Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

أطرافهم بعد الدماغية شروط مسبقة: تقنية اعصاب في القوارض

Published: June 2, 2015 doi: 10.3791/52213
Automatic Translation
1
1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney

Summary

شروط مسبقة الدماغية عن بعد (RIP) هي طريقة لأنسجة تكييف ضد الإجهاد الضار. أنشأنا وسيلة لنقص التروية عن بعد في أطرافهم الخلفية، من خلال تضخيم صفعة مقياس ضغط الدم لمدة 5-10 دقيقة. وقد أثبتت قدرات اعصاب من RIP في نموذج من تنكس الشبكية في القوارض.

Abstract

نقص التروية دون المميت يحمي أنسجة ضد لاحق، نقص التروية أكثر شدة من خلال upregulation من الآليات المحلية في الأنسجة المتضررة. وقد تبين أيضا نقص التروية دون المميت لupregulate آليات الحماية في أنسجة بعيدة. A فترة وجيزة من نقص التروية (5-10 دقيقة) في أطرافهم هند من الثدييات يستحث استجابات الحماية الذاتية في الدماغ والرئة والقلب وشبكية العين. ومن المعروف أن مفعول شروط مسبقة الدماغية عن بعد (RIP). بل هو وسيلة واعدة علاجيا لحماية الأجهزة الحيوية في الجسم، وبالفعل قيد التجارب السريرية لإصابات القلب والدماغ. يوضح هذا المنشور أو أسلوب مينيملي رقابة من صنع أحد أطرافه - على وجه التحديد أطرافهم هند من الفئران - الدماغية. تم توصيل كفة ضغط الدم تطويرها للاستخدام في حديثي الولادة الإنسان مقياس ضغط الدم اليدوي واستخدام تطبيق الضغط 160 ملم زئبقي حول الجزء العلوي من أطرافه الخلفية. ويستخدم المسبار تهدف إلى الكشف عن درجة حرارة الجلد للتحقق من ischemiلذلك، من خلال تسجيل انخفاض في درجة حرارة الجلد الناجم عن انسداد الضغط الناجم عن الشرايين الساق، وارتفاع درجة الحرارة الذي يتبع الافراج عن صفعة. هذا الأسلوب من RIP يوفر الحماية لشبكية العين الفئران ضد مشرق الأضرار الناجمة عن الضوء وانحطاط.

Introduction

بقاء معظم، وربما كل شيء، الأنسجة في مواجهة الإجهاد الأيضي يمكن تحسين تكييف مسبق مع فترة من دون المميتة نقص التروية 1،2. شروط مسبقة الدماغية (IP) من الناحية العملية هو تعرض الأنسجة لنقص التروية دون المميت، قبل تجارب الأنسجة الضغوطات أشد، مثل إهانة الدماغية اللاحقة. في النماذج الحيوانية، IP يوفر الحماية لفتا إلى الدماغ، شبكية العين والقلب والرئتين 3-6. في المقابل، أظهرت الملاحظات في مرضى السكتة الدماغية وجود صلة بين هجمات نقص تروية عابرة السابقة وأفضل النتائج السريرية 7،8. كما يحمي خلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين IP من إصابات غير الدماغية 9.

فعالية IP في الأنسجة وإصابات متنوعة تشير إلى أنه تم تفعيل آلية الفطرية للبقاء الخلية موجود في جميع الأنسجة. وقد اقترح شروط مسبقة نقص تروية عضلة القلب أن يكون لها تأثيرات وقائية من خلال upregulationنقص الأكسجة عامل محرض (مؤسسة الحرمين)، المعروف لتنظيم العديد من المسارات الأيضية من خلال الافراج عن الأدينوزين أو من خلال فتح قنوات البوتاسيوم الميتوكوندريا ATP 10،11. وتورط قنوات الإفراج الأدينوزين ATP والبوتاسيوم في نقص التروية الدماغية ولكن، وقد تركزت التحقيقات في آليات اعصاب تكييف الدماغية حتى الآن على تعديلات لمكافحة التحفيز الزائدة، مسارات مكافحة أفكارك والمضادة للالتهابات 12،13. عموما، فهم العملية الجزيئية للتكييف الدماغية لحماية الخلايا العصبية محدودة.

محاولات شروط مسبقة الدماغية عن بعد إلى حالة بعيدة الأجهزة الهامة خطيرة (القلب والدماغ والرئة) عن طريق توليد نقص التروية في أنسجة أقل أهمية. وقد تجلى شروط مسبقة الدماغية عن بعد (RIP) باستخدام أطرافهم هند أن تكون اعصاب في نماذج القوارض من السكتة الدماغية 14-17. الطريقة الموصوفة من قبلنا يوفر البروتوكول الاضافي بسيطة وموثوق بها وغير الغازيةocol لإحداث RIP.

الغالبية العظمى من بروتوكولات RIP تنطوي على أطرافه الخلفية، ربما لأن الشريان الفخذي تقع في هند الطرف العلوي يمكن التعرف عليها بسهولة والوصول إليها للقط الجراحية وتطبيق العاصبة. في الطرف الغازية الدراسات الدماغية لدراسة المخ وحماية الجلد، والتي يسببها نقص التروية عن طريق الفصل بين الشريان الفخذي من أربطة الفخذ وتحامل على الشريان الفخذي 2،15،18.

وقد تم تأكيد نقص التروية الناتج إما عن الطرف استكفاف أو الفخذ الشريان لقط بالتغيرات في أطرافهم بما في ذلك فقدان النبض، وانخفاض في الأوكسجين وانخفاض في درجة حرارة الجلد. ويمكن التأكد من نقص التروية بعيد عن فقدان النبض باستخدام الليزر أو الموجات فوق الصوتية دوبلر دوبلر 17-19. درجة حرارة الجلد يمكن أن تستخدم كبديل للدوبلر على الرغم من أن العلاقة غير الخطية 20،21. تسجيلات دقيقة لدرجات الحرارة شائعة في المختبرات ويمكنيسهل إدراجها في الدراسات الدماغية النائية.

بديلا للجراحة الفخذ تحامل هو تحريض نقص التروية باستخدام وقف النزف. تطبيق وقف النزف ينتج نقص التروية مماثلة لتلك التي تحققت مع سفينة لقط. Kutchner وآخرون. مقارنة الشريان الفخذي الغازية لقط لوقف النزف غير الغازية وجدت أوقفت كلا أساليب تدفق الدم إلى الأطراف وتقليل الأضرار التي تلحق بالبشرة في نموذج الجراحة التجميلية من دحرج الجلد نقص التروية 18. وقد وجد استكفاف إما الساق أو الذراع ورفع ضغط الكفة إليها أعلاه ضغط الدم الانقباضي لأنه يحمي من الضرر نقص تروية في الخنازير والبشر 17،19،22.

نهج وقف النزف مختلفة لحمل جهاز التحكم عن بعد تشمل الدماغية استخدام كفة ضغط الدم أو الفرقة 17،22،23 مرونة. ومع ذلك، فإن استخدام شريط مطاطي للحث على نقص التروية هو وسيلة غير آمنة، مما قد يؤدي إلى وجود كمية غير المنظم للضغط فيأطرافهم، مع ارتفاع الضغط فوق 500 مم زئبقي يجري تسجيلها في البشر 24. وعلاوة على ذلك، نقص تروية الأطراف باستخدام شريط مطاطي يؤدي إلى تلف العضلات في الفئران بعد إزالة الفرقة 23، وفقا لتقييم ايفانز الأزرق صبغ، علامة في الجسم الحي من ليف عضلي نفاذية 25. في المقابل، لا يمكن أن يتحقق تسليم الضغط التي تسيطر عليها لوقف النزف باستخدام كفة ضغط الدم متصلة 17،19،22،26 مقياس ضغط الدم.

في هذه الدراسة، تم استخدام نموذج إصابة خفيفة من انحطاط مبصرة لإثبات فعالية اعصاب من شروط مسبقة الدماغية بعيد. وكان المستحث نقص التروية البعيد مباشرة قبل الإصابة الخفيفة، ومنعت لاحقا انحطاط مستقبلة للضوء في شبكية العين على نحو ما أكده اختبار وظيفة. فإن الفيديو المرافق لشرح تطبيق نقص التروية عن بعد غير الغازية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة سيدني، لجنة الطاقة الذرية # 5657. وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق التخدير الحيوان (جامعة سيدني، لجنة الطاقة الذرية # 5657).

1. معدات إعداد

  1. استخدام الوقت الحقيقي تتبع درجة حرارة الجلد. التبديل على جهاز الكمبيوتر، والأجهزة الحصول على البيانات.
  2. مفتوحة درجة الحرارة برنامج تسجيل وتعديل تحديد درجة الحرارة إلى ما بين 30-35 درجة مئوية، وتكرار أخذ العينات لكل 100 مللي ثانية.
  3. اختياري: إدراج مقياس الحرارة المستقيم لضمان درجة الحرارة الأساسية لا تزال مستقرة في 37.5 درجة مئوية.

2. معايرة دليل مقياس ضغط الدم

  1. ربط حديثي الولادة الذراع الكفة لsphygmomanometer.Use حجم 2 صفعة ل250-550 ز الفئران. قد يكون محول من الضروري توصيل أنابيب صفعة لمقياس ضغط الدم.
  2. فرغ الكفة إما عن طريق تخفيف صمام إطلاق الهواء أو فصل أنابيب صفعة من التكيفأو. ضمان عدم وجود ضغط يبقى في أنابيب وتقع على إبرة مقياس ضغط الدم عند مستوى الصفر داخل البيضاوي / المستطيل.
  3. تحقق من الضغط بين أنابيب، مقياس ضغط الدم والكفة. تضخيم الكفة مع مضخات لطيف من لمبة التضخم حتى يقرأ 100 مم زئبق على مقياس ضغط الدم. ضمان يبقى الضغط المستمر. فرغ الكفة عن طريق فتح ببطء القيمة إطلاق الهواء.

3. إعداد الحيوان

ملاحظة: الحيوانات التي هي على الخضوع لإصابة خفيفة تتطلب التكيف الظلام في الليلة التي سبقت نقص التروية عن بعد. الحيوانات تمر الضرر ضوء تتطلب تربية الظلام (ضوء 12 ساعة: دورة الظلام (5 لوكس))

  1. أداء نقص التروية عن بعد في أي من القوارض مستيقظا أو anesthetised. تأكد من أن الحيوانات لديها قوة العضلات السليمة. ضمان ذلك عن طريق معسر هند الطرف العلوي للتأكد من وجود الوقت الحاضر العضلات كاف. وقد تم اختبار حماية RIP التي يسببها ضد الإصابة الخفيفة في الفئران المستقرة تصل إلى 6 أشهر من العمر.
  2. إعداد Anesthetised لRIP
    1. حقن الفئران مع حقنة داخل الصفاق من 60 ملغم / كغم من الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين. تحقق من عمق التخدير عن طريق تمديد الساق ومعسر الجلد على الجانب السفلي من القدم. الحيوان لا يوجد لديه رد الفعل إذا تم anesthetised بعمق. تطبيق الدموع الاصطناعية لتجنب جفاف القرنية في حين تحت التخدير.
    2. وضع الفئران إما على وسادة الحرارة أو تعميم سخان مياه الأنابيب للحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة من 37.5 درجة مئوية. وضع الفئران في وضعية الانبطاح مع منصات القدم الأطراف السفلية "مواجهة. إما اليمين أو اليسار أطرافهم قد يخضع لنقص التروية عن بعد.
  3. إعداد مستيقظا لRIP
    ملاحظة: استيقظ التجارب على الحيوانات يتطلب شخصين. شخص واحد يقيد الحيوان والشخص الثاني يعمل مقياس ضغط الدم اليدوي. يجب أن يكون المجربون ثقة لتنفيذ الإجراء كما ضبط النفس يزيد من خطر إصابة معالجات. الفئران التي تمر نقص التروية عن بعد يجب أن تكون مشروطة رس ضبط النفس اليدوي. يجب اعتمادا على المبادئ التوجيهية حدسي أن يكون ضبط النفس اليدوي التقدم من 30 ثانية لمدة أقصاها 5 دقائق على مدى عدة أسابيع. ينبغي استبعاد الحيوانات الخجولة التي تفشل في التأقلم على ضبط النفس اليدوي من التجريب مستيقظا. وأخيرا، من المرجح أن يسبب الإجهاد (وربما إدخال يفند للدراسة) للحيوانات وفوج الشام (وضع الكفة دون التهاب) يجب أن تستخدم لتفسير بدقة نتائج الدراسة RIP ضبط النفس اليدوي.
    1. قطع منشفة الى 15 سم × 30-50 سم قطعة ووضعها على حافة قصيرة عمودي على العمود الفقري الفئران، وتغطية الرأس إلى أعلى أطرافه الخلفية.
    2. دس حافة قصيرة تحت الجذع الفئران بإحكام والبدء في التفاف الفئران مع الحافة الطويلة المتبقية من منشفة. تأمين الحيوان ملفوفة تحت الذراع في موقف ضعيف. إذا تم عقد الفئران تحت الذراع الأيسر، حرر أطرافهم الفأر الأيمن من منشفة.

4. تطبيق سو الجلد التحقيق في درجة الحرارة

  1. تمديد الساق من الفئران التي هي على الخضوع لنقص التروية ومكان التحقيق الجلد على قاطع الطريق. ضع التحقيق الجلد لتحقيق أقصى قدر من الاتصال بين التحقيق في درجة الحرارة والجلد. دفع بقوة التحقيق في قاطع الطريق ويضعوا التحقيق مع ورقة الشريط.
  2. تحقق موضع التحقيق الجلد من خلال تتبع درجة الحرارة على برنامج تسجيل درجة الحرارة. تأكد من أن درجة حرارة الجلد ما بين 30-34 درجة مئوية، وتظل مستقرة. تتبع درجة حرارة الجلد لمدة 1-2 دقيقة. ضبط التحقيق الجلد إذا كانت درجة الحرارة غير مستقرة أو أقل من 30 ° C.

5. نقص التروية عن بعد

  1. فرغ الكفة والتأكد من إغلاق صمام ضغط الهواء. تمديد الساق وتطويق فضفاضة صفعة على هند الطرف العلوي. استخدام السبابة والإبهام على تمديد الساق وانخفاض أرقام للحفاظ على الكفة خففت في الموقف.
  2. رفع ضغط الكفة الحيوان anesthetised إلى 160 مم زئبق، والحيوانات المستيقظة increبورصة عمان ضغط الكفة إلى 180 مم زئبق.
    ملاحظة: ضغط الدم anesthetised من الفئران يتراوح 120-140 مم زئبق ويرتفع إلى 160 مم زئبق عند اعية. بدء الموقت ودرجة الحرارة القدم التسجيلات مرة واحدة يتم الوصول إلى الضغط الصحيح.
    ملاحظة: يجب إسقاط درجة حرارة القدم بنسبة 2 ° C بعد 5 دقائق من الضغط المستمر.
  3. المحافظة على منصب الكفة فوق "الركبة" الحيوان في جميع أنحاء نقص التروية. وسوف يبدأ ضغط الكفة لإسقاط بعد بضع دقائق، أو إذا كان الطرف فأر يتحرك.
  4. ضخ مرارا وتكرارا لمبة التضخم في رشقات نارية قصيرة للحفاظ على الضغط المطلوب صفعة انفجار قصيرة متكررة من الضخ
  5. يمكن أن يتم تسليم نقص التروية عن بعد بشكل مستمر لمدة تتراوح بين 5 و 15 دقيقة. ويتضمن البروتوكول نقص التروية ضخه 2 فترات 5 دقائق نقص التروية مع التدخل 5 دقائق ضخه.
  6. فرغ ضغط الكفة عن طريق فك صمام ضغط الهواء. تحقق التغير في درجة الحرارة على مدار الموالية نقص الترويةtocol. الافراج عن صفعة.
  7. تواصل مع التجريب الاصابة. والحيوانات تحت تأثير التخدير تحتاج إلى وضعها على وسادة الحرارة. تواصل رصد الحيوانات حتى العيادات الخارجية. لا يمكن أن تعاد الحيوانات في السكن حتى المشي.

6. الإصابة الخفيفة - الشبكية البقعي نموذج

  1. الظلام التكيف مع الحيوانات بين عشية وضحاها (12-15 ساعة). مباشرة بعد بعد تكييف نقص التروية أو نقص التروية بعد الصوري (ضبط النفس الحيوانية) الحيوانات مكان في البرسبيكس الإسكان مع الغذاء والماء.
  2. تشغيل إضاءة الفلورسنت (1000 لوكس) وتقع فوق البرسبيكس السكن في 09:00 لمدة 24 ساعة. بعد التعرض للضوء، وعودة الحيوانات خافت الإضاءة دوري لمدة 7 أيام.

إجراءات نقص التروية 7. بعد النائية

  1. تقييم الرؤية مع مخطط كهربية (أرج):
    ملاحظة: أرج انشاء وبروتوكول فلاش جاءت براندلي وستون 26.
    1. الظلام التكيف مع الحيوانات بين عشية وضحاها (12-15 ساعة). تحتخافت الإضاءة الحمراء تخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين وزيلازين (60 ملغ / كغ و 5 ملغ / كغ على التوالي). موسع للحدقة (الأتروبين سلفات 1.0٪)، مخدر القرنية (proxymetacaine 0.5٪).
    2. تطبيق ترطيب القرنية قطرات (كربومير البوليمر) العين على الفور إلى القرنية. تطبيق هلام العين في 20 دقيقة فترات للحفاظ على الماء القرنية.
    3. رسم موضوع مرتبطة فضفاضة حول مقلة العين لمساعدة مستقرة تسجيلات أرج. مراقبة درجة الحرارة باستخدام مسبار المستقيم والحفاظ على درجة حرارة الجسم الحيوان في 37-37،5 درجة مئوية.
    4. موقف رئيس داخل المجال دمج فريق Ganzfeld.
      ملاحظة: فريق Ganzfeld هو التحفيز خفيفة للبرمجة بشكل كامل من شأنها أن توفر مضات مثقال ذرة موحدة من المصابيح للعين.
    5. تسجيل مخطط كهربية باستخدام 4 مم البلاتين الكهربائي حسب الطلب إيجابي لمس طفيفة القرنية و2 مم حج / أجكل بيليه القطب إدراجها في الفم. مرجع كل من الأقطاب الكهربائية إلى إبرة الفولاذ المقاوم للصدأإدراج تحت الجلد في الردف.
    6. إشارات سجل مع وضع الفرقة تمرير من 0.3-1،000 هرتز (-3 ديسيبل)، مع نسبة استحواذ 2 كيلو هرتز (الصكوك AD). بعد إنشاء تسجيل أرج مستقر موضوع الحيوان إلى التكيف مع الظلام 10 دقيقة قبل البدء في التسجيلات.
    7. متابعة بروتوكول الفلاش كما هو موضح سابقا من قبل براندلي وستون 26.
      1. برمجة مدة فلاش (كنا مضات 1-2 مللي ثانية في المدة)، ومجموعة شدته إلى -4.4 إلى 2.0 سجل الاسكتلندي cd.sm -2. استخدام مضات مشرقة (2.0 سجل الاسكتلندي cd.sm -2، 1 مللي ثانية) لقياس وظيفة الشبكية. في هذه الدراسة هو المقارنة بين السيطرة والإصابات الخفيفة وإصابة خفيفة مع RIP.

8. TUNEL الفحص

  1. الموت ببطء الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق من جرعة زائدة من الفينوباربيتال (100 ملغ / كلغ). استأصل العينين وإصلاح في 4٪ امتصاص العرق.
  2. غسل العينين في برنامج تلفزيوني قبل cyroprotectingعيون بين عشية وضحاها في السكروز 30٪ (ث / ت). تضمين عيون في أكتوبر مركب ومقطعة إلى 20 ميكرون أقسام السهمي باستخدام ناظم البرد.
  3. إجراء فحص TUNEL على أقسام الشبكية مع تلوين دابي التالية بروتوكول Maslim وآخرون 27
  4. استخدام المجهر مضان لتهم TUNEL من شبكية العين. سجلت خلايا TUNEL من الطبقة النووية الخارجي (ONL)؛ الطبقة الخارجية للشبكية العين الذي يحتوي على نواة مبصرة. في هذه الدراسة، أدلى التهم TUNEL في ثلاث نسخ لكل عين، مع 5 لعيون كل مجموعة العلاج.
  5. استخدام في اتجاه واحد ANOVA لمجموعة إحصائية مقارنة يعني السيطرة والإصابات الخفيفة والخفيفة إصابة + RIP الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A كفة ضغط الدم مرتفعة إلى فوق 160 مم زئبقي وقفها تدفق الدم إلى الأطراف الخلفية كما يظهر بوضوح في الشكل 1B. أدى عدم الأوكسجين الأنسجة في خفض درجة حرارة القدم الحيوان لبروتوكول نقص التروية ضخه (الشكل 2). كانت درجة الحرارة القدم (33 ° C) أقل من درجة الحرارة الأساسية وخفضت بشكل موثوق خلال ارتفاع ضغط الكفة (31 ° C) ارتفاع عندما بددت الكفة (32 ° C). وقد وزعت واحدة 1000 لوكس إصابة خفيفة إلى الخافتة التي أثيرت الجرذان البيضاء مع أو بدون شروط مسبقة الدماغية بعيد. وسجلت وظيفة الشبكية وتقييمها باستخدام مخطط كهربية (أرج).

وأرج هو محصلة الاستجابات الكهربائية التي تنشأ من الخلايا العصبية الداخلية والخارجية للشبكية العين لتحفيز الضوء كما هو مبين في الشكل (3). والموجي أرج لديه ذروة السلبية المبكرة الناجمة عن phototransduction (الحد الأدنى حوالي 10 مللي ثانية بعد من lighتي فلاش) وصفه لموجة وذروة إيجابية كبيرة من داخل شبكية العين (الحد الأقصى حوالي 80 مللي ثانية بعد ضوء فلاش) وصفته ب الموجة. وأرج تكييفها داكنة من قاتمة العادي أثار أظهرت الفئران مبصرة كبير واستجابة شبكية العين الداخلية إلى مشرق 2.0 سجل cd.sm -2 فلاش (الشكل 3A). أسبوع واحد بعد الاصابة الخفيفة كان التسجيلات ERG انخفاض حاد في السعة بالنسبة لضوابط، مما يعكس فقدان خلايا مستقبلة للضوء. انظر الشكل 3B. شروط مسبقة أطرافهم الخلفية مع نقص التروية باستخدام بروتوكول ضخه من 2 × 5 دقائق مباشرة قبل التروية حماية خلايا مستقبلة للضوء من الإصابة الخفيفة. كانت سعة RIP أرج أكبر من الإصابة الخفيفة وحدها، مع انخفاض طفيف على الكرسي على الموجة (الشكل 3C). وأكد محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز dUTP نيك وسم نهاية (النفق) مقايسة على أقسام cryopreserved الشبكية والحد من الخلايا أفكارك في ضوء الحيوانات التالفة تلقي يختلط RIPative إلى الشام معاملة الحيوانات الإصابة الخفيفة (الشكل 4).

تحريض نقص التروية إلى أطرافه الخلفية ويعتمد على موضع الصحيح من الكفة، كما رأينا في الشكل 1. A صفعة وضعت تحت "الركبة" لا يحمي خلايا مستقبلة للضوء من إصابة خفيفة على النحو المبين في تخفيض سعة أرج، انظر الشكل 3D.

في الختام، عندما تدار بشكل صحيح وهند أطرافهم نقص التروية قادرة على حماية الخلايا العصبية للشبكية من الإصابة الخفيفة.

الشكل 1
الشكل 1: وضع الكفة وتأثير ضغط الكفة فوق 160 مم زئبقي (A) ويبين أطرافهم هند والقدم قبل الكفة ارتفاع الضغط. (B) معارض القدم خلال ارتفاع ضغط الكفة فوق 160 مم زئبقي. علما أن موقف الكفة فوق "ك ني ". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: يتم تخفيض درجة حرارة القدم خلال التضخم الكفة التضخم من صفعة على أطرافهم هند لمدة 2 × 5 دقائق عند 160 مم زئبق انخفاض درجة حرارة الجلد أثناء نقص التروية. (A) ويبين متوسط ​​مجموعة ل2 × 5 دقائق القدم RIP التغيرات في درجات الحرارة. (B) يدل على درجة حرارة القدم التمثيلية (° C) تتبع ل2 × 5 دقائق نقص التروية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

00 "/>
الرقم 3: RIP يحفظ وظيفة شبكية العين كما هو موضح في أرج بالمقارنة مع الفئران الأضرار الخفيفة التعرض للضوء الساطع لمدة 24 ساعة الأضرار المستقبلات الضوئية في شبكية العين. وأرج يقيس صحة شبكية العين الداخلية والخارجية كرد فعل الكهربائية (microvolts [μV]) لتحفيز الضوء. واستجابة طبيعية الشبكية إلى 2.0 سجل cd.sm -2 التحفيز ضوء ينظر في (A). الضرر مبصرة من النتائج الضوء الساطع في ERG السعة الصغيرة (B). كان قادرا على إنقاذ خلايا مستقبلة للضوء بعد الاصابة الخفيفة (C) RIP. وضع الكفة غير صحيحة أثناء RIP لا يحمي خلايا مستقبلة للضوء من الاصابة (D). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

4highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الرقم 4: TUNEL + خلية التهم الموجهة إليه. رسم بياني شريط مقارنة نتيجة مجموعة لإصابة خفيفة، وإصابة + RIP إظهار انخفاض في موت الخلايا المبرمج مع RIP. TUNEL + خلية احصي عبر فترة كاملة من شبكية العين (8000 ميكرون). وكانت مجموعة من المتوسط ​​TUNEL + خلايا أقل للRIP الفئران المعالجة (210 ± 4.9، ن = 5) مقارنة الإصابة الخفيفة وحدها (255 ± 10، ن = 5)، p <0.01، في اتجاه واحد ANOVA: أعلى اللوحة. كان شبكية العين التالفة (أي إصابة خفيفة) منخفضة جدا (3.0 ± 1.4، ن = 5) خلايا أفكارك. (A) صورة الممثل الضوء متفوقة أصيب شبكية العين. (B) صورة الممثل من أعلى RIP الضوء أصيب شبكية العين. (C) صورة الممثل من أدنى جرح ضوء شبكية العين. (D) صورة الممثل من أدنى RIP الضوء أصيب شبكية العين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذاالشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وكان المستحث القوارض أطرافهم هند نقص التروية بنجاح مع مقياس ضغط الدم اليدوي وكفة تقديم العصبية إلى خلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين. وكان من النتائج متسقة مع تكييف الناجم عن نقص تروية حماية خلايا مستقبلة للضوء من الإصابة الخفيفة 9،28.

أساسا، نقص تروية بعيد يسبب نقص الأكسجين وجيزة إلى الأنسجة. ومن هنا، شروط مسبقة الدماغية عن بعد لديه العديد من أوجه التشابه مع تكييف الدماغية أو تسميته بدلا من التسامح الدماغية، شروط مسبقة ميتة، وإلى حد ما، وممارسة اللاهوائية. الخلايا تستجيب للتحدي الدماغية عن طريق الإفراج عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات، نوكليوسد والنسخ العوامل التي تقدم إما العصبية مباشرة أو تؤثر على الخلايا لتصبح تسامحا من الإجهاد الأيضي لاحق 13.

في الأدب، وشملت بروتوكولات نقص التروية بعد مجموعة من فترات والترددات. لدينا مختبر اختبرت 5، 10،و2 × 5 بروتوكولات دقيقة نقص التروية على وظيفة شبكية العين العادية 26. من هذه البروتوكولات 2 × 5 دقائق تنتج أكبر تغيير السعة أرج في الفئران العادية واختير لاختبار في نموذج من الإصابة الخفيفة. وقد تبين أيضا 5 دقائق الأحداث الدماغية قصيرة ومتكررة لتكون وقائية في السكتات الدماغية المتكررة في البشر والحد من حجم احتشاء في السكتة الدماغية التجريبية في الخنازير 17،22. ومع ذلك، فإن مدة أنسب من شروط مسبقة الدماغية ومن المرجح أن تعتمد على النموذج الحيواني المستخدمة. على سبيل المثال، فقد لوحظ انخفاض في حجم احتشاء ضد نقص التروية التنسيق في أطول 2 × 15 دقيقة و 3 × 15 بروتوكولات دقيقة، ولكن ليس في 3 × 5 بروتوكولات دقيقة في الفئران (15).

الوقت بين الملكية الفكرية والإصابات الدماغية يحتاج أيضا إلى النظر فيها لالعصبية فعالة. وقد صنفت نافذتين الوقت لكارديوبروتيكتيون الناجمة عن IP. هذه هي "تكييف الكلاسيكية" نافذة، والذي يحدث 0-12 ساعة بعد IP و"نافذة ثانية"، والذي يحدث 3-4 أيام بعد IP 29. في نموذج السكتة الدماغية البؤري، تم العثور على RIP إلى حماية عند نقاط زمنية متعددة، بما في ذلك خارج النوافذ الكلاسيكية والثانية 15. ومع ذلك، فقد كان هناك عدد قليل من الدراسات التي قارنت بين فترات زمنية من العصبية في RIP والملكية الفكرية.

وثمة اعتبار آخر لحماية نقص التروية عن بعد هو توقيت تكييف، بما في ذلك ما إذا كان يتم تطبيقه قبل الإصابة (شروط مسبقة) أو بعد إصابة (postconditioning). غالبية اختبار نقص التروية بعد استخدمت شروط مسبقة على الرغم من postconditioning بعد أن تم مؤخرا وجدت الدراسات إلى حماية كل من الخلايا العصبية في شبكية العين والمخ 30،31.

وباختصار، فإن تحريض العصبية في هند أطرافهم تكييف الدماغية تقتصر على نموذج المرض، والأنواع الحيوانية، ومدة نقص التروية، وتوقيت نقص التروية. مراجعة من قبل Kaniora وآخرون. صrovides مزيد من التفاصيل حول العديد من بروتوكولات النائية نقص التروية، بما في ذلك الأنواع، بروتوكولات RIP، مواقع RIP، ونماذج الإصابة، نتائج الإصابة وآليات الحماية المقترحة 32.

صفعة طفيفة التوغل على الأطراف الخلفية تسمح RIP في كلا مستيقظا وقدمت الحيوانات يتم الحفاظ على درجة حرارة الجسم. في التجريب تخدير، ويجب الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان لمنع انخفاض حرارة الجسم. ورصد درجات الحرارة الداخلية تمنع الحيوان تمر انخفاض حرارة الجسم أو ارتفاع الحرارة. انخفاض حرارة الجسم وارتفاع الحرارة والمعروفة المحفزات تكييف قبل في كلا النموذجين السكتة الدماغية والإصابة الخفيفة 33-36. طريقة إن الرب قدم لا يمكن أن يؤديها في الحيوانات المستيقظة وبالتالي منع يفند درجة حرارة الجسم.

التخدير قد يعرض مجموعة مختلفة من يفند في RIP التجريب. يمكن الأيزوفلورين المشاركة في حماية عضلة القلب من خلال افتتاح الفصل البوتاسيوم ATP تراعيannels، آلية وقائية مماثلة ذكرت في نقص تروية تكييف 37. على الرغم من أن حجم احتشاء في نماذج السكتة الدماغية لا تزال كبيرة في الحيوانات المعالجة الصورية نظرا الأيزوفلورين، الآلية الجزيئية الكامنة تكييف الدماغية بعيد قد يكون ملثمين من آثار التخدير. الكيتامين، وهو خصم NMDA، لديها العديد من آثار وقائية في الجسم الحي 38، بما في ذلك القدرة على منع التحفيز الزائدة في الخلايا العصبية، وتفعيل مسار mTOR س والافراج عن BDNF في المصل 39-41. تم الإبلاغ عن الكيتامين لتعزيز بقاء الخلايا العصبية التالية ارتجاج المخ في الإنسان والحد من إصابة خفيفة في المستقبلات الضوئية القوارض 42،43. والتحقيق في آلية تكييف الدماغية عن بعد مع الدم مستيقظا الضغط استكفاف تجنب يفند التخدير.

يعتمد الفعال نقص التروية هند أطرافهم على موضع الصحيح من الكفة، اتساق ضغط الكفة وارتفاع ضغط الكفة فوق systoيسانس ضغط الدم كما رأينا في الشكل 1. A صفعة وضعت تحت "الركبة" لا يحمي خلايا مستقبلة للضوء من إصابة خفيفة على النحو المبين في خفض مخطط كهربية (أرج) سعة. الاختلاف في تكييف على أساس الموقف من صفعة هو الأرجح بسبب الاختلافات في كتلة العضلات وقربها من الشريان الفخذي. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن الحيوانات تكون موحدة بالنسبة للعمر والوزن ودرجة حرارة الجسم والجنس.

باختصار، نقص التروية عن بعد يمكن أن يتسبب بها غير الغازية كفة ضغط الدم، والذي يتجنب اصابة في العضلات ولديه المرونة للتجريب مستيقظا أو تخدير. شروط مسبقة الدماغية البعيد هو استراتيجية اعصاب الناشئة ويدخل هذا البروتوكول تمكين مزيد من الدراسات في آليات وتطبيقاته.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer Welch Allyn DS56 Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack Welch Allyn 5082-102-1 Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor Welch Allyn 5082-178 Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod AD Instruments ML 309 skin tempertature unit
Skin temperture probe AD Instruments MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Towel optional: awake remote ischemia
Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) Abbot Animal Health 05260-05 optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4 (1), 40-50 (2013).
  2. Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (5), 851-859 (2012).
  3. Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35 (6), 1264-1273 (2002).
  4. Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
  5. Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29 (9), 1937-1950 (1998).
  6. Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (5), 777-785 (1998).
  7. Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35 (3), 616-621 (2004).
  8. Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30 (9), 1851-1854 (1999).
  9. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (3), 1348-1354 (2003).
  10. Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890 (1), 118-129 (2001).
  11. Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70 (2), 212-221 (2006).
  12. Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4666-4670 (1995).
  13. Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26 (5), 248-254 (2003).
  14. Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33 (5), 514-519 (2011).
  15. Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151 (4), 1099-1103 (2008).
  16. Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
  17. Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123 (7), 714-721 (2011).
  18. Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109 (7), 2398-2404 (2002).
  19. Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106 (23), 2881-2883 (2002).
  20. Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5 (2), 211-230 (1965).
  21. Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94 (10), L78-L80 (2008).
  22. Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79 (18), 1853-1861 (2012).
  23. Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42 (10), 921-929 (2009).
  24. Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A (6), 865-868 (1986).
  25. Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200 (1), 69-79 (2002).
  26. Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55 (4), (2014).
  27. Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (9), 1667-1677 (1997).
  28. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8 (7), 718-724 (2002).
  29. Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 251-254 (2011).
  30. Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42 (2), 439-444 (2011).
  31. Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50 (1), 63-74 (2006).
  32. Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84 (4), 445-458 (2007).
  33. Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29 (10), 2171-2180 (1998).
  34. Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347 (8999), 422-425 (1996).
  35. Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241 (4874), 1817-1820 (1988).
  36. Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24 (7), 730-735 (2002).
  37. Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (1), H61-H68 (2002).
  38. Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
  39. Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18 (4), 479-483 (1993).
  40. Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11 (10), 666 (2010).
  41. Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (1), 140-144 (2008).
  42. Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5 (10), 747-757 (2004).
  43. Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).

Tags

الطب، العدد 100، شروط مسبقة الدماغية البعيد، تكييف الدماغية والتسامح الدماغية، والإصابة الخفيفة، العصبية، العصبية بوساطة والسكتة الدماغية وشبكية العين، مخطط كهربية، الفئران
أطرافهم بعد الدماغية شروط مسبقة: تقنية اعصاب في القوارض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brandli, A. Remote Limb Ischemic… More

Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: A Neuroprotective Technique in Rodents. J. Vis. Exp. (100), e52213, doi:10.3791/52213 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter