Полный Тимэктомия у крыс взрослых с неинвазивной интубации трахеи

Abstract

Тимэктомия у новорожденных грызунов солидной и надежной порядок иммунологических исследований. Тем не менее, у взрослых крыс, осложнения кровоизлияния и пневмоторакса из плевральной нарушения могут привести к значительной смертности. Этот протокол является простым способом крыс тимэктомии, который использует мини-Стернотомия и эндотрахеальной интубации. Интубация осуществляется с неинвазивным и легко воспроизводимый метод и позволяет для вентиляции с положительным давлением, чтобы предотвратить пневмоторакс и контролируемого дыхательных путей, что позволяет достаточно времени для тщательного вилочковой вскрытия, чтобы минимизировать плевральной нарушения. 1,5 см грудины разрез уменьшается контакт с средостения сосудов и плевры, в то же время обеспечивая полную визуализацию тимуса. После облучения средостения, тимус удаляется тупым под увеличением. Плевральной полости затем герметизируют путем закрытия шва из предварительно трахеи мышц с последующим применением хирургического клея.грудной клетки затем закрывается закрытия шва грудины, с последующим закрытием шва кожи. Все thymectomies были полными, о чем свидетельствует иммуногистохимического (IHC) окрашиванием медиастинальной ткани, и отсутствие наивных Т-клеток с помощью проточной цитометрии, и процедура была выживаемость 96%. Этот метод подходит, если полная тимэктомия с минимальными осложнениями требуется для дальнейших иммунологических исследований в безтимусных взрослых крыс.

Introduction

С начала 1960-х годов, тимус был признан за его важной роли в развитии центральной иммунологической толерантности. Грызунов тимэктомия оказался процедурой, необходимой для определения роли тимуса в лимфоцитов дифференциации, аутотолерантности и immunotolerance в условиях трансплантации аллотрансплантата и метастазирования опухоли. Удаление крысы тимуса позволяет исследований, связанных с истощением Т-клеток или приемного передачу определенных групп населения Т-клеток без повторного появления родных наивных Т-клеток.

Thymectomies неонатальной грызунов может быть достигнуто методом всасывания с надежными результатами ^1. У взрослых крыс, этот метод связан с приблизительной смертности на 20% и часто приводит к неполному тимэктомии ^2. Последовательно достичь полного тимэктомия у взрослых крыс, открытая экспозиция средостения через срединную стернотомию требуется. Тем не менее, этотпроцедура, связанная с осложнениями, которые включают в себя повреждение трахеи, кровоизлияния и пневмоторакс, ведущие к общей смертности в пределах от 1,5 - 6% ^{2- 4.}

За последние два десятилетия совершенствования методов Тимэктомия снизились послеоперационные осложнения и улучшению показателей выживаемости. Интубация трахеи позволяет вентиляции с положительным давлением уменьшилось пневмоторакс ставки ^5. Методы интубации описано ранее диапазон от открытого воздействия трахеи менее инвазивных методов, использующих прямой визуализации голосовых связок. Осложнения, связанные с процедурой интубации включают трахеи травмы, вокальный разрыв мозга, непреднамеренное интубация пищевода и кровотечение в результате пункции сердца или рваная рана верхней полой вены. Кроме того, близкое расположение нижних долей тимуса в плевральной подкладке может привести к пневмоторакс.

Здесь мы опишем техникутимэктомия через минимально инвазивной 2 см разрез кожи после простой метод интубации трахеи с использованием притупляются класса ангиокатетера и чрескожной освещение трахеи. Тимэктомия включает в себя 1,5 см стернотомию и закрытие трехслойную с хирургической нанесением клея для герметизации средостения и свести к минимуму случаи кровоизлияния и респираторных осложнений. Этот метод надежно приводит к полному тимэктомии о чем свидетельствует исчезновение CD4 ⁺ и CD8 ⁺ наивных Т-клеток следующим тимэктомии и отсутствие тимуса ткани на окрашивание IHC. Оперативные раз и пригородных процессуальное смертность сведена к минимуму.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры, связанные с использованием крыс было сделано в соответствии с процедурами, утвержденными уходу и использованию комитета животных Университета Дьюка в.

1. Подготовка интубации трахеи канюли

1. Отрежьте конец иглы для 2 дюйма 14 G angiocathether иглы с кусачками.
2. Pinch просвет иглы закрыты игл носом плоскогубцами.
3. Отрежьте ущипнул раздел вниз к краю открытой просвета части с кусачками, а затем вырезать края с обеих сторон оставшийся конец в 30 - под углом 45 ° к иглы края.
4. Поместите нижнюю 3 - 4 мм канюли в открытом пространстве прямых раструбную плоскогубцами и вытяните вверх, пока небольшой восходящей кривой не была сформирована в конце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет способствовать направляя катетер в трахею (рисунок 1).
5. Использование тонкой наждачной бумагой, чтобы сгладить кромки на конце канюли.

2. Предварительное хирургических процедур

1. Настройте сайт для процедуры путем размещения операционного микроскопа установлен на 10-кратным увеличением над рабочей зоны.
2. Поставьте потепления накладка на рабочей зоны и накройте чистой поглощающей панели.
3. Настройка частоты сердечных сокращений и насыщения крови кислородом монитора вблизи операционного поля.
4. Взвесьте крысы по весу, на основе лекарственных доз (например, послеоперационного обезболивания, антибиотиков, или лимфоцитов истощения антитела).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная взрослых крыс весом от 350 - 450 г.
5. Седативный крыс с испаренной 3% изофлуран-O ₂ (3 л / мин) с использованием индукционной камеру выпускают в системе газа поглощать отходы анестетика, содержащего активированный уголь. Разрешить 5 мин для индукции анестезии, чтобы обеспечить глубокого наркоза, необходимое для интубации трахеи.
6. Администрирование Carprofen или Meloxicane (4,4 мг / кг) подкожно крысе до перехода с интубации и хирургии.
7. Используйте электрические ножницы брить шею и грудную клетку под наркозом крысы до интубации.

3. Интубация

1. Подготовка установки интубации путем трения небольшое количество смазки (например, KY гель) на конце канюли интубации. Включите вентилятора начать подачу изофлуран газа через трубопровод разъема.
2. Трансфер крысы интубации аппарата и приостановить крысу на металлическом стержне своим верхним резцов (рис 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые интубации устройства могут быть приобретены в Интернете. Модель, показанная здесь домашний помощью акрилового листа формируются вокруг разделов 2 х 4 дюйма поясничной части с помощью бутан факел, и подкрепления крепятся хлороформом. Бар (или металлической проволоки) крепится путем сверления отверстий более липкой лентой, размещенных на SIDE акрилового чтобы предотвратить раскол и трещин.
3. Транс-освещения шею крысы, поместив гибче высокоинтенсивного источника света 1 - 2 см от вентральной поверхности шеи (рис 2б).
4. Используйте пару студенческих стандартная схема щипцов, чтобы вытащить язык нежно вверх и в сторону нижних зубов. Власть язык между большим и указательным пальцами одной руки при размещении плоской внутренней поверхности одной стороны пинцетом против нижней части языка. Пресс-вентрально, чтобы разоблачить надгортанник и диафрагмы гортани (рис 2С).
5. Представьте голосовые связки и направлять вздернутый, тупого конца интубации канюли впереди через открытую голосовую щель в трахею, пока ступица ангиокатетер не коснется резцы.
6. Снимите металлическую стилет, и приложить трубку для анестезии открытия ангиокатетера начать вентиляцию изофлураном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: типичный Flo кислородаВт Скорость на ИВЛ 3 л / мин с 3% изофлуран.
   1. Установка вентилятора со скоростью 60 дыханий / мин в объеме контролируемых режиме вентилятора, который достигает давление ~ 12 - 14 мм рт. Используйте положительное давление в конце выдоха (ПДКВ) 3 см Н ₂ О.
7. Соблюдайте двустороннего груди расширение стенки в синхронизации с вентилятором для обеспечения правильного размещения эндотрахеальной трубки.
8. Применить ветеринар-рекомендуется глазная мазь для глаз крысы, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
9. Применить ветеринар мазь на глазах крысы, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
10. Закрепите эндотрахеальной трубки в голову крысы с полосой ткани ленты. Обеспечить прочное соединение между эндотрахеальной трубкой и обезболивающий труб притока.
11. Прикрепите крови кислородом, монитор сердечного ритма до ног крысы и начать мониторинг. Подтвердите надлежащего обезболивания, подтвердив нет никакой реакции на ке-пинч.

4. Thoracotomy и Тимэктомия

1. Следуйте стандартной асептической техники для полноты процедуры.
   1. Очистите рабочую зону и операционный стол рабочий и дезинфицировать с 70% -ным раствором этанола.
   2. Используйте стерильные хирургические перчатки во время процедуры, и автоклав все инструменты и материалы, используемые во время процедуры.
   3. Применить провидон-йод для всей области груди и дайте ему высохнуть. Затем очистите поверхность кожи с 70% этанола на марлю. Обложка крысу с прозрачной пластиковой пленкой, резки отверстие, чтобы выставить стерильную операционную поле.
2. Определить suprasternal выемку в верхней грудной области. Сделайте 2 см срединный разрез через кожу, начиная 2 - 3 мм выше suprasternal выемку и проходящей дистальнее средней линии вдоль грудины тупыми наконечниками ножницы Ши.
3. Выполните 1,5 см средний стернотомию от suprasternal паз снова тупыми наконечниками ножницы Ши. КEep нижний край ножницами только под грудиной и заранее медленно.
4. Вставьте небольшую Альм втягивающим прямо под отделенной грудины и открывая предварительно трахеи ремень мышцы (sternohyoid и sternothyroid мышцы). Отделите до трахеи мышц ремень тупыми щипцами Грефе. Примечание: В этот момент трахеи можно видеть, а интубации трубка должна быть визуализированы внутри трахеи.
5. Поместите штыри небольшой Альм втягивающего под отделенных мышц ремень и грудины. Откройте втягивающего подвергайте превосходную аспект тимуса.
6. Используйте тонкий пинцет, Дюмон, чтобы освободить боковых краев ткани вилочковой железы и подвергать нижние тимуса долей.
7. Потяните тимус мягко сверху в открытом месте разреза, заботясь, чтобы избежать контакта с верхней полой вены, подключичной и сонной сосудов, и свести к минимуму нарушения хрупкого плевральной прокладки между тимуса и легких.
8. Так как Tон тимуса сосуды рассечены и показал, используйте микро-ножницы, чтобы разделить их. Используйте ватный тампон, если это необходимо удерживать давление на сосуды для остановки кровотечения.
9. Доставка нижние тимуса долей в разрез, а затем резко лизировать задние вложения. Удалить нетронутыми тимус и внимательно осмотрите удален тимус для любого пропавшего разделах.
   Примечание: Небольшие грудные лимфатические узлы могут быть визуализированы, окружающий тимус и часто трудно отличить от тимуса ткани. Они будут дискретные круглые узлы с аналогичным внешнему виду тимуса ткани, но не будет в непрерывности с тимусе.
10. Снимите ретрактор Альм и закрыть sternohyoid и sternothyoid мышцы с двумя прерывается 5-0 Maxon швов.
11. Применить 2 капли клея цианоакрилат ткани хирургическое класса по швов для герметизации средостения при хорошей вентиляции с положительным давлением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит уменьшить частоту развития пневмоторакса и гематомы.
12. Закройте улernum с двумя прерывается 4-0 шелковые швы на разделочной иглы. Вставьте иглу через зазоры между ребрами, заботясь, чтобы направлять иглу прямо под грудиной, чтобы избежать основной слой мышц.
13. Закройте слой кожи с запущенным 4-0 нейлон шва. Прекратить изофлурана на данном этапе сократить послеоперационный период выхода из наркоза.
14. Очистите сайт разрез и окружающую кожу с физиологическим раствором смачивают марлю.
15. Нанесите несколько капель бупивакаина (0,25%) для местной анестезии, а затем по 1 - 2 капли цианакрилатного клея на разрез, чтобы запечатать разрез.
16. Продолжить, чтобы проветрить до крыса показывает признаки независимого дыхательных усилий и начинает двигаться свои конечности. Экстубации крысу и дать ему восстановиться под пристальным наблюдением в клетке, размещенной на потепление площадку.
17. Администрирование бупренорфин (0,01 - 0,05 мг / кг) подкожно крысе сразу же после операции и повторить каждые 8-12 ч в течение 48 ч пероральноСанкт-оперативно (обычно 5 суммарные дозы). В 24 и 48 часов после операции, управлять Carprofen или Meloxicane (4,4 мг / кг) подкожно (3 Суммарные дозы в том числе предоперационной дозы).
18. Продолжайте следить за пока крысы не движется вокруг клетки. В каких-либо признаков респираторного дистресса, выполните повторное зондирование и повторное исследование органов грудной клетки.
    1. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение.
    2. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью выздоровел.
19. Удалить слой кожи швы 1 неделю после операции.

Representative Results

Эта процедура была выполнена на взрослых крыс Льюиса (п = 26). Среднее время операции составило 15 ± 3 мин. Там не было интраоперационной смертности. Среднее время интубации - от размещения крысы на интубации аппарата к созданию вентиляции - составила 45 ± 5 сек. 24 крыс были полное восстановление от операции без каких-либо доказательств затрудненного дыхания или кровотечение через день после операции (POD) 14. Один крыс развитой дыхательной трудности на POD 4 и прошли повторной операции, чтобы исследовать средостение. Крыса было установлено, что свернутый доли легкого. После повторного расширения легких, средостение был повторно герметизируют с хирургическим клеем под вентиляции с положительным давлением и грудной клетки был вновь закрыт. Крыса восстановлены с полностью без каких-либо дальнейших респираторных нарушений. Один крыса умерла на POD 7 неизвестных причин.

После тимэктомия средостения был проверен при задержке тимуса и удалить ткани вилочковой железы был visually проверены на отсутствие разделы, а затем гистологическое исследование. При вскрытии грудной ткани был рассмотрен гематоксилин-эозином (H & E) пятна. Иммуногистохимия (IHC) для цитокератина Затем был проведен дифференцировать остатка тимуса ткани из грудной лимфатические узлы (LN), уделяя особое внимание на участках с более высоким уровнем ядерной окрашивания H & E, что является обычным для ткани вилочковой железы. Окрашивание Цитокератин проводили с использованием кроличьей анти-пан Цитокератин в качестве основного АВ, а затем биотинилированным козьим анти-кроличьего IgG и ABC Vectastain Elite Kit Слайды были против окрашивали гематоксилином предварительного микроскопии оценку. Тимуса ткани можно отличить от грудных лимфоузлов более плотной ядерной окрашивания на Н & Е (рис 3А и 3В) и характерным кружевной узор из цитокератина окрашивания, которая отличается от отсутствия окрашивания цитокератина видели в LNs (рис 3C и 3D).

Получены образцы периферической кровиот эвтаназии крыс анализировали на упорной истощения наивных Т-клеток. Вкратце, красные кровяные клетки лизируют с ACK лизирующего буфера и лейкоцитов периферической крови (ЛПК) дважды промывали PBS 2% FBS, до окрашивали антителами в течение 30 минут при 4 ° С. ЛПК были затем фиксировали 4% вес / объем параформальдегида в нейтральном рН-буферным солевым раствором до анализа с помощью многоцветной проточной цитометрии. Всего T-клетки были выявлены путем окрашивания МНПК (мононуклеарных клеток периферической крови) с анти-CD45 + и CD3 +, и наивных Т клеток были определены путем окрашивания с анти-CD45RC, анти-CD62L и либо анти-CD4 или анти-CD8. Проценты каждой клеточной субпопуляции Т были умножены на абсолютное количество лимфоцитов (полученной герцог Vet клинико-диагностических лаборатории) для определения числа клеток. Представитель Naïve CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток и общее число Т-клеток, показаны на фиг.4. Thymectomized крыс поддерживают общий подсчет Т-клеток по сравнению с контрольными гАТС, но и продемонстрировал потерю наивных популяциях T-клеток.

Рисунок 1. Конструкция интубации канюли. Канюли формируется затупления конец зонда из 14 G х 2 дюйма ангиокатетер. Дистальный 3 мм стилета слегка согнуты, чтобы направлять катетер вентрально облегчения интубации. () Вид сбоку металлической стилета. (B) Вид сбоку ангиокатетер над стилета. (C) Увеличенное изображение закругленным кончиком зонда.

Рисунок 2. наклонной интубация платформа используется для позиционирования крысу для интубации. Крыса отстранен от металлического стержня интубации платформе верхних резцов. Свет Sourcе будет располагаться брюшного шею крысы в ​​транс-подсветки глотки. Щипцы используются, чтобы держать язык и выставить диафрагму гортани. () Вид сверху и (B) вид сбоку интубации платформы. (C) Схема визуализации голосовой щели после приостановления крысы и воздействия гортани , Гортани в диаграмме слайда, приобретенной у Motifolio.

Рисунок 3. Н & Е и цитокератин окрашивание медиастинальной ткани можно выделить тимус из лимфатических узлов. Гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивание в нормальном тимусе (А) и грудной LN (B). Цитокератин окрашивание тимуса ткани (С) и грудной LN восстановить пост-тимэктомия Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4. Истощение периферической крови наивных Т-клеток после Тимэктомия. Всего Т-клеток, наивные CD4 + Т-клетки и наивные CD8 + Т-клетки, где количественно от ЛПК с помощью проточной цитометрии в предварительном тимэктомии (PRE) и крыс 4 недели после Тимэктомия (Post ). Данные приведены для одной крысы в ​​каждой группе, и они соответствуют результатам, полученным в целом.

Discussion

Настоящий Протокол для полного тимэктомии обеспечивает минимально инвазивный подход с трехслойной закрытия разреза с хирургическим нанесением клея предназначена для сведения к минимуму осложнения. Полное удаление тимуса была продемонстрирована потери наивных Т-клеток и IHC окрашивания медиастинальной лимфоидной ткани для цитокератином.

Процедура взрослых крыс тимэктомии осложняется смертности от 1,5 - 20% в связи с Периоперационные осложнений, большинство из которых являются связано с интимной ассоциации нижних долей тимуса с плевры, сердца и Основные средостения судов ^2-4. Открытые методы интубации трахеи, где трахея пробита, есть смертность на 6% ^2. Использование неинвазивной интубации трахеи сообщалось Н. А. и его сотрудниками; Однако, выживаемость не сообщается ^5. Интубации с канюлей полученного, как описано здесь,с чрескожной освещения трахеи позволяет четкую визуализацию голосовых связок для последовательно успешных интубации. Нет современное оборудование не требуется для предложенного метода, который отличается от других известных неинвазивных методов ^{2,5- 8.} Наш способ затупления конец с иглой и ангиокатетер создания вверх изгиб на конце облегчает избежание случайного пищевода интубации трахеи и сводит к минимуму травму. Это усовершенствование в ранее описанном способе интубации также с использованием модифицированного ангиокатетер ^9.

Мы обнаружили, что поддержание грудины разрез до минимума уменьшает контакт с крупных сосудов средостения и связанного риск кровотечений, позволяя достаточное воздействие для полного удаления тимуса. Теоретически, меньше Разрез должен также уменьшить пост-процессуальной боль и время восстановления. Использование фибринового клея был первым сообщил в модификации открытой интубации трахеиПроцедура для предотвращения пневмоторакс и дыхательных путей травмы ^2. Мы обнаружили, что применение небольшого количества клея в течение ушивают до трахеи мышц при применении положительное давление в достаточной герметизирует плевральной полости и помогает предотвратить послеоперационных дыхательных осложнений.

Есть несколько аспектов протокола, которые важно подчеркнуть, так процедура может быть выполнена успешно. Важно, чтобы обеспечить трубки анестезии с адекватной ленты, потому что это можно отключить подачу газа в процессе эксплуатации, как руки хирурга расположены около головы крысы и визуализации ориентирована только на место хирургической операции под микроскопом. Минимальное смазки применяется к канюле перед интубации предотвращает соскальзывание канюлю в пищевод. В ходе закрытия многослойной, это также помогает наносить клей цианоакрилат ткани через небольшой иглы со шприцем, который позволяет точную подачу и предотвращает случайное более-нанесения клея.

Эта процедура не позволяет повторно сосудистой системы удаленного тимуса у крысы-реципиента, которая была описана в другом месте ^10. Мы также не пытайтесь эту процедуру у мышей, которые часто используются для иммунной исследований. Самые последние описания процедуры Тимэктомия у взрослых мышей связаны либо вакуум-аспирации тимуса после облучения, которая имеет высокую частоту осложнений у взрослых крыс, или метод вскрытия, который похож на нашей процедуре ^11,12. Замыкание не выполняется в слоях, и анестезия достигается путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала, которые не под мандат интубации. Основные ограничения процедуры Тимэктомия в любом грызунов являются требованием для операционного микроскопа, который может быть очень дорогим, и технических знаний, необходимых для работы под микроскопом и выполнить процедуру быстро.

Содержание "> Полный тимэктомия у взрослых крыс способствует иммунологические исследования с участием развитию Т-клеток, Т-клеток реактивность и толерантность в трансплантации опухоли и исследований, а также исследований с участием истощение Т-клеток у бестимусных крыс ^{13- 15.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 inch 14 G angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator) and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity fiber optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35