Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

doi: 10.3791/52161 Published: December 10, 2014

Abstract

היעילות של פרוטוקולי מיצוי DNA יכולה להיות תלויה במידה רבה על שני הסוג של מדגם נחקר והסוגים של ניתוחים שבוצעו במורד הזרם. בהתחשב בכך שהשימוש בטכניקות חדשות ניתוח קהילת חיידקים (למשל, microbiomics, metagenomics) הופך נפוץ יותר במדעי החקלאות ואיכות הסביבה, ורבים דגימות סביבתיות בתוך דיסציפלינות אלה יכולים להיות physiochemically וmicrobiologically ייחודי (לדוגמא, צואה ודגימות חול / מצעים מ ספקטרום ייצור העופות), שיטות מיצוי DNA מתאימות ויעילות צריכה להיות שנבחרו בקפידה. לכן, שיטת מיצוי DNA ההיברידי אוטומטית-למחצה רומן פותחה במיוחד לשימוש עם דגימות ייצור עופות סביבתיים. שיטה זו היא שילוב של שני סוגים העיקריים של מיצוי DNA: מכאני והאנזימטית. צעד הומוגניזציה מכאנית אינטנסיבי דו-שלבים (באמצעות חרוז הכאה גיבש במיוחד עבור לסביבהדגימות טל) התווספה לתחילתה של השיטה "תקן זהב" האנזימטית מיצוי DNA לדגימות צואה כדי לשפר את ההסרה של חיידקים וDNA ממטריצת המדגם ולשפר את ההתאוששות של חברי קהילת חיידקים גראם-חיוביים. ברגע שחלק החילוץ האנזימטית של השיטה ההיברידית יזם, תהליך הטיהור שנותר היה אוטומטי באמצעות תחנת עבודה רובוטית כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית מדגם מדגם שגיאת עיבוד. בהשוואה לשיטות מיצוי DNA המכנית והאנזימטית הקפדניות, השיטה ההיברידית הרומן הזה סיפק את הביצועים הטובים ביותר בשילוב כולל כאשר שוקלים כמותי (באמצעות 16S rRNA qPCR) ואיכותי (באמצעות microbiomics) ערכות של קהילות חיידקים הכוללת עת עיבוד צואת עופות ודגימות חול .

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Homogenization מכאני של דוגמאות ייצור עופות הסביבה

  1. לפני המיצוי, להגדיר אמבט מים עד 95 ° C ולאפשר זמן אמבט מים כדי להגיע לטמפרטורה זו.
  2. לשקול את 0.33 גרם של אדמה או חומר צואתי לתוך צינור lysing מטריקס E 2 מיליליטר.
    1. לא יעלה על 0.33 גרם של מדגם בצינור, שכן זה יגרום הפתרונות הבאים למעבר לקיבולת של הצינור.
    2. דגימות הפשרה קפוא לRT לפני השקילה.
    3. על מנת לנתח את כולל של 1 גרם של אדמה / צואה, שוקל 3 מ- לשכפל 0.33 דגימות g עבור כל דגימה סביבתית בודדת.
    4. חנות דגימות ב -20 ° C בתוך צינורות מטריצת חרוטי לפני המיצוי, במידת צורך.
  3. להוסיף 825 μl סודיום פוספט הצפת וμl 275 של פתרון PLS לצינור מדגם. מערבבים בעזרת מערבולת ל~ 15 שניות ואז צנטריפוגות הדגימות 14,000 XG במשך 5 דקות.
  4. למזוג supernatant ולהוסיף 700 μl של הצפת ASL. מערבבים בעזרת מערבולת במשך 5 שניות.
    1. ודא שיש אמיץ (10% נפח כולל ~) זמין בצינור חרוטי בשלב זה. אם אין אמיץ, הצינורות יהיו נטייה לדלוף במהלך שלב הומוגניזציה הבא שעלולות להוביל לזיהום צולב ו / או הפסד מדגם.
  5. מניחים את הדגימות למכשיר 24 FastPrep, וhomogenize הדגימות במהירות של 6.0 מ '/ שנייה למשך 40 שניות.
  6. צנטריפוגה המדגם הומוגני 14,000 XG במשך 5 דקות. מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge 2 מיליליטר סטרילי.
  7. על מנת למקסם את התאוששות DNA מן המדגם, חזור על שלבים 1.4-1.6, המשלבים את supernatants לתוך צינור microcentrifuge, 2 מיליליטר סטרילי.

2. אנזימתי עיכוב של המעכבים מhomogenates לדוגמא

הערה: פרוטוקול זה משתמש בערכת QIAamp DNA הצואה Mini.

  1. דגירהsupernatant באמבט מים C ° 95 במשך 5 דקות על מנת למקסם את התאוששות DNA מכל תאים שנותרו בתוך supernatant.
    1. לדגור על 70 מעלות צלזיוס למשך דגימות המכילות אורגניזמים בעיקר גראם שליליים. עם זאת, אם אורגניזמים גראם חיוביים נמצאים (שהוא במקרה עם דגימות צואה עופות), דגירה על 95 מעלות צלזיוס.
    2. השתמש בקליפים פלסטיק נעילה על צינורות microcentrifuge כדי להבטיח שהצינורות לא "פופ" פתוחים ואפשרות לאבד נפח דגימה כלחץ יכול להצטבר בצינורות microcentrifuge האטומים אלה.
  2. פתח כל צינור microcentrifuge כדי לשחרר את הלחץ, צינורות microcentrifuge מחדש כובע ומערבבים בעזרת מערבולת במשך 15 שניות.
  3. צנטריפוגה מדגם 14,000 XG דקות 1, להסיר 1.2 מיליליטר של supernatant ולמקם אותו לתוך צינור סטרילי חדש 2 מיליליטר microcentrifuge.
  4. הוסף 1 כרטיסיית InhibitEx מדגם זה, ומערבבים בעזרת מערבולת עד המדגם הופך נוזל אחיד לבן / off-לבן.
    1. הימנע touching כרטיסיית InhibitEx תוך שימה אותו לתוך צינור microcentrifuge המכיל את המדגם. כדי להשיג זאת, הנח את חבילת השלפוחית ​​המכילה את הכרטיסייה ישירות על צינור microcentrifuge הפתוח ודחף בעדינות את הכרטיסייה מחפיסת השלפוחית ​​ולתוך צינור microcentrifuge.
  5. דגירה המדגם 1 דקות בRT (~ 25 מעלות צלזיוס) וצנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות.
  6. להעביר את כל הנוזל לצינור סטרילי 1.5 מיליליטר microcentrifuge ו צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות.
    1. הימנע מכל חלקיקים שנותרו שאולי pelleted בתחתית צינור microcentrifuge בסוף השלב 2.5 בעת העברת הנוזל.

3. אוטומטי DNA טיהור באמצעות QIAcube רובוטית Workstation

הערה: מספר מתכלה פלסטיק, ההסדר של מתאמי הרוטור מדגם בתוך צנטריפוגות, וכרכים הנדרשים ממאגרים / הפתרונות תלויים בnumבער של דגימות שמתנהלות.

  1. להוסיף צינורות elution וצינורות מסנן לחריצים המתאימים במתאמי הרוטור. עבור כל דגימה, להוסיף 400 μl לחריץ אמצע מתאם הרוטור. הנח את מתאמי הרוטור בצנטריפוגה תחנת העבודה בהסדר הנכון בהתאם למספר הדגימות מטוהר.
    1. ודא שכל מכסי צינור microcentrifuge מאובטחים כראוי בתוך מתאם הרוטור מאז כישלון לעשות זאת עלולה לגרום לגז באחד משלבי צנטריפוגה של פרוטוקול הטיהור.
  2. הוסף את המספר הדרוש של 1,000 μl ו -200 μl מסנן-טיפים לתחנת העבודה, ולמלא את בקבוקי חיץ המסופקים עם הנפח הנדרש לאחסון.
    הערה: כל המאגרים הנדרשים לפרוטוקול טיהור זה (AL, AW1, Aw2, וAE) נמצאים בתוך ערכת QIAamp DNA הצואה Mini. המשתמש צריך לספק אתנול 100% מה שצריך לbu AWffers וכפתרון המשמש בתהליך הטיהור.
  3. הוסף את הנפח הנדרש של פתרון K proteinase סיפק לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל ומניח אותו לחריץ בתחנת העבודה. כמו כן, להוסיף את המספר הנדרש (שווה למספר של דגימות מטוהרות) של RB צינורות מדגם microcentrifuge בטוח נעילת 2 מיליליטר לסעיף שייקר של תחנת העבודה.
    1. ודא שהמכסים של צינורות המדגם ממוקמים באופן מאובטח לחריצים המתאימים בתחנת העבודה, מאז כישלון לעשות זאת תגרום לשגיאה כאשר המכונה בתחילה סורק את תחנת העבודה כדי לוודא שכל הפלסטיק והנוזלים הדרושים זמינים לבקש לרוץ.
  4. שימוש במסך המגע בתחנת העבודה, בחר בצואת DNA - צואה אדם - פתוגן איתור פרוטוקול, וקרא במסכים הבאים כדי להבטיח שתחנת העבודה הייתה טעונה בצורה נכונה. ברגע שכל מסכי הבדיקה מועברים, בחר התחל לרוץ בפרוטוקול זה.
    1. אם חילוץ DNA יותר מ 12 דגימות, להתחיל בתהליך הומוגניזציה (שלב 1) לסדרה הבאה של דגימות, מאז ריצה של 12 דגימות לוקחת ~ 72 דקות כדי להשלים בתחנת העבודה.
  5. הסר את הדגימות ממתאמי הרוטור, כובעם, ומקום ב -20 ° C עד צורך לניתוחים במורד הזרם שלאחר מכן.
    1. בשלב זה, לשלב את purifications לשכפל 3 למדגם בודד (סכום כולל = 1 גרם ניתחו) באמצעות מערכת צנטריפוגה / מבוסס אידוי. מערבבים את משכפל מחדש elute לנפח סופי של של חיץ טריס-ETDA 100 μl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במחקר זה, גללי צואה טריים ודגימות חול שהתאוששו מבית מסחרי פטם (~ 25,000 ציפורים) בדרום-מערב ארה"ב. הפטמים (גאלוס גאלוס) היו קוב-500 חוצים, והם היו בני 59 ימים בזמן הדגימה. דגימות צואה וחול טריות היו התאוששו מארבעה אזורים שונים בתוך הבית (ליד קירור כרית, בקרבת קווי Waterer / המזין, בין שורות Waterer / מזין, וליד אוהדי פליטה), ודגימות מכל אחד מהתחומים הללו הכילו חמישה במאגר דגימות מתוך אזור זה. דוגמאות מארבעת תחומי הבית חולצו וכמותית / איכותי ניתחו בנפרד בהתאם לסוג מדגם (צואה או המלטה). הנתונים שלהלן מייצגים את הערכים הממוצעים לכל הבית לשני סוגים סביבתיים המדגם.

שכיחות כוללת 16S rDNA, הערכה של קהילת החיידקים הכוללת הכלולה במדגם, נקבעה באמצעות לפרסם בעברפרוטוקול ed qPCR 20, וערכים היו מנורמלים באמצעות כמות ה- DNA התאוששה מכל שיטת חילוץ (המבוסס על ניתוח fluorometric שתואר קודם לכן 21. מבין שלוש שיטות חילוץ, איור 1 מראה כי השיטה המכנית הניתנת כולל השפע המנורמל החיידקים הגבוהים ביותר באופן עקבי הגן אומדנים לשתי דגימות צואה ואשפה (5.85 ± 0.16 5.56 ± 0.08 והיומן 10 עותקי 16S rDNA ng -1 DNA שחולץ, בהתאמה), ואילו, השיטה האנזימטית סיפקה בעקביות הערכות הצואה ופסולת הנמוכה ביותר (4.83 ± 0.54 4.61 ± ו 0.13 יומן 10 עותקי 16S rDNA NG -1 DNA שחולץ, בהתאמה). שיטת החילוץ היברידי הרומן הניבו שכיחותם 16S rDNA מנורמלת שנמצאו באופן מובהק (p ≤ 0.05) גבוה יותר מאשר בשיטה אנזימטית, אבל מבחינה סטטיסטית דומה לשיטה המכנית ל שתי דגימות צואה ואשפה (5.50 ± 0.16 ו5.23 ± 0.14 יומן 10 עותקי 16S rDNA ng -1 DNA שחולץ, בהתאמה). לכן, שתי שיטות החילוץ מכאניות והיברידיות הניתנות הערכה איכותית יותר של קהילות חיידקים הכוללת בתוך דגימות אלה מאשר בשיטה אנזימטית.

על מנת להעריך את קהילות חיידקים הכוללת איכותי מכל סוג מדגם ושיטת חילוץ, העבודה microbiomic כפי שנסקר בNavas-מולינה et al. (2013) 22 היו בשימוש. בקיצור, אזור V4 של גן 16S rRNA היה PCR מוגבר עם פריימרים המכילים מתאמי רצף MiSeq ורקודים Golay ורצף על פלטפורמת Illumina MiSeq 23,24. נתוני רצף גלם היה מעובד מכן בQIIME 25,26,27 1.7.0-dev באמצעות הפרמטרים של ברירת המחדל. עיבוד נתונים רצף כלול: איכות סינון; אשכולות OTU (פתוחה התייחסות בסף 97%) באמצעות 27 UCLUST; רמת סינון שפע OTU של <0.005% 2231,; משימת טקסונומיה באמצעות מסווג RDP מול מסד נתוני התייחסות Greengenes 13_5 28; יישור רצף עם PyNAST 29 נגד ליבת Greengenes להגדיר 28; בניית עץ פילוגנטי באמצעות 30 FastTree. תסריט core_diversity_analyses.py שימש כדי להפעיל את כל מדדי הגיוון בטא אלפא וליצור את כל החלקות, תרשימים, וסטטיסטיקה בעומק רצף של 7865 רצפים לדגימה.

שיטת מיצוי DNA שנבחרה הציגה השפעה ברורה על microbiomes הצואה וההמלטה התאושש. החל ברמה-מַעֲרָכָה (טבלה 1), נתונים הכוללים (המהווה כ שני דגימות צואה ואשפה) גילו כי שיטות בעל הצעד ההרסני ביותר הומוגניזציה (מכאני, היברידי) קהילות הניבו בדרך כלל עם שכיחות גבוהה יותר של טווח מערכת חיובית גרם (98.0 ו97.49%, בהתאמה) ביחס לשיטה האנזימטית (81.74%). לעומת זאת, מערכת נוספת גראם שליליייצגתי חלק גדול בהרבה של קהילת החיידקים הכללית התאוששה מהשיטה האנזימטית (17.49%) בהשוואה לשתי השיטות מכאניות (1.89%) או היברידי (2.38%). השפעה זו חילוץ ההפרש בפרופילי microbiomic הכוללים ושכיחותם של אורגניזמים שליליים גרם גראם-חיוביים והודגמו יעילות ברמת הסוג (איור 2) .the שיטות מכאניות והיברידיות המיוצרים על פרופילי microbiomic יחסית דומים, ואילו Microbiome השיטה האנזימטית הראה הפצה שונה של השפע היחסי של המינים התאוששו. לדוגמא, Alistipes גראם שלילי spp.in דגימות הצואה (הגוש האדום עם; 7.71% מקהילת סך הכל) הופק באמצעות השיטה אנזימטית מופחתת באופן חמור בטביעות האצבעות לשתי שיטות החילוץ האחרות (חצים אדומים; 0.47 -.81%), אבל spp Lactobacillus גרם-חיובי. (בלוק סגול גדול עם L) היה הרבה יותר נפוץ הוא מופחת בעת השימוש בEnzשיטת ymatic (42.71%) בהשוואה לשיטות מכאניות או היברידיות (57.22% 61.85% ו, בהתאמה). עם זאת, בעוד ששכיחותם היחסית של המינים הציגה כמה הבדלים בין שיטות חילוץ שלוש, המספר הכולל של מינים שנמצאו היה דומים בכל שלוש השיטות לשני (92 מתוך 112 מינים) בצואה ואשפה (96 מתוך 112 מינים).

השיטה האנזימטית הניבה באופן עקבי קהילות חיידקים עם העושר הגדול ביותר, הגיוון, והשוויון (באמצעות chao1, פילוגנטי הגיוון, ומדדי שוויוניות, בהתאמה) עבור שתי דגימות צואה ואשפה, עם השיטה המכנית מראים באופן עקבי ההערכות הנמוכים ביותר עבור אקולוגי אלה פרמטרים (טבלה 2). השיטה ההיברידית הפגינה בעקביות מדדים אקולוגיים מתווך לשתי שיטות האחרות. מבחינה סטטיסטית, הערכות אקולוגיות מכל המדגמים, ללא קשר לשיטת חילוץ, נמצאו דומה, אם כי שיטה האנזימטיתלא לגרום ל( p = 0.045) Microbiome עשיר יותר באופן משמעותי בהשוואה לשיטה המכנית בעת ניתוח דגימות ההמלטה. אמנם אין הבדלים משמעותיים אחרים נמצאו בין שיטות חילוץ, ההבדלים הגדולים ביותר בין הפרמטרים האקולוגיים נמצאו בדרך כלל בין האנזימטית ושיטות מכאניות, עם השיטה ההיברידית ביצוע באותה המידה גם לשתי שיטות האחרות; בדומה להערכה כמותית של שיטות חילוץ אלה (איור 1).

איור 1
איור 1. השוואת קהילת חיידקים איכותית המבוסס על שיטות מיצוי DNA. עמודות מייצגות את הממוצע להיכנס 10 -transformmed עותקי גן 16S rRNA כפי שנקבע על ידי qPCR מנורמל כנגד הסכום של DNA התאוששו מ( ברים מוצקים) בצואה או המלטה (ברים מקווקוים) מדגם ( המבוסס על נחישות fluorometric). השיטת מיצוי DNA דואר משמשת להשגת ערכים אלה מצוין על ציר x. הברים השגיאה מייצגים סטיית התקן בין 4 דגימות לשכפל. לכל סוג מדגם (צואה או זבל), האותיות מעל לעמודים מייצגות אמצעים שונים באופן משמעותי המבוססת על ניתוח בכיוון אחד ANOVA באמצעות הבדיקה של Tukey מרובה השוואה (p = 0.05).

איור 2
השוואה ברמת סוג 2. איור microbiomic מהשיטות מיצוי DNA. כל עמודה מייצגת את הקהילה הממוצעת כוללת חיידקים (המבוססת על גן 16S rRNA נתונים Illumina MiSeq) של מינים התאוששו עבור כל שיטת חילוץ לצואה (שלושה עמודים הראשונים) והמלטה ( שלוש עמודות דגימות שעברה). כל עמודה מייצגת את הממוצע של ארבע דגימות שונות מאזורים שונים בתוך בית הפטם. המכתב בבסיס העמודות מציין את extrשיטת פעולה (M = מכאני, E = אנזימתי, H = Hybrid). הצבעים השונים בכל טור מייצגים את השפע היחסי של סוג בתוך הקהילה הכללית, וצבע לכל genera הוא זהה עבור כל העמודות.

טבלת 1
השוואת רמה-פילוס 1. שולחן microbiomic של שיטות מיצוי DNA. שכיחות יחסית (סה"כ% התאוששו רצפים) לכל אחת משיטות מיצוי DNA של 2 גרם-החיובי (Actinomycetes וFirmicutes) ו -3 גרם-שלילית (Bacteriodetes, פרוטאובקטריה, Tenericutes) טווח מערכת התאושש מניתוח microbiomic משני סוגי הדגימות.

טבלה 2
טבלה 2. השוואות Pairwise של ichness r, גיוון, ואומדני שוויון לשיטות חילוץ שלושה DNA המבוססות על קהילת חיידקי microbiomic רמה-סוג ניתוחים באמצעות QIIME. עבור שני סוגי המדגם, השוואות pairwise בוצעו במשך שלושה שילובי שיטת חילוץ אפשריים. הפרמטרים קהילת החיידקים הכולל הוערכו כוללים עושר (α-גיוון מבוסס על נתון chao1), גיוון (β-גיוון מבוסס על נתון פילוגנטי הגיוון), ושוויון (המבוסס על נתון השוויוניות). ערכים מייצגים את הממוצע (סטיית התקן) של 4 דגימות שונות אזור בתוך בית הפטם, וα = 0.05 רמה שימשה לקביעת משמעות בין השוואות pairwise. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיטת מיצוי DNA משמשת בוצעה הערכות חיידקים כוללת כמותיים ואיכותיות הקהילה לשתי דגימות הצואה והמלטה, התומך במדגם מנתח טבע תלוי בשיטות מיצוי DNA ראה בעבר 1,3,6. עבור שני דגימות צואה והמלטה, סדר ביצועים של שיטות מיצוי DNA היה שונה עבור כמותית (מכאני> היברידי> אנזימתי) ו(> ההיברידית אנזימתי> מכאני) האיכותית הכוללת הערכות קהילת חיידקים. בעוד השיטה ההיברידית לא לייצר האומדנים כמותיים או איכותיים הגבוהים ביותר, בשני המקרים בשיטה ההיברידית הניבה תוצאות שהיו מבחינה סטטיסטית דומים לשיטת הגבוהה ביותר ביצוע החילוץ (איור 1, הטבלה 2), ובכך לייצר את השילוב הטוב ביותר בסך הכל איכותי וכמותיים הערכות קהילת חיידקים מהשיטות המיצוי שלוש נבדקו. זה צריך ne ציין כי profil קהילת חיידקיםes יכול להתבצע בחום על ידי שיטת מיצוי DNA, כפי שניתן לראות בתוצאות ממחקר זה (איור 2, טבלת 1) ומחקרים קודמים אחרים באמצעות דגימות סביבתיות 4,5,8,9,11,12, והשפעות שונות אלה בתוקף רשאי להשפיע על הניתוח והפרשנות של נתוני המחקר. ידיעה זו, חוקרים חייבים מאוד לשקול את שיטת החילוץ המתאימה לסוגי המדגם שלהם ומטרות ניסוי על בסיס מחקר-ידי הלימוד.

צעד מפתח ליעילות של השיטה ההיברידית רומן הוא הצעד החזק הומוגניזציה כדי לסייע באופן משמעותי בכך שלא רק השחרור של תאים חיידקיים מהמטריצות / אדמת צואה המורכבת, אלא גם כדי לשבור את קירות תא קשים של חברי קהילת גראם חיוביים . אומדנים כמותיים גבוהים יותר (איור 1) ושיעור גבוה יותר של גראם-החיובי Actinobacteria וFirmicutes בתוך microbiomes לשתי שיטות המיצוי שמשמשים צעד הומוגניזציה זו ( 1,2,4-6,9. ברגע שהתאים ו / או DNA הם מנתקים את / שוחררו ממטריצות אלה, השימוש במתודולוגיה האנזימטית "תקן זהב" בשיטה ההיברידית יעילות מטהרת את ה- DNA מדגימות אלה. הכללת הצעד מחייב מעכב מהשיטה אנזימטית בתוך פרוטוקול החילוץ ההיברידי מאפשרת להסרה יעילה יותר של המעכבים הנוכחיים בתוך הדגימות הסביבתיות המורכבות המשמשות במחקר זה. צעד זה שנעדר מפרוטוקול החילוץ המכני. לכן, שיטת החילוץ ההיברידי, עם התוספת של צעד הומוגניזציה מכאני בשיתוף עם purificat האנזימטיתיון של ה- DNA שפורסם, הוא שיטה יעילה להערכת קהילות חיידקים הכוללת מדגימות ייצור עופות סביבתיים.

שיטה זו, כפי שתוארה, מכילה כמה דרישות ספציפיות של שמשתמשים צריכים להיות מודע. ראשון הוא השימוש בhomogenizer רב עוצמה, כמו גם חלק מרכיבים של ערכת חילוץ זמינה מסחרי. מחקרים קודמים הראו כי צעדי חרוז-מכות מכאניות אחרים או homogenizers עוצמה לשפר את יעילות מיצוי DNA ולהניב 4,5,9; לכן, סוג של צעד הומוגניזציה מכאני שונה יכול להשתלב בשיטת החילוץ ההיברידי (אם כי ייתכן שיהיה צורך בשימוש בציוד מיוחד שונה). השיטה ההיברידית המתוארות כאן משתמשת גם הצינורות להכות-חרוז שתוכננו במיוחד עבור homogenizer וספציפי לדגימות סביבתיות בשל ההצלחה של מטריצת lysing זה במחקרים מבוססים-קהילה קודמים מדגימות עופות 15, 31-33. לבסוף, "תקן הזהב" שיטת מיצוי DNA האנזימטית (QIAamp DNA הצואה Mini Kit) נדרש לטיהור האנזימטית של ה- DNA המדגם בפרוטוקול ההיברידי, שכן הוא הוכח להיות שיטת החילוץ האנזימטית היעילה ביותר בעת שימוש בדגימות צואה 3,18,19. בעוד שהשימוש בתחנת העבודה רובוטית לא נדרש (יכולים להתבצע על ידי יד הוראות בערכה), השימוש בתחנת העבודה רובוטית מגדילה מאוד את התפוקה, מקטינה שגיאת עיבוד, ותוצאות בDNA באיכות גבוהה יותר לניתוח נוסף במורד הזרם 7. אוטומציה מסוג זה, תוך שימוש בערכות מכאניות הקיימות אינה זמינה כעת, המייצגת את יתרון נוסף של השיטה ההיברידית.

נכון לעכשיו, תחנת העבודה רובוטית שתוארה בפרוטוקול זה מוגבל לעיבוד מרבי של 12 דגימות ב -72 דקות, אבל עבודה ראשונית הראתה כי שיטה זו עובדת באותה המידה גם בworkstati התפוקה גבוהה יותרשביכול לעבד 96 דגימות בתוך 40 דקות (מידע לא מוצג). בדיקה נוספת של אפשרות תפוקה הרבה יותר גבוהה זה תהיה מאוד לשפר את היעילות של השיטה ההיברידית מאז יותר דגימות יכולות להיות מעובד באופן אוטומטי למחצה בתוך יום טיפוסי. כמו כן, נתונים ראשוניים בשיטת מיצוי DNA הרומן הזה הראו שהוא יעיל עבור דגימות הקשורות לעופות אחרים (למשל, שטיפות עור / נוצה, שטיפות פגר, homogenates תוכן cecal), כמו גם סוגים אחרים של דגימות סביבתיות (למשל, קרקעות חקלאיות , צואת חזירים, צואת סוסים, צואה עז, צואת שור). לכן, מחקרים עתידיים יצטרכו לקבוע את היעילות של שיטה היברידית זה להפקת DNA מהרבה דוגמאות חקלאיות וסביבתיות. אימות נוספת של שיטה זו על ידי מחקרים עתידיים שעלולה לאפשר לאימוץ רחב יותר של שיטה זו להערכת קהילות חיידקים הכוללת ממגוון רחב של הגדרות חקלאיות וסביבתיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix E tube MPBio 6914-050 Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate Solution MPBio 6570-205 Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS Buffer MPBio 6570-201
Buffer ASL (560 ml) Qiagen 19082
FastPrep 24 homogenizer MPBio 116004500 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini Kit Qiagen 51504
QIAcube24 (110V) Qiagen 9001292 Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024) Qiagen 990352
Filter-Tips, 200 ml (1024) Qiagen 990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) Qiagen 990394 For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml) Qiagen 990381 Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L., Gamble, J., Caudill, A. C., Cicconi-Hogan, K. M., Caporaso, J. G. A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples. J. Vis. Exp. (94), e52161, doi:10.3791/52161 (2014).More

Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L., Gamble, J., Caudill, A. C., Cicconi-Hogan, K. M., Caporaso, J. G. A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples. J. Vis. Exp. (94), e52161, doi:10.3791/52161 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter