Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En hybrid DNA Extraction Metode til kvalitativ og kvantitativ vurdering af bakteriel Fællesskabers fra fjerkræproduktion Prøver

doi: 10.3791/52161 Published: December 10, 2014

Abstract

Effekten af ​​DNA-ekstraktion protokoller kan være meget afhængig af både typen af ​​prøven, der undersøges, og de typer af downstream analyser udføres. I betragtning af at anvendelsen af nye bakterielle samfund analyseteknikker (f.eks microbiomics, metagenomet) bliver mere og mere udbredt i landbrugs- og miljømæssige videnskaber og mange miljøprøver inden for disse discipliner kan være fysisk-kemisk og mikrobiologisk unik (f.eks fækal og strøelse / sengetøj prøver fra den fjerkræproduktion spektrum), skal nøje udvalgt passende og effektive DNA ekstraktionsmetoder. Derfor er en ny halvautomatisk hybrid DNA-ekstraktion metode er udviklet specielt til brug med miljømæssig fjerkræproduktion prøver. Denne metode er en kombination af de to hovedtyper af DNA-ekstraktion: mekanisk og enzymatisk. En to-trins intens mekanisk homogeniseringstrin (ved hjælp af perle-Beating specielt sammensat til milTal prøver) blev sat til begyndelsen af ​​"gold standard" enzymatisk DNA-ekstraktion metode til fækale prøver at øge fjernelsen af ​​bakterier og DNA fra prøven matrix og forbedre inddrivelsen af ​​grampositive bakterielle medlemmer af fællesskabet. Når den enzymatiske ekstraktion del af hybrid metode blev indledt, blev den resterende rensningsprocessen automatiseres ved hjælp af en robot arbejdsstation at øge produktivitet og reducere prøve behandling fejl. I forhold til de strenge mekaniske og enzymatiske DNA ekstraktionsmetoder, denne roman hybrid metode, forudsat den bedste samlede kombinerede ydeevne, når de overvejer kvantitativ (ved hjælp af 16S rRNA qPCR) og kvalitativ (ved hjælp microbiomics) skøn over de samlede bakterielle samfund, når de behandler fjerkræ afføring og strøelse prøver .

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Mekanisk Homogenisering af Environmental fjerkræproduktion Prøver

  1. Forud for ekstraktion, indstille et vandbad til 95 ° C og lade vandbad tid til at nå denne temperatur.
  2. Afvej 0,33 g jord eller fækalt materiale i en 2 ml lyserende Matrix E rør.
    1. Ikke overstige 0,33 g af prøven i røret, da dette vil medføre følgende løsninger for at overstige kapaciteten af ​​røret.
    2. Optø frosne prøver til RT før vejning.
    3. For at analysere alt 1 g jord / afføring, afvejes 3 replikere 0,33 g prøver for hver enkelt miljømæssig prøve.
    4. Opbevar prøver ved -20 ° C inden for de koniske matrix rør før ekstraktion, hvis nødvendigt.
  3. Tilføj 825 pi Sodium Phosphate Buffer og 275 pi PLS løsning på et prøveglas. Bland ved hjælp af en vortex for ~ 15 sek og centrifugeres prøverne ved 14.000 x g i 5 min.
  4. Dekanteres supernatant og tilføje 700 pi Buffer ASL. Bland ved hjælp af en vortex i 5 sek.
    1. Sørg for at der er headspace (~ 10% total volumen) til rådighed i konisk rør på dette punkt. Hvis der ikke er headspace, vil rørene have en tendens til at lække under den næste homogeniseringstrin hvilket kunne føre til krydskontaminering og / eller prøve tab.
  5. Placer prøver til et FastPrep 24 Instrument, og homogeniseres prøverne med en hastighed på 6,0 m / sek i 40 sek.
  6. Centrifugeres den homogeniserede prøve ved 14.000 xg i 5 min. Overfør supernatanten til et sterilt 2 ml mikrocentrifugerør.
  7. For at maksimere DNA opsving fra prøven, skal du gentage trin 1,4-1,6, der kombinerer supernatanterne i den samme sterile, 2 ml mikrocentrifugerør.

2. Enzymatisk Hæmning af inhibitorer fra Sample Homogenater

BEMÆRK: Denne protokol bruger QIAamp DNA Stool Mini Kit.

  1. Inkubérsupernatant i et 95 ° C vandbad i 5 minutter for at maksimere DNA genvinding fra de resterende celler i supernatanten.
    1. Der inkuberes ved 70 ° C i prøver indeholdende hovedsagelig gramnegative organismer. Men hvis Gram-positive organismer er til stede (hvilket er tilfældet med fjerkræ fækale prøver), inkuberes ved 95 ° C.
    2. Brug plastik låse clips på mikrocentrifugerør at sikre, at rørene ikke vil "pop" åben og potentielt miste prøvevolumen som tryk kan opbygges i disse lukkede mikrocentrifugerør.
  2. Åben hver mikrocentrifugerør at frigive tryk, re-cap af mikrocentrifugerør og bland ved hjælp af en vortex i 15 sek.
  3. Centrifugeres prøven ved 14.000 x g i 1 min, fjerne 1,2 ml af supernatanten og placere det i en ny steril 2 ml mikrocentrifugerør.
  4. Tilføj 1 tab InhibitEx til hver prøve, og bland ved hjælp af en vortex indtil prøven bliver en ensartet hvid / råhvid væske.
    1. Undgå touching fanen InhibitEx mens placere den i mikrocentrifugerør med prøven. For at opnå dette ved at placere blisterpakningen med fanen direkte over den åbne mikrocentrifugerør og forsigtigt skubbe tappen ud af blisterpakningen og ind i mikrocentrifugerør.
  5. Prøven inkuberes i 1 min ved stuetemperatur (~ 25 ° C) og centrifugeres ved 14.000 xg i 5 min.
  6. Overfør al væske til en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 14.000 xg i 5 min.
    1. Undgå resterende partikler, som kan have pelleteret ved bunden af ​​mikrocentrifugerør ved afslutningen af ​​trin 2.5 ved overførsel af væsken.

3. Automatiseret DNA Oprensning ved hjælp af QIAcube Robotic Workstation

BEMÆRK: Antallet af plast hjælpematerialer, arrangementet af prøve rotor adaptere i centrifugen, og de nødvendige mængder af de buffere / løsninger er afhængige af numtallet af prøver, der køres.

  1. Tilføj elueringsrørene og filterrør til de relevante slots i rotoren adaptere. For hver prøve, tilsættes 400 pi til midten slot af rotoren adapter. Placer rotoren adaptere i arbejdsstationen centrifuge i korrekt arrangement i forhold til antallet af prøver, der renses.
    1. Sørg for, at alle de mikrocentrifugerør låg sidder ordentligt fast i rotoren adapter, da en undladelse heraf kan resultere i forskydning under en af ​​centrifugeringsfaciliteterne trin i oprensningen protokollen.
  2. Tilføj det nødvendige antal på 1.000 pi og 200 pi filter-tips til arbejdsstationen, og fylde den medfølgende buffer flasker med den nødvendige mængde buffere.
    BEMÆRK: buffere kræves for denne rensning protokol (AL, AW1, AW2, og AE) er alle indeholdt i QIAamp DNA Stool Mini Kit. Brugeren skal levere 100% ethanol, der er nødvendig for AW buffers og som en opløsning, der anvendes i rensningsprocessen.
  3. Tilføj den nødvendige mængde af det leverede proteinase K-opløsning i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør og læg det i slot A på arbejdsstationen. Også tilføje det krævede antal (svarende til antallet af prøver renses) 2 ml safe-lock mikrocentrifuge prøveglas RB til shaker del af arbejdsstationen.
    1. Sørg for, at lågene på de prøveglas er forsvarligt placeret i de relevante slots på arbejdsstationen, da en modsat fald vil resultere i en fejl, når maskinen oprindeligt scanner arbejdsstationen for at sikre alle nødvendige plast og væsker er tilgængelige for den ønskede løbe.
  4. Brug den berøringsfølsomme skærm på arbejdsstationen, skal du vælge DNA Taburet - Menneske Taburet - påvisning af patogener protokol, og læse de efterfølgende skærmbilleder for at sikre, at arbejdsstationen blev indlæst korrekt. Når alle kontroller skærme er gået, skal du vælge Start for at køre denne protokol.
    1. Hvis udvinde DNA fra mere end 12 prøver, begynder homogeniseringsprocessen (trin 1) for det næste sæt af prøver, da en kørsel af 12 prøver tager ~ 72 minutter til at fuldføre på arbejdsstationen.
  5. Fjern prøverne fra rotoren adaptere, cap dem, og sted ved -20 ° C indtil brug for efterfølgende downstream analyser.
    1. På dette tidspunkt, kombinere de 3 gentagne oprensninger for en individuel prøve (samlet analyserede mængde = 1 g) under anvendelse af en centrifugering / fordampning system. Kombiner de gentagelser og re-elueres til et endeligt volumen på 100 pi Tris-ETDA buffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Til denne undersøgelse var friske fækale ekskrementer og strøelse prøver udvundet fra en kommerciel slagtekyllinger hus (~ 25.000 fugle) i den sydøstlige USA. De slagtekyllinger (Gallus gallus) var Cobb-500 krydser, og de ​​var 59 dage gammel på tidspunktet for prøveudtagningen. Friske fækale og kuld prøver blev udvundet fra fire forskellige områder i huset (nær køling pad, nær drikkekop / fødelinjer, i mellem drikkekop / fødelinjer, og nær udsugningsventilatorer), og prøver fra hvert af disse områder indeholdt fem pooled prøver fra inden for dette område. Prøver fra de fire områder af huset blev udtrukket og kvantitativt / kvalitativt analyseret særskilt efter prøvetype (fecal eller strøelse). De fremlagte data nedenfor repræsenterer middelværdier for hele huset for både miljømæssige prøvetyper.

Total 16S rDNA mængderne, et skøn over den samlede bakterielle samfund indeholdt i en prøve, blev bestemt ved hjælp af en tidligere udgiveed qPCR protokol 20, og værdier blev normaliseret under anvendelse af mængden af DNA udvundet fra hver ekstraktion metode (baseret på fluorometrisk analyse beskrevet tidligere 21. Af de tre udvindingsmetoder, Figur 1 viser, at den mekaniske metode konsekvent givet den højeste samlede bakterielle normaliseret gen overflod estimater for både de fækale og kuld prøver (5,85 ± 0,16 og 5,56 ± 0,08 log 10 16S rDNA kopier ng ​​-1 DNA ekstraheret, henholdsvis), der henviser til, den enzymatiske metode konsekvent givet de laveste fecal og kuld skøn (4,83 ± 0,54 og 4,61 ± 0,13 log 10 16S rDNA kopier ng ​​-1 DNA ekstraheret, henholdsvis). Den nye hybrid ekstraktionsmetode gav normaliserede 16S rDNA mængderne, der blev anset for at være signifikant (p ≤ 0,05) højere end den enzymatiske metode, men statistisk ligner den mekaniske metode til både fækale og kuld prøver (5,50 ± 0,16 og5.23 ± 0,14 log 10 16S rDNA kopier ng ​​-1 DNA ekstraheret, henholdsvis). Derfor er både de mekaniske og hybride ekstraktionsmetoder forudsat en større kvalitativ vurdering af den samlede bakterielle samfund i disse prøver, end den enzymatiske metode.

For at kvalitativt vurdere de samlede bakterielle samfund fra hver prøvetype og ekstraktionsmetode, den microbiomic workflow som revideret i Navas-Molina et al. (2013) 22 blev anvendt. Kort sagt, blev V4-regionen af 16S rRNA-genet PCR-amplificeret med primere indeholdende MiSeq sekventering adaptere og Golay stregkoder og sekventeret på Illumina MiSeq platformen 23,24. Rå sekventering data blev derefter behandlet i QIIME 1.7.0-dev 25,26,27 hjælp af standardparametre. Sequence databehandling inkluderet: kvalitet-filtrering; OTU klyngedannelse (åben-henvisning 97% tærskel) hjælp UCLUST 27; OTU overflod filtrering på <0,005% 2231; taksonomi opgave ved hjælp af RDP Classifier mod Greengenes 13_5 referencedatabasen 28; sekvensalignment med PyNAST 29 mod Greengenes kerne sat 28; fylogenetisk træ konstruktion ved hjælp FastTree 30. Den core_diversity_analyses.py script blev brugt til at køre alle alpha beta mangfoldighed målinger og skabe alle parceller, diagrammer og statistikker på en sekventering dybde på 7.865 sekvenser pr prøve.

Den valgte DNA-ekstraktion metode udviste en klar indflydelse på de gendannede fecal og kuld microbiomes. Start ved phylum-niveau (tabel 1), de samlede data (der tegner sig for både fækale og kuld prøver) viste, at metoder besidder den meget forstyrrende homogeniseringstrin (mekanisk, hybrid) typisk fremkommet samfund med højere mængderne af Gram-positive phyla (98,0 og 97,49%, henholdsvis) i forhold til den enzymatiske metode (81,74%). Omvendt, Gram-negative phylarepræsenterede en meget større del af den samlede bakterielle samfund udvindes fra enzymatisk metode (17,49%) i forhold til enten de mekaniske (1,89%) eller hybrid (2,38%) metoder. Denne forskel udvinding effekt på de samlede microbiomic profiler og udbredelsen af Gram-positive og Gram-negative organismer reelt demonstreret på slægten niveau (figur 2) .De mekaniske og hybride metoder produceret relativt lignende microbiomic profiler, mens den enzymatiske metode microbiome viste en anden fordeling af den relative forekomst af den genvundne taxa. For eksempel gramnegative Alistipes spp.in fæces prøver (den røde blok med A, 7,71% af det samlede samfund), der udvindes ved hjælp af den enzymatiske metode er kraftigt reduceret i de fingeraftryk til de to andre ekstraktionsmetoder (røde pile; 0,47 -0,81%), men den grampositive Lactobacillus spp. (Stor lilla blok med L) var meget mere udbredt reduceres ved brug af Enzymatic metode (42.71%) sammenlignet med de mekaniske eller hybride metoder (57,22% og 61,85%, henholdsvis). Ikke desto mindre, mens de relative mængder af taxa udviste nogle forskelle mellem de tre udvindingsmetoder, det samlede antal af taxa opdaget var ens for alle tre metoder til både det fækale (92 112 taxa) og strøelse (96 af 112 taxa).

Den enzymatiske metode konsekvent gav bakterielle samfund med størst rigdom, mangfoldighed og jævnhed (ved hjælp af chao1, Phylogenetisk mangfoldighed, og equitability målinger, henholdsvis) for både fækale og kuld prøver, med den mekaniske metode konsekvent viser de laveste skøn for disse økologiske parametre (tabel 2). Den hybride metode konsekvent demonstreret økologiske målinger formidler til de to andre metoder. Statistisk set de økologiske skøn fra alle prøver, uanset ekstraktionsmetode, fandtes at være ens, selv om enzymatisk metodeførte til et betydeligt rigere (p = 0,045) microbiome sammenlignet med den mekaniske metode ved analysen af ​​kuld prøver. Selv om der ikke fundet nogen andre væsentlige forskelle mellem udvindingsmetoder, blev de største forskelle mellem de økologiske parametre typisk findes mellem den enzymatiske og mekaniske metoder, med hybrid metode udfører lige godt til de to andre metoder; svarende til den kvantitative vurdering af disse ekstraktionsmetoder (figur 1).

Figur 1
Figur 1. Kvalitativ bakteriel community sammenligning baseret på DNA-ekstraktion metoder. Søjler repræsenterer middelværdien log 10 -transformmed 16S rRNA genkopier som bestemt ved qPCR normaliseres mod mængden af DNA udvundet fra fækale (udfyldte søjler) eller strøelse (stiplede søjler) prøve ( baseret på fluorometrisk bestemmelse). The DNA-ekstraktion metode anvendes til opnåelse af disse værdier er angivet på x-aksen. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen mellem 4 udtages. For hver prøvetype (Afføring eller strøelse), bogstaverne over søjlerne repræsenterer væsentligt forskellige midler baseret på envejs ANOVA-analyse ved hjælp af Tukeys multiple sammenligningstest (p = 0,05).

Figur 2
Figur 2. Genus-niveau microbiomic sammenligning af DNA ekstraktionsmetoder. Hver søjle repræsenterer den gennemsnitlige samlede bakterielle samfund (baseret på 16S rRNA-genet Illumina MiSeq data) genvundet taxa for hver ekstraktion metode til fæces (første tre kolonner) og strøelse ( sidste tre kolonner) prøver. Hver søjle repræsenterer gennemsnittet af fire forskellige prøver fra forskellige områder i slagtekyllinger huset. Brevet i bunden af ​​søjlerne angiver Udvindinghandling metode (M = Mekanisk, E = Enzymatisk, H = Hybrid). De forskellige farver i hver kolonne repræsenterer den relative forekomst af en slægt inden for det samlede samfund, og farve for hver slægter er den samme for alle kolonner.

Tabel 1
Tabel 1. Række-niveau microbiomic sammenligning af DNA ekstraktionsmetoder. Relative mængder (% total genvundet sekvenser) for hver DNA-ekstraktion metode 2 Gram-positive (Actinomycetes og Firmicutes) og 3 gram-negative (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) phyla udvundet fra microbiomic analyse fra begge prøver typer.

Tabel 2
Tabel 2. parvise sammenligninger af r ichness, Mangfoldighed og jævnhed estimater for de tre DNA-ekstraktion metoder baseret på genus-niveau microbiomic bakterielle samfund analyser ved hjælp QIIME. For begge prøvetyper, parvise sammenligninger blev udført for de tre mulige kombinationer udvinding metode. De samlede bakterielle community parametre vurderes indbefatter rigdom (α mangfoldighed baseret på chao1 statistik), diversitet (β mangfoldighed baseret på det fylogenetiske mangfoldighed statistik) og jævnhed (baseret på vedrørende ligebehandling statistik). Værdier repræsenterer middelværdien (standardafvigelse) på 4 forskellige area prøver i slagtekyllinger hus, og en α = 0,05 niveau blev anvendt til at bestemme signifikans mellem parvise sammenligninger. Klik her for at se en større version af denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA ekstraktion metode gennemført de kvantitative og kvalitative samlede bakterielle EF-skøn for både fækale og kuld prøver, støtte analyseresultat afhængige karakter af DNA ekstraktionsmetoder set tidligere 1,3,6. For både fækale og kuld prøver, rækkefølgen af ​​udførelsen af ​​DNA ekstraktionsmetoder var anderledes for den kvantitative (Mekanisk> Hybrid> Enzymatisk) og kvalitative (Enzymatisk> Hybrid> Mekanisk) samlede bakterielle EF-skøn. Mens hybrid metoden ikke producere den højeste kvantitative eller kvalitative skøn, i begge tilfælde hybrid metode givet resultater, der var statistisk svarer til den højeste udfører ekstraktionsmetode (figur 1, tabel 2), hvorved der frembringes den bedste kombination af kvalitative og kvantitative total bakterielle samfund skøn over de tre udvindingsmetoder afprøvet. Det skal ne bemærkes, at bakteriel samfund profiles kan stærkt udføres ved DNA-ekstraktion metode, som det ses i resultaterne fra denne undersøgelse (figur 2, tabel 1) og andre tidligere undersøgelser under anvendelse af miljøprøver 4,5,8,9,11,12 og disse differentielle virkninger kan kraftigt påvirke analyse og fortolkning af data Study. At vide dette, skal forskerne kraftigt overveje det ekstraktion metode til deres prøvetyper og eksperimentelle mål på en undersøgelse-for-undersøgelse basis.

Et vigtigt skridt på effektiviteten af ​​den nye hybrid-metoden er den kraftfulde homogeniseringstrin i høj grad at støtte i ikke kun frigivelse af bakterieceller fra de komplekse fækale / jord matricer, men også at nedbryde de skærpede cellevægge grampositive community-medlemmer . De højere kvantitative skøn (figur 1) og den højere andel af grampositive Aktinobakterier og Firmicutes inden for microbiomes for begge ekstraktionsmetoder, der brugte denne homogeniseringstrin ( 1,2,4-6,9. Når celler og / eller DNA adskilles / frigives fra disse matricer, anvendelse af "gold standard" enzymatisk metode i hybrid metode effektivt renser DNA fra disse prøver. Inddragelsen af ​​inhibitorbindende trin fra den enzymatiske metode inden for den hybride udvinding protokol giver mulighed for en mere effektiv fjernelse af inhibitorerne til stede i komplekse miljøprøver anvendt i denne undersøgelse. Dette trin, der er fraværende fra mekanisk udsugning protokollen. Derfor hybrid ekstraktionsmetode, med tilføjelse af en mekanisk homogeniseringstrin i forbindelse med den enzymatiske purification af det frigivne DNA, er en effektiv metode til vurdering af de samlede bakterielle samfund fra miljømæssige fjerkræproduktion prøver.

Denne metode, som beskrevet, indeholder nogle specifikke krav, som brugere bliver nødt til at være klar. Første er anvendelsen af ​​en høj-drevne homogenisator samt nogle komponenter af en kommercielt tilgængelig ekstraktionskit. Tidligere undersøgelser viste, at andre mekaniske perle-bankende trin eller kraftige homogenisatorer forbedre dna-ekstraktion effektivitet og udbytte 4,5,9; Derfor kunne en anden type mekanisk homogeniseringstrin integreres i hybrid ekstraktionsmetode (selvom kan være nødvendigt at anvende forskellige specialudstyr). Den her beskrevne også hybrid metode bruger perle-bankende rør, der er specielt designet til homogenisatoren og specifikt for miljøprøver som følge af succesen af denne lysere matrix i tidligere lokalt baserede undersøgelser fra fjerkræ prøver 15, 31-33. Endelig er "gold standard" enzymatisk DNA-ekstraktion metode (QIAamp DNA Stool Mini Kit), der kræves til enzymatisk rensning af prøve-DNA i hybrid-protokollen, eftersom det har vist sig at være den mest effektive enzymatiske ekstraktion metode ved brug af fækale prøver 3,18,19. Mens der ikke kræves anvendt af den robot arbejdsstation (instruktioner med sættet kan udføres med hånden), brugen af robot arbejdsstation øger throughput, minimerer behandlingsfejl, og resulterer i højere kvalitet DNA til længere nedstrøms analyse 7. Automatisering af denne type ved hjælp af de eksisterende mekaniske kits er i øjeblikket ikke tilgængelig, hvilket udgør en anden fordel ved hybrid metode.

I øjeblikket er det robot arbejdsstation beskrevet i denne protokol er begrænset til behandling af maksimalt 12 prøver i 72 min, men foreløbig arbejde har vist, at denne metode virker lige godt i den højere throughput workstatipå, der kan behandle 96 prøver inden 40 min (data ikke vist). Yderligere testning af denne meget højere throughput option vil øge effektiviteten af ​​hybrid metode, da flere prøver kan behandles på en semi-automatiseret måde inden for en typisk dag. Desuden har de foreløbige data ved hjælp af denne nye DNA-ekstraktion metode vist, at det er effektivt til andre fjerkræ-relaterede prøver (fx hud / fjer skylninger, slagtekroppe skylninger, coecumindhold homogenater) samt andre typer af miljøprøver (f.eks landbrugsjord , svin afføring, hest afføring, ged afføring, kvæg afføring). Derfor vil fremtidige undersøgelser nødt til at bestemme effekten af ​​denne hybrid fremgangsmåde til ekstraktion af DNA fra mange landbrugs- og miljøprøver. Yderligere validering af denne metode ved fremtidige undersøgelser vil potentielt give mulighed for en bredere anvendelse af denne metode til vurdering af de samlede bakterielle samfund fra en række forskellige landbrugsmæssige og miljømæssige indstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix E tube MPBio 6914-050 Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate Solution MPBio 6570-205 Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS Buffer MPBio 6570-201
Buffer ASL (560 ml) Qiagen 19082
FastPrep 24 homogenizer MPBio 116004500 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini Kit Qiagen 51504
QIAcube24 (110V) Qiagen 9001292 Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024) Qiagen 990352
Filter-Tips, 200 ml (1024) Qiagen 990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) Qiagen 990394 For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml) Qiagen 990381 Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
En hybrid DNA Extraction Metode til kvalitativ og kvantitativ vurdering af bakteriel Fællesskabers fra fjerkræproduktion Prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L., Gamble, J., Caudill, A. C., Cicconi-Hogan, K. M., Caporaso, J. G. A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples. J. Vis. Exp. (94), e52161, doi:10.3791/52161 (2014).More

Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L., Gamble, J., Caudill, A. C., Cicconi-Hogan, K. M., Caporaso, J. G. A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples. J. Vis. Exp. (94), e52161, doi:10.3791/52161 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter