Summary

Mus Njurtransplantation: Modeller av allograftavstötning

Published: October 11, 2014
doi:

Summary

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Abstract

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Introduction

Lyckad njurtransplantation för behandling av njursvikt beskrevs första gången 1955 mellan enäggstvillingar en, sedan dess har det blivit en revolutionerande behandling för patienter med terminal njursvikt i hela världen, som erbjuder både förbättring i längd och livskvalitet 2. Långsiktig graft överlevnad har dock hämmats av en mängd patologiska processer som leder till kronisk allograft skada 3.

Avvisning av transplanterad njure i människor förblir en betydande orsak till morbiditet, trots betydande förbättringar av immunosupporessive regimer. I syfte att utveckla en musmodell för njurtransplantation är att noggrant reproducera processen och patologi finns i human njurtransplantation 4. Skoskiewicz et al. Beskrev först den musmodell för njurtransplantation 1973 5. Även avancerade mikrokunskaper behövs, det är en värdefull tool av flera skäl: musgenomet har väl beskriven och det finns en stor mängd olika experimentella metoder och tekniker som kan mus studier.

Många grupper använder musmodell för njurtransplantation har använt den transplanterade njuren som en livsuppehållande organ, men i andra studier och i vår metod som beskrivs en av mottagarens musens infödda njurar är kvar på plats under hela experimentet 4. Fördelen är att musen genomgår en anestesi och operation därigenom minska sjuklighet till musen och risken att dö av en andra procedur. Dessutom musen inte lider av de negativa effekterna av en gradvis njursvikt.

Även modeller av allogen avstötning finns i andra organ som hjärta och hud, dessa är inte alltid direkt relevanta för njurtransplantation. Det finns belägg för att dessa modeller framkallar olika lägen och dynamics av avslag, till exempel tidsförloppet för avstötning vid hjärt allograft och allogent njurtransplantat skiljer sig avsevärt i vissa belastningskombinationer 6. Vi har beskrivit akut njuravstötningsmönster i BALB / c-givare till icke-transgena FVB / nj möss, visade denna modell cellulär medierad skada med ackumulering av T-celler och makrofager 7. Alternativt har vi också beskrivit en modell av kronisk allograft skador som uppvisar interstitiell fibros och tubulär atrofi, detta resulterar från transplantera en njure från C57BL / 6 BM12 donatorer i C57BL / 6 mottagare, eftersom dessa möss kännetecknas av en enda MHC klass Il-loci mis -match 8.

Flera aspekter av transplantation har studerats med hjälp av musmodell för njurtransplantation inklusive akut avstötning, cellulär och humoral avslag, ischemireperfusionsskada och trialing nya terapeutiska medlen. Vi har ändrat den kirurgiska technique att reducera driftstiden och förbättra den lätthet av kirurgi. Särskilt har vi beskrivit samtidig givare och mottagare förberedelser och en förenklad vaskulär anastomos teknik genom att använda en kontinuerlig aorta patch anastomos. Denna video och manuskript ger viktiga punkter till stöd i upprättandet av denna teknik.

Protocol

Lämpliga nationella och lokala institutionella etik bör vara på plats innan du utför djurförsök. Speciellt i Storbritannien följande experiment bedrivs enligt de djur (Scientific Procedures) Act 1986 Om två microsurgeons finns att arbeta samtidigt donator kirurgen ska utföra steg 1,1-1,16 då 3,1-3,5, medan den mottagande kirurg utför 2,1-2,8 . För en enda operatör stegen kan följas i tur och ordning. 1. Donator Framställning Obs: Det förfarande som …

Representative Results

Nedsatt allograftavstötning kan bedömas genom histologisk analys av methacarn fixerade paraffininbäddade vävnadssnitt av den transplanterade njuren (Figur 2). Isograft transplantation av njurar mellan syngena möss resulterar i njur ischemisk reperfusionsskada, dock med 4 veckor tubuli har återhämtat sig och är histologiskt jämförbara med infödda njurar. Akut avstötning kan modelleras med C57BL / 6 njurtransplantation i BALB / c-mottagare, inom 1 vecka är det diffusa mononukleär cellinfiltr…

Discussion

Den mest väl beskrivna sättet att utföra den arteriella anastomosen är att använda den distala aortan av givaren, med njurartären i fortsättningen, i en ände-till-sida sätt till mottagaren aorta. Vi beskriver användningen av en aorta plåster, liknande den "Carrell patch" spegling som utförs i människans njurtransplantation som vi anser vara mer praktiskt. Även rapporter i litteraturen för givare och mottagare operativa tid är gles tror vi att utnyttja en aorta patch till mottagare aorta iställ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansiering från Kidney Research UK, The Royal College of Surgeons i Edinburgh och The European Society of Organ Transplantation stödde denna studie.

Materials

Surgical Instruments
Blunt Dissecting Scissors Fine Science Tools  14072-10 For skin cutting
Curved Castoviejo scissors Fine Science Tools 15017-10 For tissue cutting
Spring Scissors – straight Fine Science Tools 15000-08 For suture cutting
Toothed forceps 1×2 teeth Fine Science Tools 11021-12
2 x Fine Tip forceps (Dumont No.5) Fine Science Tools 11251-20
Angled Fine Tip forceps (Dumont No. 5/45) Fine Science Tools 11253-25 For blunt dissecting
Curved Fine Tip forcep (Dumont No.7) Fine Science Tools 11273-22 Useful to pass around vessels
Curved Crile Haemostat Fine Science Tools 1300-04
Micro clip applicator with lock Fine Science Tools 18056-14
2 x Micro serrefines spring width 2mm, jaw length 4mm Fine Science Tools 18055-04 Microvascular clamps
2 x Colibri 3cm wire retractor Fine Science Tools 17000-03
Castroviejo needle holder with lock Fine Science Tools 120660-01
Wound clip applicator Fine Science Tools 12031-07
7mm wound clips Fine Science Tools 12032-07 Remove 7 to 10 days after surgery
Equipment
OPMI pico microscope Carl Zeiss S100
Thermal cautery unit with fine tip Geiger 150A
Heat electronic pad Cozee Cumfort n/a
Euroklav 23-S Melag n/a Autoclave
Disposable equipment
7/O Silk braided suture Pearsall 30514
10/O Dafilon (polyamide) suture B-Braun  G1118099
6/O Vicryl (plygalectin) Ethicon W9537
Regular bevel needle, 1 inch, 21G Bection, Dickinson and Company 305175 For ureteric anastamosis
Regular bevel needle, 5/8 inch, 25G Bection, Dickinson and Company 305122
Regular bevel needle, 1/2 inch, 30G Bection, Dickinson and Company 304000
Insulin needle 1ml, 29G Bection, Dickinson and Company 324827
Insulin needle 0.3ml, 30G Bection, Dickinson and Company 324826
1 ml syringe slip tip Bection, Dickinson and Company 300184
5 ml syringe slip tip Bection, Dickinson and Company 302187
Wypall paper swabs Kimberley-Clark L40 sterilised by autoclave
Cotton wool buds Johnson and Johnson n/a sterilised by autoclave
Plain drapes Guardian CB03 sterilised by autoclave
Cell culture dish 60mm x 15mm Corning Incorporated 430166
Dispensing Pin B-Braun DP3500L / 413501 Used with NaCl 0.9%
Re-agents and Drugs
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2% Allergan Ltd 21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10% Ecolab Ltd PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride Pfizer Animal Health Vm 42058/4165 100mg/ml solution (dose 200mg/kg)
(Domitor) Medetomidine hydrochloride  Orion Pharma Vm 06043/4003 1mg/ml (dose 0.5mg/kg)
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride  Alsto Animal Health Vm 00063/4002 0.3mg/ml (dose 0.05mg/kg)
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride Orion Pharma Vm 06043/4004 5mg/ml (dose 2mg/kg)
University of Wisconsin Solution Belzer Bridge to Life n/a dose approximately 500 microlitres/mouse
NaCl 0.9% Baxter FKE1323
Heparin Sulphate non-proprietary n/a 5000units/ml (dose 5units/mouse)

References

  1. Guild, W. R., Harrison, J. H., Merrill, J. P., Murray, J. Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin. Trans. Am. Clin. Climatol Assoc. 67, 167-173 (1955).
  2. Wolfe, R. A., et al. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N. Engl. J. Med. 341, 1725-1730 (1999).
  3. Nankivell, B. J., Alexander, S. I. . Rejection of the Kidney Allograft. N. Engl. J. Med. 363, 1451-1462 (2010).
  4. Tse, G. H., Hughes, J., Marson, L. P. Systematic review of mouse kidney transplantation. Transplant International. 26, 1149-1160 (2013).
  5. Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant. Proc. 5, 721-725 (1973).
  6. Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62, 1267-1272 (1996).
  7. Qi, F., et al. Depletion of cells of monocyte lineage prevents loss of renal microvasculature in murine kidney transplantation. Transplantation. 86, 1267-1274 (2008).
  8. Dang, Z., Mackinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93, 477-484 (2012).
  9. Jabs, W. J., et al. Heterogeneity in the Evolution and Mechanisms of the Lesions of Kidney Allograft Rejection in Mice. Am. J. Transplant. 3, 1501-1509 (2003).
  10. Lin, T., et al. Deficiency of C4 from Donor or Recipient Mouse Fails to Prevent Renal Allograft Rejection. Am. J. Pathol. 168, 1241-1248 (2006).

Play Video

Cite This Article
Tse, G. H., Hesketh, E. E., Clay, M., Borthwick, G., Hughes, J., Marson, L. P. Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection. J. Vis. Exp. (92), e52163, doi:10.3791/52163 (2014).

View Video