Samtidig Kvantifisering av T-Cell Receptor Eksisjon Circles (TRECs) og K-Slette rekombinasjon Eksisjon Circles (KRECs) ved Real-time PCR
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
T-celle-reseptor-excision sirkler (TRECs) og K-sletting rekombinasjon eksisjons- sirkler (KRECs) er små sirkularisert DNA-elementer som er skåret ut i en andel av T- og B-celler, henholdsvis, i løpet av et genomisk DNA-rekombinasjon fremgangsmåte, som fører til Dannelsen av et sterkt variert repertoar av T- og B-cellereseptorer. De har ingen funksjon, men fordi de er stabile og ikke kan bli kopiert, blir de fortynnet etter hver celledeling, således som vedvarer kun i en av de to dattercellene. Derfor kan deres nivåer i perifert blod antas som et estimat av thymus og benmarg utgang.
Mens TREC analysen stor grad har vært brukt de siste 15 årene for å vurdere omfanget av thymic utgang, til en den KREC analysen, som opprinnelig ble utviklet måle B-celleproliferasjon og dens bidrag til B-celle homeostase i helse og sykdom, to har nylig foreslått som en markør av bein marrow utgang. 3,4 Her beskriver vi metoden vi har utviklet for samtidig kvantifisering av både TRECs og KRECs. 4
Med denne kombinerte metode, er variasjonen forbundet til DNA kvantifisering av sanntids-PCR eliminert ved bruk av en unik standard kurve oppnådd ved å fortynne en trippel-insert-plasmid inneholdende fragmenter av TRECs, KRECs og T-celle-reseptor-alfa-konstant (TCRAC) gen i en 1: 1: 1-forhold. Dette gjør at en mer nøyaktig vurdering av TREC og KREC kopi nummer. Videre tillater den samtidige kvantifisering av de to mål i den samme reaksjons reagens kostnadsreduksjon.
Den foreslåtte TREC / KREC analysen kan være nyttig for å måle omfanget av T- og B-celle neo-produksjon hos barn eller voksne med alvorlig kombinert immunsvikt (SCID), 4 Common Variable Immunodeficiency, 5 autoimmune sykdommer, 6-8 og HIV-infeksjon Dess. 9, kan den brukes til åovervåke immun bedring etter stamcelletransplantasjon, 10 enzymerstatnings, 11 og antiviral 9 eller immunmodulerende behandling. 6-8 slutt, fordi SCID-pasienter er behandlet etter TREC analysen til tross for de underliggende genetiske defekter, og agammaglobulinemia pasienter kan identifiseres ved hjelp av KREC kvantifisering den TREC / KREC Målingen kan også brukes til å detektere immunsvikt hos nyfødte screeningprogrammer. 12 I dette tilfellet, må testen utføres på DNA ekstrahert fra små blodflekker blottet og tørket på filterpapir, må være meget følsom og spesifikk for mål-sykdommer, så vel som meget reproduserbar og kostnadseffektiv.
Innføringen av KREC kvantifisering i testen bør forbedre forestillinger av nyfødt screening for immunsvikt, som rutinemessig har blitt utført i de enkelte deler av USA (WI, MA, CA) siden 2008 da Wisconsin ble den første å introduksjonere analysen av TRECs i sin postnatal screening program. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin’s newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
