Komplett tymektomi hos vuxna råttor med icke-invasiv endotrakeal intubation

Abstract

Tymektomi hos neonatala gnagare är ett etablerat och tillförlitligt förfarande för immunologiska studier. Men hos vuxna råttor, kan komplikationer av blödning och pneumothorax från pleural störningar leda till en betydande dödlighet. Detta protokoll är en enkel metod för råtta tymektomi som utnyttjar en mini-sternotomi och endotrakeal intubering. Intubation utförs med en icke-invasiv och enkelt reproducerbar metod och möjliggör övertryck ventilation för att förhindra pneumothorax och en kontrollerad luftvägarna som gör att tillräckligt med tid för noggrann bräss dissekering för att minimera pleural störningar. En 1,5 cm sternala snitt minskar kontakt med mediastinum fartyg och lungsäcken, samtidigt som det ger fullständig visualisering av tymus. Efter exponering av mediastinum, är tymus avlägsnades genom trubbig dissektion under förstoring. Den pleural utrymmet förseglas sedan med sutur stängning av pre-luftrör muskler följt av tillämpningen av kirurgiskt lim. Denthorax stängs sedan med sutur stängning av bröstbenet, följt av sutur stängning av huden. Alla thymectomies var fullständig vilket framgår av immunohistokemisk (IHC) infärgning av mediastinum vävnad, och frånvaro av naiva T-celler genom flödescytometri och förfarandet hade en 96% överlevnad. Denna metod är lämplig när du är klar tymektomi med minimala komplikationer önskas för ytterligare immunologiska studier i atymiska vuxna råttor.

Introduction

Sedan början av 1960-talet, har bräss varit känt för sin avgörande roll i utvecklingen av centrala immunologisk tolerans. Gnagare tymektomi har visat sig vara ett viktigt förfarande att definiera rollen av tymus i lymfocytdifferentiering, självtolerans, och immunotolerans i inställningen av transplantattransplantation och tumörmetastaser. Borttagning av råtta bräss möjliggör studier med T-cells utarmning eller adoptiv överföring av definierade T-cellpopulationer utan återuppstår infödda naiva T-celler.

Thymectomies i neonatala gnagare kan åstadkommas med hjälp av en sug teknik med tillförlitliga resultat ^1. Hos vuxna råttor, är denna teknik förenat med en cirka 20% dödlighet och ofta resulterar i en ofullständig tymektomi ^2. För att uppnå genomgående fullständig tymektomi hos vuxna råttor, krävs öppen exponering av mediastinum genom en median sternotomi. Men dettaförfarande är förenat med komplikationer som inkluderar trakeal skada, blödning och pneumothorax leder till en total dödlighet varierar 1,5-6% ^{2- 4.}

Under de senaste två decennierna förbättringar i tymektomi tekniker har minskat perioperativa komplikationer och har förbättrat överlevnaden. Endotrakeal intubation möjliggör övertrycksventilation har minskat pneumothorax hastigheter ^5. Metoder för intubation tidigare beskrivna intervall från öppen exponering för luftstrupen till mindre invasiva metoder som använder direktstämbands visualisering. Komplikationer i samband med intubation förfarandet inkluderar trakeal skada, stämbands bristning, oavsiktlig esofagus intubation och blödning till följd av hjärtpunktur eller laceration av övre hålvenen. Dessutom kan närhet av de nedre tymiska loberna till pleura fodret orsaka pneumotorax.

Här beskriver vi en teknik förtymektomi genom en minimalinvasiv 2 cm hud snitt efter en enkel metod för endotrakeal intubation med hjälp av en trubbiga slut angiokateter och transkutan luftrör belysning. Den tymektomi innebär en 1,5 cm sternotomi och en tre-skikt stängning med kirurgiskt lim ansökan att täta mediastinum och minimera förekomsten av blödning och respiratoriska komplikationer. Denna metod resulterar tillförlitligt i fullständig tymektomi vilket framgår av försvinnandet av CD4 ⁺ och CD8 ⁺ naiva T-celler efter tymektomi och frånvaron av tymusvävnad på IHC färgning. Operativa tider och dödlighet peri-procedur hålls till ett minimum.

Protocol

OBS: Alla experimentella procedurer som omfattar användning av råttor gjordes i enlighet med protokoll som godkänts av Animal Care och användning kommittén för Duke University.

1. Beredning av trakealintubation kanyl

1. Skär av nålen slutet av en 2 tums 14 G angiocathether nål med en avbitartång.
2. Nyp lumen av nålen stängd med nål-plattång.
3. Skär nöp sektionen ner till kanten av den öppna lumen delen med skärande tänger, och sedan klippa kanterna på båda sidor av den kvarvarande änden vid 30 - 45 ° vinkel till nålen kanten.
4. Placera de nedersta 3-4 mm av kanyl i det öppna området av raka slip-gemensamma tänger och dra uppåt tills en svagt uppåtgående kurva har bildats i slutet.
   NOTERA: Detta kommer att underlätta styrning av katetern i luftstrupen (Figur 1).
5. Använd fint sandpapper för att jämna ner kanterna vid änden av kanylen.

2. Pre-kirurgiska ingrepp

1. Ställ in platsen för förfarandet genom att placera ett operationsmikroskop inställd på 10x förstoring över driftsområdet.
2. Placera en värmande pad på verksamhetsområdet och täck med en ren absorberande dyna.
3. Sätt upp en puls och blodets syresättning skärmen nära det kirurgiska området.
4. Väg råttan för viktbaserad medicinering dosering (t.ex. postoperativ smärtlindring, antibiotika, eller lymfocyter nedbrytande antikropp).
   OBS: Typisk vuxna råttor väger mellan 350-450 g.
5. Stillsam råtta med förångad 3% isofluran-O ₂ (3 L / min) med hjälp av en induktionskammare ventilerad till en avfallsnarkosgaser spolningssystem som innehåller aktivt kol. Låt 5 min för anestesi induktion att ge djup anestesi behövs för endotrakeal intubation.
6. Administrera Karprofen eller Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutant till råtta innan du fortsätter med intubering och kirurgi.
7. Använd elektriska hårklippnings att raka halsen och bröstet av sövda råttan före intubation.

3. Intubering

1. Förbered intubation installationen genom att gnida en liten mängd smörjning (t.ex. KY gel) på slutet av intubationskanyl. Slå på fläkten för att börja flödet av isofluran gas genom anslutningsröret.
2. Överför råttan till intubering apparaten och suspendera råttan på metallstången genom dess övre framtand tänder (Figur 2A).
   OBS: Vissa intubation apparater kan köpas online. Modellen som visas här är hemlagad med hjälp av en akrylskiva gjuten runt delar av en 2 x 4 tum ländryggen stycke med hjälp av en butan fackla, och förstärkningar är fästa med kloroform. Baren (eller metalltråd) bifogas genom att borra hål över maskeringstejp som släpps ut på side av akryl för att förhindra splittring eller sprickbildning.
3. Trans-belysa råttans hals genom att positionera en flexibel högintensiv ljuskälla 1 - 2 cm från den ventrala ytan av halsen (Figur 2B).
4. Använd ett par av elevstandardmönster pincett för att dra tungan försiktigt uppåt och till sidan av de nedre tänderna. Grepp tungan mellan tummen och pekfingret på ena handen medan placera den plana innerytan av en sida av tången mot den nedre änden av tungan. Tryck ventralt att exponera struplocket och bländare i struphuvudet (figur 2C).
5. Visualisera stämbanden och vägleda uppåtvända, trubbiga änden av intuberingskanyl anteriort genom den öppna stämbanden i luftstrupen tills navet i angiokateter berör framtänderna.
6. Ta bort metall stiletten, och fäst anestesi slangen till angiokateter öppningen för att börja ventilation med isofluran.
   OBS: Den typiska syre flow takt till ventilatorn är 3 l / min med 3% isofluran.
   1. Ställ ventilatorn med en hastighet av 60 andningar / min i en volym kontrollerad ventilator läget som uppnår ett tryck av ~ 12-14 mmHg. Använd ett positivt slututandningstryck (PEEP) i 3 cm _H2O
7. Beakta bilateral bröstväggen expansion i synk med ventilatorn för att säkerställa korrekt placering av den endotrakeala tuben.
8. Applicera veterinär rekommenderade ögonsalva till råtta ögon för att förhindra torrhet under narkos.
9. Applicera veterinär salva på råtta ögon för att förhindra torrhet under narkos.
10. Säkra endotrakealtub till chefen för råttan med en remsa av tyg tejp. Säkerställa en fast förbindelse mellan endotrakealtuben och anestesi inflödet slangen.
11. Fäst blodets syresättning och pulsmätare till råttans fot och börja övervaka. Bekräfta korrekt anesthetization genom att bekräfta det finns ingen reaktion på atte-nypa.

4. Torakotomi och tymektomi

1. Följ standard aseptisk teknik för hela proceduren.
   1. Rengör arbetsområdet och operationsbord och desinficera med en 70% etanollösning.
   2. Använd sterila operationshandskar under förfarandet, och autoklav alla instrument och material som används under förfarandet.
   3. Applicera providon-jod till hela bröstet och låt det torka. Rengör sedan ytan av huden med 70% etanol på gasväv. Täck råttan med klar plastfolie skära ett hål för att exponera det sterila operationsområdet.
2. Identifiera halsgropen i övre bröstkorg regionen. Gör en 2 cm mittlinje snitt genom huden börjar 2-3 mm ovanför halsgropen och sträcker sig distalt mittlinje längs bröstbenet med trubbiga spets Shea sax.
3. Utför en 1,5 cm median sternotomi från halsgropen igen med trubbiga spets Shea sax. KEEP underkant saxen precis under bröstbenet och avancera långsamt.
4. Sätt en liten Alm upprullningsdon precis under separerade bröstbenet och öppen för att avslöja före trakeal rem muskler (sternohyoid och sternothyroid muskler). Separera pre-trakeala rem muskler använder trubbiga Graefe pincett. OBS: Vid denna punkt, trakea kan ses, och intubation röret skall visualiseras inuti luftstrupen.
5. Placera stiften i den lilla Alm upprullningsdonet under de separerade band muskler och bröstbenet. Öppna upprullningsdonet att exponera den överlägsna aspekten av tymus.
6. Använd fin Dumont pincett för att frigöra sidokanter tymus vävnad och exponera de nedre thymic lober.
7. Dra bräss försiktigt superiorly i det öppna snittet platsen, var noga med att undvika kontakt med den övre hålvenen, subclavia och halskärlen, och för att minimera störningar i den känsliga pleura fodret mellan tymus och lungorna.
8. Som tHan tymiska fartyg dissekeras och avslöjade, använder mikro-sax för att dela dem. Använd en bomullspinne för att hålla trycket på fartyg för hemostas vid behov.
9. Leverera de lägre tymiska lober i snittet och sedan kraftigt lysera bakre fästen. Avlägsna intakta bräss och försiktigt inspektera bort bräss för eventuella saknade delar.
   OBS: Små bröstkorg lymfkörtlar kan visualiseras omger bräss och är ofta svåra att skilja från tymusvävnad. Dessa kommer att vara diskreta runda noder med ett liknande utseende till tymusvävnad men kommer inte att vara i kontinuitet med bräss.
10. Avlägsna Alm upprullningsdonet och stäng sternohyoid och sternothyoid muskler med två avbröt 5-0 Maxon suturer.
11. Applicera 2 droppar kirurgisk kvalitet cyanoakrylat vävnadsadhesiv över suturer att täta mediastinum enligt övertrycksventilation.
    OBS: Detta kommer att minska förekomsten av pneumothorax och hematom.
12. Stäng sternum med två avbröt 4-0 silkessuturer på en skär nål. För in nålen genom mellanrum mellan revbenen, var noga med att styra nålen strax under bröstbenet för att undvika det underliggande muskelskiktet.
13. Stäng hudlagret med en kör 4-0 Nylon sutur. Avbryt isofluran vid denna punkt för att förkorta den postoperativa anestesi återhämtningsperioden.
14. Rengör snittet webbplatsen och omgivande hud med saltlösning fuktad gasväv.
15. Applicera flera droppar Bupivicaine (0,25%) för lokal anestesi, följt av 1-2 droppar av cyanoakrylatlim över snittet för att försegla snittet.
16. Fortsätt att ventilera tills råttan visar tecken på oberoende andningsansträngning och börjar röra sina armar och ben. Extubera råttan och tillåta det att återhämta sig under noggrann observation i en bur placerades på en värmande dyna.
17. Administrera Buprenorfin (0,01-0,05 mg / kg) subkutant till råttan omedelbart postoperativt och upprepa varje 8-12 h under 48 h post operativt (normalt 5 totalt doser). Vid 24 och 48 timmar efter operationen, administrera Karprofen eller Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutant (3 totalt doser inklusive preoperativ dos).
18. Fortsätta att övervaka tills råttan går runt buren. Vid tecken på andnöd, utföra åter intubation och åter utforskning av bröstet.
    1. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetandet för att upprätthålla sternala VILA.
    2. Skicka inte tillbaka ett djur som har genomgått en operation för att bolaget av andra djur tills återhämtat sig helt.
19. Ta bort hudlagret suturer 1 vecka efter operationen.

Representative Results

Denna procedur utfördes på vuxna Lewis-råttor (n = 26). Medelvärdet drifttid var 15 ± 3 min. Det fanns ingen intraoperativ dödlighet. Den genomsnittliga intubation tiden - från placering av råtta på intubation apparaten till etablering av ventilation - var 45 ± 5 sek. 24 råttor hade en fullständig återhämtning från operationen utan tecken på andningssvårigheter eller blödning genom postoperativ dag (POD) 14. En råtta utvecklat andningssvårigheter på POD 4 och genomgick re-operation för att utforska mediastinum. Råttan befanns ha en kollapsad lungloben. Efter re-expansion av lungorna, mediastinum re-förseglad med kirurgiskt klister under övertrycksventilation och bröstet var re-stängd. Råttan återvinnas med fullt med några ytterligare andnings avvikelser. En råtta dog på POD 7 av okända orsaker.

Efter tymektomi mediastinum inspekterades för behöll bräss och bort bräss vävnaden var visually inspekteras för saknade delar och senare undersöktes histologiskt. Vid obduktion var bröstkorg vävnad undersöktes genom hematoxylin-eosin (H & E) fläck. Immunohistokemi (IHC) för cytokeratin utfördes sedan att skilja kvarlevan tymusvävnad från bröstkorg lymfkörtlar (LN), med fokus framför allt på sektioner med högre nivåer av nukleär färgning av H & E som är normalt för bräss vävnad. Cytokeratin färgning utfördes med användning av kanin-pan anti-cytokeratin som den primära ab, följt av biotinylerad get-anti-kanin-IgG och Vectastain Elite ABC Kit Glasen motfärgades med hematoxylin före mikroskopi utvärdering. Tymusvävnad kan skiljas från bröstkorg LNS genom tätare nukleär färgning på H & E (Figur 3A & 3B) och ett karaktäristiskt lacy mönster av cytokeratin färgning, vilket skiljer sig från avsaknaden av cytokeratin färgning ses i LNS (Siffror 3C och 3D).

Perifera blodproverfrån avlivade råttor analyserades med avseende ihållande utarmning av naiva T-celler. I korthet innebar detta röda blodkroppar lyserades med ACK lyserande buffert och perifera blodleukocyter (PBL) tvättades två gånger med PBS 2% FBS före färgades med antikroppar under 30 minuter vid 4 ° C. PBL fixerades därefter med 4% vikt / volym paraformaldehyd i neutralt pH-buffrad koksaltlösning före analysen med flera färger flödescytometri. Totala T-celler identifierades genom färgning PBMC (perifert blod mononukleära celler) med anti-CD45 + och CD3 +, och naiva T-celler identifierades genom färgning med anti-CD45RC, anti-CD62L och antingen anti-CD4 eller anti-CD8. Procentsatserna för varje T-cells subpopulation var multiplicerat med absolut antal lymfocyter (erhålls genom Duke Vet Clinical Diagnostic Lab) för att bestämma cellräkningar. Representativa Naiv CD4 ⁺ och CD8 ⁺ T-cell och totala T-cellsantalet visas i figur 4. Thymectomized råttor bibehålls totala T-cellantal jämfört med kontroll rATS men visade förlust av naiva T-cellpopulationer.

Figur 1. Konstruktion av intubationskanyl. Kanylen bildas genom avtrubbning änden av mandrängen av en 14 G x 2 tum angiokateter. Den distala 3 mm av stiletten är något böjd för att styra katetern ventralt att underlätta endotrakeal intubering. (A) Sidovy av metall stiletten. (B) Sidovy av angiokateter över mandrängen. (C) Förstorad bild av trubbig spets mandräng.

Figur 2. En sluttande intubation plattform används för att positionera råttan för intubering. Råttan är upphängd metallstången av intubation plattform genom dess övre framtänder. En lätt source kommer sedan att placeras ventrala till råttans hals till trans belysa svalget. Tång används för att hålla tungan och exponera öppningen i struphuvudet. (A) Ovanifrån och (B) sidovy av intubering plattform. (C) Diagram av visualisering av glottis efter suspension av råtta och exponering av larynx . Struphuvudet i diagrammet är från en bild som köpts från Motifolio.

Figur 3. H & E och cytokeratin färgning av mediastinum vävnad kan skilja tymus från lymfkörtlar. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning av en normal tymus (A) och thorax LN (B). Cytokeratin färgning av tymusvävnad (C) och en thorax LN återvunna efter tymektomi Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Slitage av perifera blod naiva T-celler efter tymektomi. Totalt T-cell, naiva CD4 + T-celler och naiva CD8 + T-celler där kvantifieras från PBL genom flödescytometri i pre-tymektomi (Pre) och råttor 4 veckor efter tymektomi (Post ). Data visas för en råtta per grupp och är representativa för de övergripande resultat som erhållits.

Discussion

Den nuvarande protokollet för fullständig tymektomi ger ett minimalt invasiv metod med en tre skikt snitt stängning med kirurgiskt lim program designat för att minimera komplikationer. Fullständigt avlägsnande av tymus demonstrerades genom förlusten av naiva T-celler och genom IHC färgning av mediastinum lymfvävnad för cytokeratin.

Proceduren i vuxen råtta tymektomi har komplicerats av dödligheten från 1,5 - 20% på grund av peri-operativa komplikationer, varav de flesta är det hänförliga till den intima föreningen av de lägre lober bräss med lungsäcken, hjärtat och stora mediastinum fartyg ^2-4. Öppna trakealintubation tekniker, där luftstrupen är punkterade, har en 6% dödlighet ^2. Användningen av icke-invasiv intubation har rapporterats av Na och medarbetare; var dock överlevnaden inte rapporterats ^5. Intubering med kanylen som framställts såsom beskrivits härmed transkutan trakeal belysning möjliggör tydlig visualisering av stämbanden för konsekvent framgångsrika intubations. Det behövs ingen avancerad utrustning för den presenterade metoden, som skiljer sig från andra rapporterade icke-invasiva tekniker ^{2,5- 8.} Vår metod för avtrubbning slutet på en angiokateter nål och skapar en uppåtriktad krök i slutet gör det lättare att undvika oavsiktlig esofagus intubation och minimerar trakeal trauma. Dessa är förbättringar av en tidigare beskriven metod för intubation också användning av en modifierad angiokateter ^9.

Vi finner att hålla sternala snitt till ett minimum minskar kontakt med stora mediastinum fartyg och tillhörande risk för blödning samtidigt som adekvat exponering för fullständigt avlägsnande av tymus. Teoretiskt bör mindre snitt också minska postprocedursmärta och återhämtningstid. Användningen av fibrinlim rapporterades först som en variant av en öppen trakealintubationförfarandet för att förhindra pneumothorax och luftvägsskada ^2. Vi har funnit att tillämpningen av en liten mängd av lim över de suture pre-trakeala muskler medan anbringa övertryck tätar adekvat pleurahålan och hjälper till att förhindra postoperativa andningskomplikationer.

Det finns några aspekter av protokoll som är viktiga att lyfta fram så proceduren kan utföras med framgång. Det är viktigt att säkra anestesi rör med tillräcklig tejp eftersom det är möjligt att koppla ur gasflödet under operationen som kirurgens händer är placerade nära råttans huvud och visualisering fokuserar enbart på operationsområdet under mikroskop. Den minsta möjliga smörjning appliceras kanylen före intubation förhindrar kanylen glider in i matstrupen. Under den flerskiktiga förslutning, bidrar den också att applicera cyanoakrylat vävnadsadhesiv genom en liten gauge-nål med en spruta, som möjliggör exakt applicering och förhindrar oavsiktlig över applicering av lim.

Detta förfarande tillåter inte åter vaskularisering av det borttagna bräss i en mottagare råtta, vilket har beskrivits på annan plats ^10. Vi också inte försöka detta förfarande i möss, som ofta används för immunstudier. De senaste beskrivningar av tymektomi förfarandet i vuxna möss omfattar antingen vakuumaspiration av tymus efter exponering, som har hög komplikationsfrekvens hos vuxna råttor, eller en dissektion metod som liknar vårt förfarande ^11,12. Stängningen utförs inte i skikt, och anestesi uppnås genom intraperitoneal injektion av pentobarbital, vilket påbjuder inte intubering. De viktigaste begränsningarna för tymektomi förfarandet i alla gnagare är kravet på ett operationsmikroskop, vilket kan vara mycket dyrt, och den tekniska expertis som krävs för att arbeta under förstoring och utföra proceduren snabbt.

innehåll "> Komplett tymektomi hos vuxna råttor underlättar immunologiska studier med T-cellsutveckling, T-cells reaktivitet och tolerans vid transplantation och tumörstudier och studier med T-celler hos atymiska råttor ^{13- 15.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 inch 14 G angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator) and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity fiber optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35