Mus Njurtransplantation: Modeller av allograftavstötning

Summary

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Abstract

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Introduction

Lyckad njurtransplantation för behandling av njursvikt beskrevs första gången 1955 mellan enäggstvillingar ^en, sedan dess har det blivit en revolutionerande behandling för patienter med terminal njursvikt i hela världen, som erbjuder både förbättring i längd och livskvalitet ^2. Långsiktig graft överlevnad har dock hämmats av en mängd patologiska processer som leder till kronisk allograft skada ^3.

Avvisning av transplanterad njure i människor förblir en betydande orsak till morbiditet, trots betydande förbättringar av immunosupporessive regimer. I syfte att utveckla en musmodell för njurtransplantation är att noggrant reproducera processen och patologi finns i human njurtransplantation ^4. Skoskiewicz et al. Beskrev först den musmodell för njurtransplantation 1973 ^5. Även avancerade mikrokunskaper behövs, det är en värdefull tool av flera skäl: musgenomet har väl beskriven och det finns en stor mängd olika experimentella metoder och tekniker som kan mus studier.

Många grupper använder musmodell för njurtransplantation har använt den transplanterade njuren som en livsuppehållande organ, men i andra studier och i vår metod som beskrivs en av mottagarens musens infödda njurar är kvar på plats under hela experimentet ^4. Fördelen är att musen genomgår en anestesi och operation därigenom minska sjuklighet till musen och risken att dö av en andra procedur. Dessutom musen inte lider av de negativa effekterna av en gradvis njursvikt.

Även modeller av allogen avstötning finns i andra organ som hjärta och hud, dessa är inte alltid direkt relevanta för njurtransplantation. Det finns belägg för att dessa modeller framkallar olika lägen och dynamics av avslag, till exempel tidsförloppet för avstötning vid hjärt allograft och allogent njurtransplantat skiljer sig avsevärt i vissa belastningskombinationer ^6. Vi har beskrivit akut njuravstötningsmönster i BALB / c-givare till icke-transgena FVB / nj möss, visade denna modell cellulär medierad skada med ackumulering av T-celler och makrofager ^7. Alternativt har vi också beskrivit en modell av kronisk allograft skador som uppvisar interstitiell fibros och tubulär atrofi, detta resulterar från transplantera en njure från C57BL / 6 ^BM12 donatorer i C57BL / 6 mottagare, eftersom dessa möss kännetecknas av en enda MHC klass Il-loci mis -match ^8.

Flera aspekter av transplantation har studerats med hjälp av musmodell för njurtransplantation inklusive akut avstötning, cellulär och humoral avslag, ischemireperfusionsskada och trialing nya terapeutiska medlen. Vi har ändrat den kirurgiska technique att reducera driftstiden och förbättra den lätthet av kirurgi. Särskilt har vi beskrivit samtidig givare och mottagare förberedelser och en förenklad vaskulär anastomos teknik genom att använda en kontinuerlig aorta patch anastomos. Denna video och manuskript ger viktiga punkter till stöd i upprättandet av denna teknik.

Protocol

Lämpliga nationella och lokala institutionella etik bör vara på plats innan du utför djurförsök. Speciellt i Storbritannien följande experiment bedrivs enligt de djur (Scientific Procedures) Act 1986 Om två microsurgeons finns att arbeta samtidigt donator kirurgen ska utföra steg 1,1-1,16 då 3,1-3,5, medan den mottagande kirurg utför 2,1-2,8 . För en enda operatör stegen kan följas i tur och ordning. 1. Donator Framställning Obs: Det förfarande som …

Representative Results

Nedsatt allograftavstötning kan bedömas genom histologisk analys av methacarn fixerade paraffininbäddade vävnadssnitt av den transplanterade njuren (Figur 2). Isograft transplantation av njurar mellan syngena möss resulterar i njur ischemisk reperfusionsskada, dock med 4 veckor tubuli har återhämtat sig och är histologiskt jämförbara med infödda njurar. Akut avstötning kan modelleras med C57BL / 6 njurtransplantation i BALB / c-mottagare, inom 1 vecka är det diffusa mononukleär cellinfiltr…

Discussion

Den mest väl beskrivna sättet att utföra den arteriella anastomosen är att använda den distala aortan av givaren, med njurartären i fortsättningen, i en ände-till-sida sätt till mottagaren aorta. Vi beskriver användningen av en aorta plåster, liknande den "Carrell patch" spegling som utförs i människans njurtransplantation som vi anser vara mer praktiskt. Även rapporter i litteraturen för givare och mottagare operativa tid är gles tror vi att utnyttja en aorta patch till mottagare aorta iställ…

Materials

			Surgical Instruments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10	For skin cutting
Curved Castoviejo scissors	Fine Science Tools	15017-10	For tissue cutting
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-08	For suture cutting
Toothed forceps 1×2 teeth	Fine Science Tools	11021-12
2 x Fine Tip forceps (Dumont No.5)	Fine Science Tools	11251-20
Angled Fine Tip forceps (Dumont No. 5/45)	Fine Science Tools	11253-25	For blunt dissecting
Curved Fine Tip forcep (Dumont No.7)	Fine Science Tools	11273-22	Useful to pass around vessels
Curved Crile Haemostat	Fine Science Tools	1300-04
Micro clip applicator with lock	Fine Science Tools	18056-14
2 x Micro serrefines spring width 2mm, jaw length 4mm	Fine Science Tools	18055-04	Microvascular clamps
2 x Colibri 3cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	120660-01
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07	Remove 7 to 10 days after surgery
			Equipment
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Thermal cautery unit with fine tip	Geiger	150A
Heat electronic pad	Cozee Cumfort	n/a
Euroklav 23-S	Melag	n/a	Autoclave
			Disposable equipment
7/O Silk braided suture	Pearsall	30514
10/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1118099
6/O Vicryl (plygalectin)	Ethicon	W9537
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Bection, Dickinson and Company	305175	For ureteric anastamosis
Regular bevel needle, 5/8 inch, 25G	Bection, Dickinson and Company	305122
Regular bevel needle, 1/2 inch, 30G	Bection, Dickinson and Company	304000
Insulin needle 1ml, 29G	Bection, Dickinson and Company	324827
Insulin needle 0.3ml, 30G	Bection, Dickinson and Company	324826
1 ml syringe slip tip	Bection, Dickinson and Company	300184
5 ml syringe slip tip	Bection, Dickinson and Company	302187
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	sterilised by autoclave
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	sterilised by autoclave
Plain drapes	Guardian	CB03	sterilised by autoclave
Cell culture dish 60mm x 15mm	Corning Incorporated	430166
Dispensing Pin	B-Braun	DP3500L / 413501	Used with NaCl 0.9%
Re-agents and Drugs
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution (dose 200mg/kg)
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml (dose 0.5mg/kg)
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml (dose 0.05mg/kg)
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml (dose 2mg/kg)
University of Wisconsin Solution	Belzer Bridge to Life	n/a	dose approximately 500 microlitres/mouse
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323
Heparin Sulphate	non-proprietary	n/a	5000units/ml (dose 5units/mouse)