Summary

La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

Published: December 06, 2014
doi:

Summary

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Abstract

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Introduction

Círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión recombinación K-borrar (KRECs) son pequeños elementos de ADN circularized que son extirpados en una proporción de las células B, respectivamente, T y durante un proceso de recombinación de ADN genómico, lo que lleva a la formación de un repertorio altamente diversificada de T y receptores de células B. No tienen ninguna función, sino porque son estables y no se pueden replicar, se diluyen después de cada división celular, que persiste por tanto, sólo en una de las dos células hijas. Por lo tanto, sus niveles en la sangre periférica se puede asumir como una estimación de la salida de la médula tímica y el hueso.

Si bien el ensayo TREC se ha utilizado ampliamente en los últimos 15 años para evaluar la magnitud de la producción del timo, 1 ensayo FREC, que fue desarrollado inicialmente para medir la proliferación de células B y su contribución a la homeostasis de las células B en la salud y la enfermedad, 2 sólo recientemente ha sido propuesto como un marcador de hueso mflecha de salida. 3,4 A continuación, describimos el método que hemos desarrollado para la cuantificación simultánea de ambos TRECs y KRECs. 4

Con este método combinado, la variabilidad asociada a la cuantificación de ADN por PCR en tiempo real se elimina mediante el uso de una curva estándar único obtenido por dilución de un plásmido de triple inserto que contiene fragmentos de TRECs, KRECs y de las células T del receptor alfa constante (TCRAC) gen en una proporción de 1: 1: 1. Esto permite una evaluación más precisa del número de copias TREC y FREC. Además, la cuantificación simultánea de los dos objetivos en la misma reacción permite la reducción de costes de reactivos.

El ensayo TREC / FREC propuesto puede ser útil para medir el grado de células T y B neo-producción en niños o adultos con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), 4 Inmunodeficiencia Común Variable, 5 enfermedades autoinmunes, 6-8 y la infección por VIH . 9 Además, se puede utilizar paracontrolar la recuperación inmune después del trasplante de células madre hematopoyéticas, 10 de reemplazo enzimático, 11 y 9 antiviral o inmunomoduladores terapias. 6-8 Finalmente, porque los pacientes SCID se reconocen usando el ensayo de TREC a pesar de los defectos genéticos subyacentes, y agammaglobulinemia pacientes pueden identificarse utilizando la cuantificación FREC , el ensayo TREC / FREC puede también ser utilizado para detectar inmunodeficiencias en programas de cribado neonatal. 12 En este caso, la prueba debe ser realizada en ADN extraído de pequeñas manchas de sangre borrado y se seca sobre papel de filtro, debe ser altamente sensible y específica para las enfermedades objeto, así como altamente reproducible y rentable.

La introducción de FREC cuantificación en la prueba debería mejorar el rendimiento de cribado neonatal para inmunodeficiencias, que habitualmente se ha realizado en las algunas partes de los EE.UU. (WI, MA, CA) desde 2008, cuando se convirtió en Wisconsin el primero en Introde el análisis de TRECs en su programa de detección postnatal. 13

Protocol

Declaración de Ética: NOTA: Este protocolo sigue las directrices de nuestra institución, el Spedali Civili di Brescia 1. Elaboración de un "Triple-Insertar" plásmido Selección y preparación de material de partida apropiado: Obtener una muestra que contiene células muy susceptibles de tener TRECs y KRECs detectable por PCR, tal como sangre periférica de un sujeto sano joven recogido en tubos de EDTA. NOTA: En un principio, se había desarrollado e…

Representative Results

El ensayo se realizó en una muestra representativa de 87 controles sanos: 42 niños de entre 0 a 17 (hombres / mujeres: 25/17) y 45 adultos de 24 años – 60 (machos / hembras: 29/16). Los resultados fueron obtenidos como TRECs y KRECs por 10 6 PBMC, y luego los TRECs y KRECs por ml de sangre fueron calculados. El número de TRECs disminuye con la edad debido a la involución tímica, 4, en particular, de una manera muy aguda de 0 a 3 – 4 años. En los adultos, el núme…

Discussion

TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Histopaque-1077 Sigma Aldrich SRL 10771-500 ML density gradient separation method
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) QIAGEN 51106 DNA extraction
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l  Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl
AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 Applied Biosystems/Life-Technologies N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM) Applied Biosystems/Life-Technologies N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning Invitrogen/Life-Technologies K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells Stratagene 200130
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
SpeI 500U New England Biolabs R0133S
HindIII-HF 10,000 U New England Biolabs R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2492
XhoI 5,000 U New England Biolabs R0146S
TRIS Utrapure Sigma Aldrich SRL T1503
EDTA Sigma Aldrich SRL E5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems/Life-Technologies 4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l  Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl
NanoDrop 2000c spectrophotometer ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Applied Biosystems/Life-Technologies 4359659
Fast 7500 Real-Time PCR system Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS Sequence Detection Software 1.4 Applied Biosystems/Life-Technologies

References

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Sottini, A., Serana, F., Bertoli, D., Chiarini, M., Valotti, M., Vaglio Tessitore, M., Imberti, L. Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR. J. Vis. Exp. (94), e52184, doi:10.3791/52184 (2014).

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