Väx HeLa-S3-celler till ett sammanflöde av 80% -90%. Avlägsna odlingsmedium, tvätta skålen två gånger med 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och tillsätt Trypsin-EDTA (1 x) till den odlade plattan. Inkubera i högst 2 minuter för att lösgöra cellerna från skålen. Samla cellerna och tvätta två gånger med 10 ml PBS.
OBS: Längre inkubationstider kommer att leda till cellskador. - Centrifugera cellerna under fem minuter vid 500 x g och återsuspendera cellerna i 20 ml PBS. Fortsätt att räkna cellerna.
- Centrifugera cellerna under fem minuter vid 500 x g, kasta supernatanten och tillsätt 500 ul PBS. Det optimala antalet celler för fixeringssteget är 10 miljoner celler per 500 | il PBS.
- Lägg 13,5 l färsk 37% formaldehyd i varje alikvot av 500 pl cellsuspension. Fixera cellerna under 8 min vid rumstemperatur.
- Lägg 57 pl 1,25 M glycin solutjon att stoppa fixeringen. Inkubera under 5 min vid RT med konstant blandning genom försiktig vortex. Arbetet med is från denna punkt och framåt.
- Centrifugera cellerna vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 ml PBS. Kasta försiktigt supernatanten och hålla cellpelleten på is.
- Väx HeLa-S3-celler till ett sammanflöde av 80% -90%. Avlägsna odlingsmedium, tvätta skålen två gånger med 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och tillsätt Trypsin-EDTA (1 x) till den odlade plattan. Inkubera i högst 2 minuter för att lösgöra cellerna från skålen. Samla cellerna och tvätta två gånger med 10 ml PBS.
- Cellys och kromatin skjuvning
- Tillsätt 10 ml iskall lysbuffert IL1 till cellpelleten (1 ml lyseringsbuffert per miljon celler är det optimala förhållandet). Pipettera upp och ner flera gånger och inkubera under 10 min vid 4 ° C med försiktig blandning.
- Centrifugera lysatet under 5 minuter vid 500 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 10 ml iskall lysbuffert iL2 till lysaten och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned. Inkubera lysaten under 10 min vid 4 ° C.
- Centrifugera i 5 minuter vid 500 xg och 4 ° C och kassera supernatanten.
- Prepare fullständig klippning bufferten lägga till 200x proteashämmare cocktail (PIC) till IS1 klippning bufferten. Håll buffert på is i 5 min och arbeta på is efteråt. Tillsätt 1 ml komplett IS1 skjuvning buffert till vardera 10 miljoner celler pelleten och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned. Före sonikering inkubera proverna på is under 10 min för att minska viskositeten hos provet.
- Skeva 300 l alikvoter av kromatin genom ultraljudsbehandling med hjälp av en vatten badsonikator för 2 till 3 uppsättningar av 10 cykler vardera. En cykel består av 30 sek "ON" och 30 sek "OFF" på en hög effektinställning. Alternativt kan du använda en pico-ultraljudsbehandling enhet med en kortare sonikeringstid av 5 till 10 cykler av 30 sek "ON", 30 sek "OFF". Kortfattat virvel och snurra rören mellan körningarna. Vid användning av andra typer av sonicators, följ motsvarande tillverkarens instruktioner för kromatin klippning.
- Centrifugera klippt kromatin vid 16.000 xg under 10 min och collect supernatanten skall användas omedelbart under undersökningsperioden steget. Alternativt, lagra kromatin vid -80 ° C i upp till 2 månader för framtida bruk.
- Analysera kromatin klippning effektivitet före immunoutfällning steg använder 1-1,5% TAE agarosgeler eller bionalyzer. Optimala kromatin fragment storlek varierar mellan 100-600 bp.
2. Låga Cell CHIP Experiment
- Cell insamling och DNA-protein tvärbindning
- Väx HeLa-S3-celler till ett sammanflöde av 80% -90%. Avlägsna odlingsmedium, tvätta skålen två gånger med 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och tillsätt 1x Trypsin-EDTA till den odlade plattan. Inkubera i högst 2 minuter för att lösgöra cellerna från skålen.
OBS: Längre inkubationstider kommer att leda till cellskador. - Samla cellerna genom tillsats av 1 ml odlingsmedium innehållande serum i en 1 ml centrifugeringsrör. Räkna celler.
- Centrifugera cellerna under fem minuter vid 500 x g. Bring cellantalettill 10.000 celler per ml odlingsmedium för fixeringen.
- Lägg 27 pl av 36,5% nya förberedda formaldehyd i varje rör för fixering. Invertera röret två eller tre gånger och inkubera 10 min vid RT.
- Lägg 115 pl 1,25 M glycin-lösning till provet, vänd röret två eller tre gånger och inkubera 5 min vid RT. Arbetet med is från denna punkt och framåt.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten långsamt.
- Tvätta cellerna med 1 ml iskall HBSS med PIC (200x, slutlig koncentration 1x). Invertera röret två eller tre gånger för att resuspendera cellerna och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kasta försiktigt supernatanten och hålla cellpelleten på is.
- Väx HeLa-S3-celler till ett sammanflöde av 80% -90%. Avlägsna odlingsmedium, tvätta skålen två gånger med 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och tillsätt 1x Trypsin-EDTA till den odlade plattan. Inkubera i högst 2 minuter för att lösgöra cellerna från skålen.
- Cellys och kromatin skjuvning
- Lägg 25 ul av komplett Lysis Buffer TL1 (Lysis Buffer TL1 + PIC) per 10000 celler och skaka manuellt botten av röret för att återsuspendera cellerna. Inkubera på is under 5 min.
- Lägg 75 ul komplett HBSS (HBSS + PIC) buffert i varje alikvot innehållande 10.000 celler.
- Skeva 100 il alikvoter av 10000-celler genom sonikering under 5 uppsättningar av 5 cykel vardera. En cykel består av 30 sek "ON" och 30 sek "FRÅN" på den höga effektinställning. Alternativt kan du använda en pico-ultraljudsbehandling enhet används med en kortare sonikeringstid av 5 cykler om 30 sek "ON", 30 sek "OFF". Optimala kromatin fragment storlek varierar mellan 100-600 bp. Observera att kromatin preparat, celltyper och olika sonicators kräver separata klippning optimeringsexperiment.
- Centrifugera klippt kromatin vid 14.000 xg under 10 min för att kasta det olösliga materialet och samla supernatanten som ska användas omedelbart i IP steget. Alternativt, lagra kromatin vid -80 ° C i upp till 2 månader för framtida bruk.
- Analysera kromatin klippning effektivitet före immunoutfällning steg använder 1-1,5% TAE agarosgeler ellerden bionalyzer. Behandla prover med RNas före agarosgelanalys för att förbättra den visuella bedömningen av skjuvning. Optimala kromatin fragment storlek varierar mellan 100-600 bp.
3. Kromatin Immunoprecipitation och biblioteks Prep
- För standard automatiserad CHIP experiment
- Lägg 120 pl chip Buffer H (chip buffert H + PIC) till 100 ^ skjuvas kromatin. Använd 200 l för IP och hålla 2 pl till 20 fil som indata prov.
- Välj den automatiserade ChIP 200 l protokoll i automationsinstrumentet. Genomströmningen av protokollet är 1-16 prover per körning.
- Kör en automatiserad ChIP experiment med, kromatin motsvarande 1-2 miljoner celler, 1-2 ug av anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 och H3K9me3 Chip-punkter grade kanin polyklonala antikroppar. Optimala mängder antikropps varierar beroende på histonmodifiering och samhörighet och specificity av motsvarande antikropp.
- Använd lika mängder av icke-immunt kanin-IgG som en isotyp kontrollantikropp. Alternativt använder obelagda pärlor eller specifik blockerad antikropp som CHIP kontroller. Lägg 20 pl av protein A-belagda magnetiska pärlor för varje reaktion.
- Använd automatiserad histon spån punkter reagenser för att utföra automatiserade CHIP experiment med anti-H3K79me3 och -H3K4me2 polyklonala antikroppar. Använd ideala spån punkter reagenser för att utföra ChIP experiment med anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 och -H3K9me3.
- Välj den automatiserade ChIP protokollet efter mjukvaruinstruktioner som genomförts i den automatiska utrustningen. Ställ chipet experimentella parametrarna till 4 timmar för antikroppsbeläggningen steget och 15 timmar för immunoprecipitation steget. Den omvända tvärbindningssteget äger rum i det automatiserade instrumentet vid 65 ° C under 4 h.
- Rena den omvända tvärbunden DNA på det automatiserade systemet. Välj automated protokoll för DNA-rening med ett protokoll eller satsen med magnetisk pärla baserad DNA-rening. Eluera DNA i 25 fil vatten.
- Kvantifiera immunoprecipiterade DNA genom att extrahera 10% av den immunoprecipiterade DNA. Den immunoprecipiterade DNA räcker beror på kvaliteten på kromatin och antikropps, celltyp och målet histonmodifiering. Kvantifiera DNA med användning av en analyssats i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Analysera kvaliteten av det immunfällda DNA genom kvantitativ PCR med användning av primrar för åtminstone en positiv och en negativ kontroll genomregioner. Använd inte mer än 10% av den totala immunoprecipiterade DNA för bedömning CHIP anrik.
- Förbered qPCR reaktioner. Tillsätt 10 pl av en 2x SyberGreen qPCR Master Mix, 1 pl primerblandning, 1-5 pl immunoutfällt eller input DNA och sterilt vatten upp till 20 pl slutlig reaktionsvolym. Den qPCR programmet ingår ett initialt denatureringssteg vid 95 ° C5-10 min beroende på leverantör av Taq-polymeras och glödgningstemperaturer bör fastställas i enlighet med de primers utvalda.
- Använd automatiserade biblioteks prep protokoll som är kompatibla med de kommersiellt tillgängliga Illumina Chip-seq förberedelse bibliotek reagens för att bygga biblioteken använder både Chip DNA samt den sparade input DNA från samma kromatin beredningen. Använd 10-20 ng immunoutfällt DNA från varje antikropp för biblioteks beredning. Förbered upp till 16 automatiserade bibliotek per körning.
- Sekvensera biblioteken och generera kluster enligt Illumina tillverkarens instruktioner. Utför primära bioinformatik analys (kluster filtrering, bas samtal, etc.) efter standarden Illumina pipeline, filter och justera läser den senaste mänskliga genomet enheten (nuvarande version är GRCh38) med ELAND Aligner. Använd SICER 7 eller MACS 8 för toppsamtal och utför nedströms analyser av topparna wed Homer 9, BEDTools 10 eller preferens programvara.
- För lågt celltal automatiserad CHIP experiment
- Lägg 120 pl komplett ChIP buffert TC1 (chip buffert TC1 + PIC) till 100 ^ skjuvas kromatin. Använd 200 l för IP och behålla 20 l som indata.
- Välj automatiserad Chip 200 l protokollet i automationssystemet. Genomströmningen av protokollet är 1-16 prover per körning.
- Kör en automatiserad Chip-punkter experiment med automatiserade CHIP reagenser och Chip grade antikroppar optimerad för att fungera på låga kromatin mängder. Använd kromatin motsvarande 10.000 celler och 100.000 celler, 0,5 pg av anti-H3K27me3, 0,25 ug -H3K4me3, 0,1 mikrogram -H3K27ac, 0.25 ug -H3K9me3 spån punkter grade kanin polyklonala antikroppar kanin Premium. Optimala mängder antikropps varierar beroende på histonmodifiering och affinitet och specificitet för motsvarande antikroppen.
- Använd lika stor mängd av icke-immun rabbit IgG som isotypkontrollantikropp. Alternativt använder obelagda pärlor eller specifik blockerad antikropp som CHIP kontroller. Lägg 10 pl av protein A-belagda magnetiska pärlor för varje reaktion.
- Välj den automatiserade ChIP protokollet efter mjukvaruinstruktioner som genomförts i den automatiska utrustningen. Ställ chipet experimentella parametrarna till 4 timmar för antikroppsbeläggningen steget och 15 timmar för immunoprecipitation steget. Den omvända tvärbindningssteget äger rum i det automatiserade instrumentet vid 65 ° C under 4 h.
- Rena omvänd tvärbunden DNA med användning spinnkolonner enligt tillverkarens instruktioner och eluera i volymer från 6 | il till 25 pl vatten.
- Kvantifiera DNA med en kommersiell analys-kit. Analysera resultaten av qPCR använder primers för positiva och negativa kontrollområden för att utvärdera fliskvaliteten.
- Använd ett bibliotek förberedande kit med optimerad biblioteksberednings reagens för att framställa bibliotek med låg DNA quanteter. Använd 30 pg och 300 pg av chip DNA (motsvarande 10.000 och 100.000 celler experiment respektive) för biblioteks beredning. Förbered biblioteken använder automatiserade protokollet kompatibel med biblioteksberednings reagenser. Den automatiserade biblioteks prep genomströmning är 1 till 48 bibliotek per körning.
- Efter avsluta reparation av de dubbelsträngade DNA-mallar, ligera de klyvnings stam-slingadaptrar innehållande sekvenseringsprimern platserna. Efter DNA-förlängningssteget, amplifiera provet med hifi amplifieringsmetoden som beskrivs i biblioteket preparatet kit-protokollet.
- Efter biblioteks förstärkning, kvantifiera och rena biblioteken efter biblioteket riktlinjer förberedelse kit. Observera att storleken val efter rening är inte nödvändigt.
- Sekvensera biblioteken och generera kluster enligt tillverkarens anvisningar. Utför primära bioinformatik analys (kluster filtrering, bas samtal, etc.) efter stativetard tillverkare pipeline, filter, och rikta den läser den senaste mänskliga genomet enheten (nuvarande version är GRCh38) med ELAND 7 Aligner. Använd SICER 8 eller MACS 9 för toppsamtal och utför nedströms analyser av toppar med Homer, BEDTools 10, eller valfri programvara.
Figur 1. Skärmdumpar av programvaran visar hur du ställer in automatiska CHIP experiment i IP-Star Compact. Programvaran ger flexibilitet att välja mängden prover per körning samt ändra viktiga experimentella parametrar (Antibody Coating, IP och tvättar ) enligt forskaren behov. Den automatiserade procedur tillåter testa olika förutsättningar parallellt (dvs olika typer och mängder av antikroppar, olika typer och mängder av celler och även olika types och mängder av magnetiska pärlor i samma körning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Skärmdumpar av programvaran visar hur du ställer in automatisk biblioteks förberedelse för nästa generations sekvense använder biblioteket kit i automationssystemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Optimera automatiserade spån punkter experiment för åtta olika histon markörer
För att framgångsrikt utveckla och validera de automatiserade CHIP protokoll, spån artiklar grade antikroppar som tidigare validerade i manuella spån Seq experiment (data visas ej) valdes ut. Följande spån punkter grade antikroppar valdes för denna studie: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 och -H3K9me3. Specificiteten hos alla spån punkter grade-antikroppar har tidigare bekräftats dot blöt, peptid arrayer och Western Blot experiment (data visas ej). Pilot Chip-qPCR experiment med ökande mängder antikropps utfördes för att bestämma känsligheten hos antikropparna (Figur 3). qPCR med minst två positiva och två negativa kontrollmålen analyserades och profiler med anrik positiv över negativ målet högre än femdubblats är kvalificerade för sekvense exper iments. Det är viktigt att utföra chip och spån punkter experiment med en hög kvalitet på klippt kromatin. Alla ChIP experiment visas i denna publikation utfördes med färska kromatin. Det är också möjligt att frysa de fasta cellerna vid -80 ° C och fortsätt med kromatin förberedelser och klippning på en annan dag. Men kromatin beredd från frysta fixerade celler kan bete sig annorlunda från kromatin nyberedd och därför sonication villkor kan behöva optimeras för varje kromatin beredning. När du arbetar med olika celltyper, kan skär buffertar med olika detergentkompositioner (SDS) användas. Celltyper såsom primära cellinjer eller cell odlas i suspension är svåra celler att klippa och kommer att kräva av höga SDS koncentrationer (1%), medan cellinjer som är lätta att klippa som HeLa kräver låga SDS koncentrationer (0,1%) i klippning buffertar.
res.jpg "/>
Figur 3. Validering av Chip-grade-antikroppar med hjälp av automationssystemet. ChIP utfördes med anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 och -H3K9me3 kanin polyklonala antikroppar på klippt kromatin från 1 miljon HeLa-S3-celler beroende på histon modifieringar. Automatiserade ChIP protokoll med 200 il arbetsvolymer användes i automationsinstrument för antikropps titreringsexperiment. Antikropps mängder på 1, 2, 5 och 10 mikrogram testades per chip experiment och 2 ug IgG användes som negativ kontroll i varje försök. Anrik bedömdes av qPCR. Resultaten visas som% av ingång (den relativa mängden immunoprecipiterade DNA jämfört med ingångs DNA efter qPCR analys). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter validering och bestämma optima l mängder Chip-grade antikroppar som skall användas i automationssystemet, var automatiserade ChIP-punkter experiment utförs för att alstra sekvenseringsprofiler för varje histonmodifiering (Figur 4).
Figur 4. Histon spån punkter profiler som genereras av automatiserade spån punkter experiment. Figuren visar chip punkter profiler i olika iska regioner för H3K4me3, H3K9ac och H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 och H3K36me3. 4A visar toppfördelningen längs hela X -chromosome och 4B fördelningen i en 75 kb region som omger den GAPDH-genen. 4C visar profilerna för H3K27me3, H3K36me3 och H3K4me3 i en 500 kb region som omger den MYT1 genen och 4D visar fördelningen av H3K9me3 i en 200 kb region som omger ZNF12.large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Histon epigenetiska profiler för sex olika histon ändringar i samband med genuttryck genererades (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 och H3K36me3). Figur 4A visar Chip-seq profiler längs kromosom X för de olika histon markörer. Den mycket topp korrelation observerats mellan de 6 olika histon profiler visar funktionerna i automatiserat system för att generera korrekta och tillförlitliga uppgifter. Figur 4B, 4C och 4D visar fördelningen av topparna för olika histon modifieringar vid specifika genomregioner.
Automatiserade kromatin Immunutfällningsexperiment ner till 200 celler
Den minsta mängd celler som kan användas i CHIP experiment beror på kvaliteten på kromatin, den specificity och känslighet för antikroppen och mängden av det histonmodifiering eller proteinet studerades. Välja bra spån-punkter grade-antikroppar är viktigt när man arbetar med begränsade mängder prov och val av optimala reagens och olika transportörer förbättrar effektiviteten av DNA återhämtning och bidra till framgång för chip experimentet. För att bestämma den minsta mängd celler som den automatiserade ChIP protokollet kan bearbeta, olika mängder kromatin, antikropp och magnetiska pärlor testades i IP-Star automatiserat system med CHIP reagenser specifikt optimerad för att fungera med låga mängder kromatin.
Först kromatin från 10.000 celler sonikerades som beskrivs i protokollet. Chipet Resultaten bekräftades av qPCR (Figur 5A), som visar betydande anrikning med H3K4me3 antikropp i positiva kontrollregioner och försumbar signal i negativa kontrollregioner. För jämförelse och bevis på konsekvens, additional data som erhållits med H3K27ac, H3K9me3 och H3K27me3 antikroppar, med 10.000 celler tillhandahålls.
Automatiserade ChIP experiment utfördes därefter för att demonstrera möjligheterna hos det automatiserade systemet för att arbeta med låga mängder av celler med användning av samma H3K4me3 antikropp. Den automatiserade Chip utvecklades väl, framgår av en serie av tio IP reaktioner som var reproducerbara och mycket jämförbara med de manuella CHIP resultaten (figur 5B). Manuella och automatiska försök utfördes och fördelarna med de automatiserade protokoll sågs minska experiment experimentera variabilitet (Figur 5C).
Figur 5. Optimering av ChIP och Auto ChIP experiment på 10000 celler Manuella ChIP Experimenten utfördes på 10000 celler och med användning av 0,25 pg av H3K4me3, 0,1 pg av H3K27ac, 0,5 pg av H3K9me3 och 0,25 ^ g av H3K27me3 antikroppar. Identiska kvantiteter av kanin-IgG användes som en kontroll. Den qPCR utfördes med primers för två positiva loci och två negativa lokus för varje ChIP-analys. Figur 5A visar återhämtningen, uttryckt som en procentandel av ingång (den relativa mängden av immunoutfällt DNA jämfört med ingångs DNA efter qPCR analys). Figur 5b visar 10 CHIP reaktioner köras på IP-Star Compact använder 0,25 ug H3K4me3 polyklonala antikroppar och 0,25 pg av kanin IgG som negativ kontroll antikropp. Därefter qPCR analys utfördes med primers för den positiva loci EIF4A2 promotor och GAPDH TSS och den negativa loci Myoglobin exon2 och SAT2. Figuren visar återhämtningen, uttryckt som en procent av ingående (relativa mängden immunutfälldes DNA jämfört med ingångs DNA efter qPCR analys). Figur 5C visar H3K4me3 ChIP data för 10 manuella ChIP experiment i jämförelse med 10 automatiserade ChIP experiment. Felstaplar representerar s tandard avvikelserna för var och en av de tio replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att förstå hur känsliga de automatiserade CHIP protokoll utfördes experiment med hjälp av en mängd celler som sträckte sig från 100.000 ner till 200 celler per IP. Den anti-H3K27me3 antikropp användes eftersom det är en mycket vanlig histonmodifiering. Användningen av andra histon eller icke-histon-antikroppar kan kräva mer eller mindre celler, beroende på överflöd av epitopen och kvaliteten av antikroppen. Experimenten validerades genom kvantitativ PCR och det konstaterades att genom att minska mängden pärlor och antikropps bakgrund i experimenten reduceras möjliggör framgångsrika Chip-qPCR resultat med så lite som 200 celler antikropp (Figur 6).
iles / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg "/>
Figur 6. Automatiserad CHIP analyser på 200 celler. Hela-S3 celler och antikropp riktad mot H3K27me3. Chromatin blev klippt från 1 miljon celler och seriespädningar av denna kromatin (från 100.000 till 200 celler motsvarande) användes per chip reaktion. 1 pg av H3K27me3 och 10 ul protein A-belagda magnetiska pärlor användes på 100.000 celler experiment 0,5 pg av H3K27me3 och 10 pl pärlor på 10.000 och 1.000 celler, och 0,25 pg av H3K27me3 och 5 pl av pärlor med 500 och 200 celler. 1 | ig och 0,5 i ^ g av kanin-IgG användes som negativ antikroppskontroll när utför experiment med 100.000 celler och 1000-celler respektive. 6A visar beläggning av TSH2B och GAPDH-gener i% över input. 6B visar relativ beläggning av TSH2B kontra negativa GAPDH kontroll genomregion.
Nedströms analys av Chip-seq resultat på10.000 celler
För att bedöma den globala kvaliteten på de automatiserade spån punkter experiment med låga start antal celler, automatiserad spån punkter analyser utfördes med 0,25 ug av H3K4me3 antikropp på 10.000 HeLa-celler och chip experiment på 100.000 HeLa-S3-celler användes som positiv kontroll för försöket. De automatiserade biblioteken framställdes med användning av MicroPlex biblioteks förberedelse reagenser anpassade till preparerade bibliotek med låga DNA belopp. Notera att även om det är möjligt att utföra framgångsrika automatiserade spån experiment med mindre än 10.000 celler, kommer mängden drog ner DNA inte tillräckligt för att förbereda biblioteken med hjälp av satsreagenser. Cluster generation och sekvense utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Den bioinformatik analyser efter sekvense visar enastående resultat från de låga cellnummerflisprover. Den 30 pg dataset (motsvarande 10.000 celler av utgångsmaterial ) Innehåller låga bakgrundsljud och mycket tillförlitliga anrikningstoppar som har bekräftats av både 300 pg dataset (motsvarande 100.000 celler av utgångsmaterial) och H3K4me3 dataset genereras av Broad Institute för INPROGRAM projekt som användes som en extern referens. Det är viktigt att notera Top 40 överlappningsförhållande uppgifter, som hänvisar till en standardmetod som används i KODA 11 projekt där Chip-artiklar anses reproducerbar om man jämför två datauppsättningar det finns åtminstone en 80% överlappning av de bästa 40% av topparna efter signifikans poäng. Den 30 pg dataset uppfyller dessa kriterier jämfört med både 300 pg dataset (med tanke på alla dess toppar, inte bara den bästa 40%) och Broad Institute data (Tabell 1). Den 300 pg dataset visar nästan identiska toppar till Broad Institute data med en 98% Topp 40 överlappning förhållande (Figur 7).
ighres.jpg "/>
Figur 7. ChIP analyser och biblioteksgenerering på 10.000 celler Chip-seq experiment genererades på 10.000 och 100.000 HeLa-S3-celler med hjälp H3K4me3 antikropp (0,25 mikrogram / l). De 35 bp taggar kartlades till det mänskliga genomet med ELAND Aligner. Under den efterföljande topp ringer SICER kunde tillförlitligt identifiera anrik från låga cellantal samt från miljontals celler. De datamängder analyserades och jämfördes med varandra och med referens data som genereras av Broad Institute. De låga cellprover är konsekventa och har mycket hög likhet. Den 30 pg prov uppfyller Koda kriterier 11 (min. 80% av den övre 40% av topparna ska överlappa). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1.
Discussion
Kromatin immunoprecipitation följt av sekvense är nu ett standardförfarande. Här en automatiserad Chip-punkter protokoll som kan generera kromatin epigenetiska profiler med så få som 10000 celler av utgångsmaterial presenteras.
Automatisera chip och förberedelse bibliotek analyser möjliggör standardisering av chip optimeringsförfarandet och minska experimentell variabilitet. Den vätskehanteringssystem presenteras här eliminerar många av de manuella rutiner i samband med chip minskar händerna på tid att bara 30 minuter, minimerar provförlust, och möjliggör noggrann Chip-punkter med bara några pikogram biblioteks ingång. För att uppnå framgångsrika automatiserade spån punkter experiment, är det också viktigt att använda högkvalitativa klippta kromatin preparat och Chip-punkter grade antikroppar i varje experiment Systemet använder magnetisk pärla baserad teknik och erbjuder flexibilitet att ändra huvud experimentella parametrar såsom inkubation tid för antikropps coating och immunoprecipitation steg eller modifiering av tvättförhållandena tillåter forskaren att genomföra alla nödvändiga experiment för Chip-punkter optimering. Det automatiserade systemet är en "öppen" plattform som också medger en jämförelse av flera reagenser parallellt för optimering av försöksbetingelser för varje enskild cellinje och antikropp och möjliggör direkt jämförelse av olika typer och koncentrationer av kromatin, olika antikroppar och även olika typer av magnetiska pärlor.
En av begränsningarna i det automatiserade system är behovet av att automatisera alla protokoll i volymer som sträcker sig från 5 | j, l till 200 | il. Men miniatyrisering av experimenten i detta automatiserade plattformen möjliggör också spara kostnader i reagenser.
Förutom de protokoll som beskrivs i denna studie, är systemet anpassningsbar och även automatiserar en mängd andra magnetiska pärla baserade applikationer såsom immunoprecipitation and fånga metylerade DNA (MeDIP och MethylCap teknik), immunoutfällning av hydroxylmethylated DNA (hMEDIP), sekventiell kromatin immunoprecipitation (ReChIP), RNA immunoprecipitation (RNA-IP), bisulfit omvandling, och DNA-rening analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life technologies | 14190-094 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-100ML | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | |
| 1.25 M Glycine Solution | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Lysis Buffer iL1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Lysis Buffer iL2 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Shearing Buffer iS1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Protease Inhibitors Mix (200x) | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Life technologies | 14175-053 | |
| Lysis Buffer tL1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| ChIP Buffer tC1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| ideal ChIP-seq kit | Diagneode | C01010051 | |
| ChIP-Buffer H | Diagenode | C01010020 | Component of the Auto Histone ChIP-seq kit |
| Auto Histone ChIP-seq kit | Diagenode | C01010020 | |
| Auto True Micro ChIP kit | Diagenode | C01010130 | |
| H3K79me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15310068 | |
| H3K27me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410069 | |
| H3K4me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410030 | |
| H3K4me2 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410035 | |
| H3K9ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410004 | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410200 | |
| H3K36me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410058 | |
| H3K9me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410193 | |
| Rabbit IgG | Diagenode | C15410206 | |
| Protein-A coated paramagnetic beads | Diagenode | C01010020 | |
| Auto IPure | Diagenode | C03010010 | |
| MicroChIP DiaPure columns | Diagenode | C03040001 | |
| Universal SyberGreenMaster Mix 1.25 ml | Diagenode | DMMLD2D100 | |
| Quant-IT dsDNA | Invitrogen | Q32854 | |
| Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA | Illumina | FC-121-3001 | |
| Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| MicroPlex Library Preparation Kit | Diagenode | C05010010 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Illumina Library prep Quantification kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
| IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060001 | |
| Qubit system | Invitrogen | Q32857 | |
| Illumina Hiseq systems | Illumina |
References
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).
- Aldridge, S., et al. AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation. Genome Biology. 14, 124 (2013).
- Farias-Hesson, E., et al. Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms. Journal of Biomedicin., & Biotechnology. 2010, (2010).
- Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms. BioTechniques. 56, 28-35 (2014).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25, Oxford, England. 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al.
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
