Komplet thymektomi i voksne rotter med Non-invasiv endotrakeal intubation

Abstract

Thymektomi i neonatale gnavere er en etableret og pålidelig procedure for immunologiske studier. Men i voksne rotter, kan komplikationer af blødning og pneumothorax fra pleural forstyrrelse resulterer i en betydelig dødelighed. Denne protokol er en simpel metode til rotte thymektomi der bruger en mini-sternotomi og endotracheal intubation. Intubation opnås med en ikke-invasiv og let reproducerbar metode og giver mulighed for positivt tryk ventilation for at forhindre pneumothorax og en kontrolleret luftvej, der tillader tilstrækkelig tid til omhyggelig thymus dissektion for at minimere pleural forstyrrelser. En 1,5 cm brystbenet snit falder kontakt med mediastinum skibe og lungehinden, mens det stadig giver fuld visualisering af thymus. Efter eksponering af mediastinum, er thymus fjernet ved stump dissektion under forstørrelse. Pleura rummet forsegles derefter ved sutur lukning af præ-luftrør muskler efterfulgt af anvendelse af kirurgisk lim. DenBrystkassen derefter lukkes ved sutur lukning af brystbenet, efterfulgt af sutur lukning af huden. Alle thymectomies var fuldstændig som vist ved immunhistokemisk (IHC) farvning af mediastinal væv, og fravær af naive T-celler ved flowcytometri, og proceduren havde en overlevelsesprocent 96%. Denne metode er velegnet, når komplet thymektomi med minimale komplikationer ønskes yderligere immunologiske studier i athymiske voksne rotter.

Introduction

Siden begyndelsen af ​​1960'erne har thymus blevet anerkendt for sin afgørende rolle i udviklingen af ​​centrale immunologisk tolerance. Gnaver thymektomi har vist sig at være en væsentlig procedure at definere rollen af ​​thymus i lymfocytdifferentieringen, selv-tolerance, og immuntolerance i fastsættelsen af ​​allograft transplantation og tumormetastase. Fjernelse af rotte thymus tillader forsøg med T-celle depletion eller adoptiv overførsel af definerede T-celle populationer uden genopståen af ​​indfødte naive T-celler.

Thymectomies i neonatale gnavere kan opnås ved hjælp af en suge teknik med pålidelige resultater ^1. I voksne rotter, er denne teknik associeret med ca. 20% dødelighed og ofte resulterer i en ufuldstændig thymektomi ^2. For konsekvent opnå fuldstændig thymektomi i voksne rotter, er åben eksponering af mediastinum gennem en mediansternotomi kræves. Men detteprocedure er forbundet med komplikationer, der omfatter trakeal skade, blødning og pneumothorax fører til en samlet dødelighed fra 1,5 - 6% ^{2- 4.}

I løbet af de sidste to årtier forbedringer thymektomi teknikker har reduceret perioperative komplikationer og har forbedret overlevelsesrater. Endotrakeal intubation giver mulighed for positivt tryk ventilation har mindsket pneumothorax satser ^5. Metoder til intubation tidligere beskrevne interval fra åben eksponering for luftrøret til mindre invasive metoder ved hjælp af direkte vokal snor visualisering. Komplikationer forbundet med intubation procedure omfatter trakeal skade vokal snor brud, utilsigtet esophageal intubation og blødning som følge af hjertepunktur eller sønderrivning af vena cava superior. Desuden kan tæt nærhed af de nedre thymiske lapper til pleural foring resultere i pneumothorax.

Her beskriver vi en teknikthymektomi gennem en minimalt invasiv 2 cm incision i huden efter en enkel metode til endotracheal intubation ved anvendelse af en afstumpet ende angiokateter og transkutan tracheal belysning. Den thymektomi involverer en 1,5 cm sternotomi og en tre-lags lukning med kirurgisk limpåføring at forsegle mediastinum og minimere forekomsten af ​​blødning og respiratoriske komplikationer. Denne metode pålideligt resulterer i fuldstændig thymektomi som det fremgår af forsvinden af CD4 ⁺ og CD8 ⁺ naive T-celler efter thymektomi og fraværet af thymus væv på IHC-farvning. Operative tider og peri-proceduremæssigt dødelighed holdes på et minimum.

Protocol

BEMÆRK: Alle eksperimentelle procedurer, der involverer brugen af ​​rotter blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Animal Care og brug Udvalg Duke University.

1. Forberedelse af Trakeal intubationsrør

1. Skær nålen slutningen af ​​en 2 tommer 14 G angiocathether nål med skærende tænger.
2. Klem lumen af ​​nålen lukket med nåle-næse tænger.
3. Skær klemt afsnittet ned til kanten af ​​det åbne lumen del med skærende tænger, og derefter skære kanterne på begge sider af den resterende ende på 30-45 ° vinkel til nålen kant.
4. Placer de nederste 3 - 4 mm af kanylen ind i det åbne område af lige slip-fælles tænger og træk opad, indtil en svagt stigende kurve er dannet ved enden.
   BEMÆRK: Dette vil lette lede kateteret i trachea (figur 1).
5. Brug fint sandpapir til at udjævne ned kanter ved enden af ​​kanylen.

2. Pre-kirurgiske procedurer

1. Opsætning af webstedet for proceduren ved at placere et operationsmikroskop indstillet til 10X forstørrelse over arbejdsområdet.
2. Placer en opvarmning pad på driftsområdet og dække med en ren absorberende pude.
3. Opsætning af en puls og blodets iltning skærm nær det kirurgiske område.
4. Rotte afvejes for vægtbaseret medicin dosering (f.eks postoperativ analgesi, antibiotika eller lymfocyt nedbrydende antistof).
   BEMÆRK: Typisk voksne rotter vejer mellem 350-450 g.
5. Bedøve rotte med fordampet 3% isofluran-O ₂ (3 L / min) under anvendelse af en induktion kammer udluftes til affald bedøvende gas scavenging indeholdende aktivt kul. Tillad 5 min til anæstesi induktion til at levere dyb anæstesi er nødvendig for endotracheal intubation.
6. Administrer Carprofen eller Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutant til rotter før de går med intubation og kirurgi.
7. Brug el-neglesaks til at barbere halsen og brystet af den bedøvede rotte før intubation.

3. Intubation

1. Forbered intubation setup ved at gnide en lille mængde smøring (fx KY gel) på enden af intubation kanyle. Tænd ventilatoren begynde strømmen af ​​isofluran gas gennem forbindelsesslangen.
2. Overfør rotte til intubation apparatet og suspenderer rotte på metalstangen ved sin øvre fortand tænder (figur 2A).
   BEMÆRK: Visse intubation apparater kan købes online. Den her viste model er hjemmelavede ved hjælp af en acrylplade støbt omkring sektioner af en 2 x 4 inch lumbal stykke ved hjælp af en butan fakkel og forstærkninger er fastgjort med chloroform. Linjen (eller metaltråd) er fastgjort ved at bore huller over afdækningstape placeret på side af akryl at forhindre splintring eller revnet.
3. Trans-belyse rottens hals ved at placere en fleksibel høj intensitet lyskilde 1 - 2 cm fra den ventrale overflade af halsen (figur 2B).
4. Brug et par af de studerendes standardmønster pincet til at trække tungen forsigtigt opad og til siden af ​​de nederste tænder. Grip tungen mellem tommel- og pegefinger af en hånd mens placere den flade indvendige overflade af den ene side af tangen mod den nedre ende af tungen. Tryk ventralt at blotlægge epiglottis og blænde af strubehovedet (figur 2C).
5. Visualiser stemmebåndene og vejlede opadvendte, stumpe ende af intubationsrør fortil gennem den åbne glottis i luftrøret indtil nav angiokateter rører fortænderne.
6. Fjern metal stiletten, og fastgør anæstesi slangen til angiokateter åbning til at begynde ventilation med isofluran.
   BEMÆRK: Den typiske ilt flow sats på ventilatoren er 3 L / min med 3% isofluran.
   1. Sæt ventilatoren med en hastighed på 60 respirations / min i et volumen styret ventilator tilstand, der opnår et tryk på ~ 12-14 mmHg. Brug en positiv ende-expiratory tryk (PEEP) 3 cm H ₂ O.
7. Observer bilateral brystvæggen ekspansion synkroniseret med ventilatoren for at sikre korrekt placering af det endotracheale rør.
8. Påfør dyrlæge-anbefalede øjensalve til rottens øjne for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
9. Påfør dyrlæge salve på rottens øjne for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
10. Fastgør endotrachealrøret i hovedet på rotten med en stribe af klud tape. Sikre en fast forbindelse mellem endotrachealrøret og bedøvelsesmidlet tilstrømning slangen.
11. Fastgør blodets iltning og pulsmåler til rottens mund og begynde overvågning. Bekræft ordentlig bedøvelse ved at bekræfte der er ingen reaktion påe-knivspids.

4. thoracotomi og thymektomi

1. Følg standard aseptisk teknik for hele proceduren.
   1. Rens arbejdsområdet og operationsbordet og desinficere med en 70% ethanol opløsning.
   2. Brug sterile kirurgiske handsker under proceduren, og autoklaver alle instrumenter og materialer, der anvendes under proceduren.
   3. Påfør providon-jod til hele brystet og lad det tørre. Derefter rense overfladen af ​​huden med 70% ethanol på gaze. Dæk rotte med klar plastfolie skære et hul for at blotlægge sterile område.
2. Identificer suprasternal hak i den øverste thorax region. Foretag en 2 cm midtlinjeincision gennem huden startende 2 - 3 mm over suprasternal hak og strækker sig distalt midterlinje langs brystbenet ved stump spids Shea saks.
3. Udfør en 1,5 cm mediansternotomi fra suprasternal hak igen ved stump spids Shea saks. KEEP den nederste kant af saksen lige under brystbenet og forskud langsomt.
4. Indsæt en lille Alm retractor lige under adskilt brystbenet og åben for at afsløre den præ-tracheal rem muskler (sternohyoid og sternothyroid muskler). Adskil før luftrør rem muskler ved stump Graefe pincet. BEMÆRK: På dette tidspunkt luftrøret kan ses, og intubationsrøret skal visualiseres inde i luftrøret.
5. Placer tænderne i den lille Alm retraktor under de separerede strap muskler og brystbenet. Åbn retraktoren at blotlægge den overlegne aspekt af thymus.
6. Brug fine Dumont pincet til at frigive de laterale kanter af thymus væv og udsætte de nedre thymiske lapper.
7. Træk thymus forsigtigt overlegent i det åbne incisionssted, idet man undgå kontakt med den overlegne vena cava, subclavia og carotis fartøjer, og for at minimere forstyrrelser af den fine pleural foring mellem thymus og lungerne.
8. Som than thymiske skibe dissekeres og afslørede, brug mikro-saks til at opdele dem. Brug en vatpind til at holde presset på skibe til hæmostase, hvis nødvendigt.
9. Lever de lavere thymiske lapper ind i snittet og så skarpt lysere vedhæftede bageste. Fjern intakte thymus og omhyggeligt inspicere fjernet thymus for forsvundne sektioner.
   BEMÆRK: Små thorax lymfeknuder kan visualiseres omkring thymus og er ofte vanskelige at skelne fra thymisk væv. Disse vil være diskrete runde noder med et lignende udseende til thymus væv, men vil ikke være i kontinuitet med thymus.
10. Fjern retraktoren Alm og lukke sternohyoid og sternothyoid muskler med to afbrudt 5-0 Maxon suturer.
11. Påfør 2 dråber kirurgisk kvalitet cyanoacrylat vævklæbemiddel tværs suturerne at forsegle mediastinum under positivt tryk ventilation.
    BEMÆRK: Dette vil mindske forekomsten af ​​pneumothorax og hæmatom.
12. Luk sternum med to afbrudt 4-0 silkesuturer på en skæring nål. Stik nålen gennem mellemrum mellem ribbenene, idet man lede nålen lige under brystbenet for at undgå det underliggende muskellag.
13. Luk hudlag med en løbende 4-0 nylonsutur. Afbryd den isofluran på dette tidspunkt at forkorte postoperative anæstesi restitutionsperiode.
14. Rengør incisionssted og omgivende hud med saltvand-fugtet gaze.
15. Påfør flere dråber bupivicain (0,25%) for lokal anæstesi, efterfulgt af 1 - 2 dråber cyanoacrylatlim over incisionen for at forsegle indsnittet.
16. Fortsæt med at ventilere, indtil rotten viser tegn på selvstændig respiratorisk indsats og begynder at bevæge sine ekstremiteter. Extubate rotter og gør det muligt at komme under tæt observation i et bur anbragt på en varmepude.
17. Administrer Buprenorphin (0,01-0,05 mg / kg) umiddelbart efter operationen subkutant til rotter og gentag hver 8-12 timer i 48 timer post-operativt (normalt 5 af total doser). Ved 24 og 48 timer postoperativt administrere Carprofen eller Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutant (3 totaldoser herunder præoperativ dosis).
18. Fortsæt med at overvåge, indtil rotten bevæger sig rundt i buret. På tegn på åndedrætsbesvær, udføre re-intubation og re-udforskning af brystet.
    1. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
    2. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
19. Fjern hudlag suturer en uge postoperativt.

Representative Results

Denne procedure blev udført på voksne Lewis-rotter (n = 26). Den gennemsnitlige driftstid var 15 ± 3 min. Der var ingen intraoperativ dødelighed. Den gennemsnitlige intubation tid - fra placering af rotte på intubation apparat til etablering af ventilation - var 45 ± 5 sek. 24 rotter havde en fuld genopretning efter operationen uden tegn på åndedrætsbesvær eller blødning gennem postoperative dag (POD) 14. En rotte udviklet åndedrætsbesvær på POD 4 og gennemgik på ny operation for at udforske mediastinum. Rotten blev fundet at have en sammenklappet lungelap. Efter re-ekspansion af lungen blev mediastinum re-forseglet med kirurgisk lim under positivt tryk ventilation og bryst blev igen lukket. Rotten inddrives med fuldt uden yderligere respiratoriske abnormiteter. En rotte døde den POD 7 af ukendte årsager.

Den post-thymektomi mediastinum blev inspiceret for tilbageholdt thymus og fjernet thymus væv var visually inspiceret for manglende strækninger og senere undersøges histologisk. Ved obduktion blev thorax væv undersøgt ved hematoxylin-eosin (H & E) pletten. Immunhistokemisk (IHC) for cytokeratin blev derefter udført for at differentiere rest thymus væv fra thorax lymfeknuder (LN), med særligt fokus på strækninger med højere niveauer af kernefarvning af H & E som er normalt for thymus væv. Cytokeratin farvning blev udført under anvendelse af kanin-anti-pan cytokeratin som den primære ab efterfulgt af biotinyleret ged anti-kanin IgG og Vectastain Elite ABC Kit Objektglas blev modfarvet med hæmatoxylin før mikroskopi evaluering. Thymisk væv kan skelnes fra thorax LN'er ved tættere nuklear farvning på H & E (figur 3A & 3B) og en karakteristisk Lacy mønster af cytokeratin farvning, som afviger fra fraværet af cytokeratin farvning ses i LN'er (figurerne 3C og 3D).

Perifere blodprøver opnåetfra aflivet rotter blev analyseret for vedvarende udtømning af naive T-celler. Kort fortalt blev røde blodlegemer lyseret med ACK lyseringsbuffer og leukocytter fra perifert blod (PBL'er) blev vasket to gange med PBS 2% FBS forud for farvet med antistoffer i 30 minutter ved 4 ° C. PBL'er blev derefter fikseret med 4% w / v paraformaldehyd i neutral pH-bufret saltvand inden analyse ved flerfarvede flowcytometri. Total T-celler blev identificeret ved farvning PBMC'er (perifere, mononukleare blodceller) med anti-CD45 + og CD3 +, og naive T-celler blev identificeret ved farvning med anti-CD45RC, anti-CD62L og enten anti-CD4 eller anti-CD8. De procentsatser for hver T-celle delpopulation blev ganget med den absolutte lymfocyttal (opnået ved Duke Vet Clinical Diagnostic Lab) til at bestemme celletal. Repræsentant naive CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celle og samlede T-celletal er vist i figur 4 Thymectomized rotter opretholdt samlede T-celletallet sammenlignet med kontrolgruppen r.ATS men demonstrerede tab af naive T-celle populationer.

Figur 1. Design af intubationsrør. Kanylen er dannet ved afstumpning enden af stiletten af en 14 G x 2 tommer angiokateter. Den distale 3 mm af stiletten er let bøjet til at lede kateteret ventralt for at lette trakealintubation. (A) fra siden af metal stilet. (B) fra siden af angiokateter løbet stilet. (C) Forstørret visning af afstumpet spids stilet.

Figur 2. En skrå intubation platform anvendes til at placere rotten for intubation. Rotten ophængt fra metalstangen af intubation platform ved dens øvre fortænder. En let source vil så blive placeret ventral til rottens hals til trans-belyse svælget. Pincet bruges til at holde tungen og udsætte åbningen af strubehovedet. (A) oven og (B) sidebillede af intubation platform. (C) Diagram af visualiseringen af glottis efter suspension af rotte og eksponering af strubehovedet . Den strubehovedet i diagrammet er fra et dias købt fra Motifolio.

Figur 3. H & E og cytokeratin farvning af mediastinal væv kan skelne thymus fra lymfeknuder. Hematoxylin og eosin (H & E) farvning af en normal thymus (A) og thorax LN (B). Cytokeratin farvning af thymus væv (C) og en thorax LN genvundet efter thymektomi Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4. Slid af perifert blod naive T-celler efter thymektomi. Total T-celle, naive CD4 + T-celler og naive CD8 + -T-celler, hvor kvantificeret fra PBL'er ved flowcytometri i pre-thymektomi (Pre) og rotter 4 uger efter thymektomi (Post ). Data er vist for en rotte hver gruppe og er repræsentative for de samlede resultater.

Discussion

Den nuværende protokol for fuldstændig thymektomi giver en minimalt invasiv tilgang med tre lag indsnit lukning med kirurgisk lim program designet til at minimere komplikationer. Fuldstændig fjernelse af thymus blev påvist ved tab af naive T-celler og IHC-farvning af mediastinal lymfevæv for cytokeratin.

Proceduren for voksne rotter thymektomi er blevet kompliceret af dødeligheden fra 1,5 - 20% på grund af peri-operative komplikationer, hvoraf de fleste er det tilskrives den intime sammenslutning af de lavere kamre af thymus med lungehinden, hjertet og store mediastinum fartøjer ^2-4. Åbne trakealintubation teknikker, hvor luftrøret er punkteret, har en dødelighed ² 6%. Brugen af ​​ikke-invasiv trakealintubation er blevet rapporteret af Na og medarbejdere; blev dog overlevelsesrater ikke rapporteret ^5. Intubation med kanylen fremstillet som beskrevet hermed transkutan luftrør belysning tillader klar visualisering af stemmebånd for konsekvent succesfulde intubationer. Ingen avanceret udstyr er nødvendig for den præsenterede metode, som adskiller sig fra andre rapporterede ikke-invasive teknikker ^{2,5- 8.} Vores fremgangsmåde til afstumpning enden af ​​en angiokateter nål og skabe en opadgående bøjning i slutningen gør det lettere at undgå utilsigtet esophageal intubation og minimerer tracheal traumer. Disse forbedringer til en tidligere beskrevet fremgangsmåde til intubation også anvendelse af en modificeret angiokateter ^9.

Vi finder, at holde brystbenet snit til et minimum nedsætter kontakt med store mediastinale skibe og tilhørende risiko for blødning, samtidig med at en passende eksponering for fuldstændig fjernelse af thymus. Teoretisk skulle den mindre snit også mindske post-proceduremæssige smerter og restitutionstid. Anvendelsen af ​​fibrinlim blev først rapporteret som en modifikation af en åben tracheal intubationprocedure for at forhindre pneumothorax og luftveje skade ^2. Vi har fundet, at anvendelsen af ​​en lille mængde lim over sutureres pre-luftrør muskler mens påtrykning af positivt tryk tilstrækkeligt forsegler pleurahulen og hjælper med at forhindre postoperative respiratoriske komplikationer.

Der er et par aspekter ved protokollen, der er vigtige at fremhæve, så proceduren kan udføres med succes. Det er vigtigt at sikre anæstesi slanger med passende bånd fordi det er muligt at afbryde gasstrømmen under driften som kirurgens hænder er placeret nær rottens hoved og visualisering er kun fokuseret på det kirurgiske sted under mikroskopet. Den mindst mulige smøring anvendes til kanylen før intubation forhindrer kanylen glide ind i spiserøret. Under den flerlagede lukning, det hjælper også at anvende cyanoacrylat vævsklæbemidlet gennem en lille kanyle med en sprøjte, som giver præcis ansøgning og forhindrer utilsigtet over-anvendelse af lim.

Denne procedure tillader ikke re-vaskularisering af fjernet thymus hos en recipient rotte, som er blevet beskrevet andetsteds ^10. Vi også ikke forsøge denne procedure i mus, som ofte anvendes til immune studier. De seneste beskrivelser af thymektomi procedure i voksne mus involverer enten vakuum aspiration af thymus efter eksponering, som har høj komplikation sats i voksne rotter eller en dissektion metode, der er magen til vores procedure ^11,12. Lukningen udføres ikke i lag, og anæstesi opnås ved intraperitoneal injektion af pentobarbital, som foreskriver ikke intubation. De vigtigste begrænsninger af thymektomi procedure i enhver gnaver er kravet om en operationsmikroskop, som kan være meget dyrt, og den tekniske ekspertise til at operere under forstørrelse og udføre proceduren hurtigt.

indhold "> Komplet thymektomi i voksne rotter letter immunologiske undersøgelser med T-celle udvikling, T-celle reaktivitet og tolerance i transplantation og tumor undersøgelser og undersøgelser med T-celle depletion i athymiske rotter ^{13- 15.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 inch 14 G angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator) and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity fiber optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35