Summary
Remote iskæmisk prækonditionering (RIP) er en metode til konditionering væv mod skadelig stress. Vi har etableret en metode til remote iskæmi på bagbenet, ved at puste en sphygmomanometer manchet i 5-10 min. De neurobeskyttende evner RIP er blevet påvist i en model for retinal degeneration hos gnavere.
Abstract
Subletale iskæmi beskytter væv mod efterfølgende, mere alvorlig iskæmi gennem opregulering af endogene mekanismer i det påvirkede væv. Subletale iskæmi er også blevet vist at opregulere beskyttelsesmekanismer i fjerntliggende væv. En kort periode med iskæmi (5-10 min) i bagbenet af pattedyr inducerer selvbeskyttende reaktioner i hjernen, lunger, hjerte og retina. Effekten er kendt som remote iskæmisk prækonditionering (RIP). Det er en terapeutisk lovende måde at beskytte vitale organer, og er allerede under kliniske forsøg for hjerte- og hjerneskader. Denne publikation viser en kontrolleret, minimalt invasiv fremgangsmåde til fremstilling af et lem - specifikt bagbenet af en rotte - iskæmisk. En blodtryksmanchet udviklet til anvendelse i humane nyfødte er forbundet til en manuel blodtryksmåler og anvendes til at påføre 160 mmHg tryk omkring den øverste del af bagbenet. En probe designet til at detektere hudtemperatur anvendes til at verificere ischemia, ved at registrere fald i hudens temperatur forårsaget af tryk-induceret okklusion af benet arterier, og stigningen i temperatur, der følger frigivelsen af manchetten. Denne metode til RIP yder beskyttelse til rotten nethinden mod stærkt lys-induceret skade og degeneration.
Introduction
Overlevelsen af de fleste, måske alle, kan væv i lyset af metabolisk stress forbedres ved forudgående konditionering med en periode med subletal iskæmi 1,2. Iskæmisk prækonditionering (IP) i praksis er eksponeringen af væv til subletal iskæmi, før vævet oplevelser mere alvorlige stressfaktorer, såsom en efterfølgende iskæmiske skade. I dyremodeller, IP giver slående beskyttelse til hjernen, retina, hjerte og lunger 3-6. Tilsvarende observationer i patienter med slagtilfælde viste en sammenhæng mellem tidligere forbigående iskæmiske anfald og bedre kliniske resultater 7,8. IP beskytter også retinale fotoreceptorer fra ikke-iskæmiske skader 9.
Effektiviteten af IP i forskellige væv og skader foreslår, at det aktiverer en medfødt mekanisme for celleoverlevelse stede i alle væv. Iskæmisk prækonditionering af myokardiet er blevet foreslået at have beskyttende virkninger gennem opreguleringenaf hypoxi inducerbare faktor (HIF), kendt for at regulere mange metaboliske veje gennem frigivelse af adenosin eller gennem åbningen af mitokondrie ATP kaliumkanaler 10,11. Adenosin frigivelse og ATP kaliumkanaler er impliceret i cerebral iskæmi, men undersøgelser af neurobeskyttende mekanismer iskæmisk konditionering til dato har været fokuseret på ændringer anti-excitotoksicitet, antiapoptotiske og anti-inflammatoriske veje 12,13. Samlet, forståelse af den molekylære proces med iskæmisk condition for at beskytte neuroner er begrænset.
Fjerntliggende iskæmisk prækonditionering forsøg på at konditionere fjerntliggende kritisk vigtige organer (hjerte, hjerne, lunge) ved at generere iskæmi i mindre kritiske væv. Remote iskæmisk prækonditionering (RIP) under anvendelse bagbenet har vist sig at være neurobeskyttende i gnavermodeller for slagtilfælde 14-17. Beskrevet af os fremgangsmåde tilvejebringer en enkel, pålidelig og ikke-invasiv protocol til induktion RIP.
Langt størstedelen af RIP protokollerne omfatter bagbenet, formentlig fordi den femorale arterie beliggende i den øvre bagben kan let identificeres og tilgås til kirurgisk fastspænding og årepresse ansøgning. Ved invasiv lemmer iskæmiske studier til undersøgelse af hjernen og hudbeskyttelse, er iskæmi induceres ved at adskille den femorale arterie fra lysken ledbånd og fastspænde femorale arterie 2,15,18.
Den iskæmi er resultatet af enten lemmer infiltration eller femoral arterie fastspænding er blevet bekræftet af ændringer på lemmet, herunder tab af puls, nedsat iltning og et fald i hudtemperatur. Fjernbetjening iskæmi kan bekræftes ved tabet af puls ved hjælp af laser Doppler eller ultralyd Doppler 17-19. Hudtemperatur kan anvendes som alternativ til Doppler selvom forholdet er ikke-lineær 20,21. Nøjagtige temperaturmålinger optagelser er almindelige i laboratorier og dåselet inkorporeres i fjerntliggende iskæmiske studier.
Et alternativ til femoral fastspænding kirurgi er induktionen af iskæmi under anvendelse af en tourniquet. Årepresse ansøgning producerer sammenlignelig iskæmi til der opnås med skib fastspænding; Kutchner et al. sammenlignet invasiv femoral arterie fastspænding til en ikke-invasiv årepresse og fundet begge metoder standset blodtilførslen til lemmet og reduceret skade huden i en plastikkirurgi model af hudlap iskæmi 18. Cuffing enten benet eller armen og hæve manchettrykket til over systolisk blodtryk har vist sig at være beskyttende mod iskæmisk skade hos svin og mennesker 17,19,22.
Forskellige årepresse tilgange til at inducere remote iskæmisk indbefatter anvendelsen af en blodtryksmanchet eller et elastisk bånd 17,22,23. Men brugen af et elastisk bånd til at inducere iskæmi er en usikker metode, potentielt giver anledning til en ureguleret mængde tryk ilemmer, med tryk stiger over 500 mmHg bliver optaget i mennesker 24. Yderligere, iskæmi i lemmerne under anvendelse af et elastisk bånd medfører muskelskader hos rotter efter fjernelse af båndet 23, som vurderet af Evans blå farve, en in vivo markør for myofiber permeabilitet 25. I modsætning hertil kan levering af et kontrolleret tryk til årepresse opnås ved anvendelse af en blodtryksmanchet forbundet med en blodtryksmåler 17,19,22,26.
I denne undersøgelse blev en lys skade model af fotoreceptordegenerering anvendes til at demonstrere den neurobeskyttende virkningsfuldhed af fjernstyret iskæmisk prækonditionering. Remote iskæmi blev induceret umiddelbart før lys skade, og forhindrede efterfølgende fotoreceptordegenerering som bekræftet ved retinal funktion test. Den ledsagende video vil demonstrere anvendelsen af non-invasiv remote iskæmi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Protokollen følger retningslinjerne dyr pleje af University of Sydney, AEC # 5657. Anæstesi blev godkendt af dyreetik komité (University of Sydney, AEC # 5657).
1. Udstyr Forberedelse
- Bruge realtid hudtemperatur tracking. Tænd computeren, og datafangst hardware.
- Åben temperatur optagelse software og justere temperaturindstilling til mellem 30-35 ° C, og hyppigheden af prøveudtagningen til hver 100 ms.
- Valgfrit: Indsæt rektal termometer for at sikre kernetemperatur forbliver stabil ved 37,5 ° C.
2. Kalibrering af Manuel blodtryksmaaler
- Tilslut neonatal manchetten at sphygmomanometer.Use en størrelse 2 manchet for en 250-550 g rotte. Det kan være nødvendigt en adapter til at tilslutte manchetten slangen til blodtryksmåleren.
- Tømme manchetten ved enten at løsne luft frigivelse ventil eller manchetten slangen frakobles fra tilpasseeller. Sikre intet tryk forbliver i slangen og manometeret nålen hviler på nul inde i ovale / rektangel.
- Kontroller trykket mellem slanger, manometer og manchet. Pump manchetten med blide pumper af inflationen pære, indtil det lyder 100 mmHg på manometer. Sørg trykket forbliver konstant. Tømme manchetten ved langsomt at åbne luften release værdi.
3. Animal Forberedelse
Bemærk: Dyr, der skal undergå lys skade kræver mørke tilpasning aftenen før remote iskæmi. Dyr, der let skader kræver mørke opdræt (12 timers lys: mørke-cyklus (5 lux))
- Udfør remote iskæmi i enten vågen eller bedøvede gnavere. Sikre, at dyr har en sund muskeltonus. Sikre dette ved at klemme den øverste bagben for at bekræfte, at der er tilstrækkelig muscle stede. RIP-induceret beskyttelse mod lys skade er blevet testet i stillesiddende rotter op til 6 måneders alderen.
- Bedøvet forberedelse til RIP
- Injicere rotter med en intraperitoneal injektion af 60 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin. Kontrollere dybden af anæstesi ved at udvide benet og klemme huden på undersiden af foden. Dyret har ingen refleks, hvis det er dybt bedøvet. Anvend kunstige tårer for at undgå hornhinde tørhed, mens under anæstesi.
- Placere rotter på enten en varmepude eller vandvarmer slanger cirkulerer at opretholde en konstant kropstemperatur på 37,5 ° C. Placer rotte i liggende stilling med benene 'trædepuder opad. Enten højre eller venstre ben kan undergå remote iskæmi.
- Vågen forberedelse til RIP
Bemærk: Awake dyreforsøg kræver to personer. Én person fastholder dyret og den anden person driver den manuelle blodtryksmåler. Eksperimentatorer skal være sikker på at udføre proceduren som tilbageholdenhed øger risikoen for skade på handlere. Rotterne undergår remote iskæmi skal konditioneres to manuel tilbageholdenhed. Afhængig af intuitive retningslinjer manuel tilbageholdenhed bør være fremskridt fra 30 sek til et maksimum på 5 minutter over et antal uger. Frygtsomme dyr, der undlader at akklimatisere til manuel tilbageholdenhed bør udelukkes fra vågen eksperimenter. Endelig manuel tilbageholdenhed kan forårsage stress (og potentielt introducere andre variable til studiet) til dyr, og en fingeret kohorte (placering af manchet uden inflammation) skal bruges til præcist at fortolke RIP undersøgelsens resultater.- Skær et håndklæde i en 15 cm x 30-50 cm stykke og placere den korte kant vinkelret på rottens ryg, der dækker hovedet til toppen af bagbenene.
- Tuck den korte kant under rottens torso stramt og begynde at pakke rotten med den resterende lange kant håndklæde. Fastgør indpakkede dyr under armen i en liggende stilling. Hvis rotten holdes under venstre arm, befri rottens højre ben fra håndklædet.
4. Ansøgning of hudtemperatur Probe
- Forlænge benet af rotten som skal undergå iskæmi og placere huden sonde på trædepuden. Placer huden proben for at maksimere kontakten mellem temperaturføleren og huden. Skub sonden i trædepuden og anbringe sonden med papir tape.
- Kontroller huden sonden placering ved at spore temperaturen på temperaturen optagelse software. Sørg for, at huden er mellem 30-34 ° C og forbliver stabil. Spor huden temperatur i 1-2 min. Justere huden sonden hvis temperaturen er ustabil eller under 30 ° C.
5. Fjernbetjening Iskæmi
- Tømmes manchetten og sikre lufttrykket ventilen er lukket. Forlænge benet og løst omkranser manchetten på den øvre bagben. Bruge pege- og tommelfinger at forlænge benet og de lavere tal for at holde den løsnede manchetten i position.
- Hæv bedøvet dyrets manchettryk til 160 mmHg, og vågne dyr trin påase manchettrykket til 180 mmHg.
Bemærk: bedøvet blodtryk hos rotter spænder fra 120 til 140 mmHg og stiger til 160 mmHg, når bevidst. Påbegynde timeren og mund temperatur optagelser, når det korrekte tryk er nået.
Bemærk: Foden temperatur skal falde med 2 ° C efter 5 min af konstant tryk. - Fastholde positionen af manchetten over dyrets "knæ" i hele iskæmi. Manchettrykket vil begynde at falde efter et par minutter, eller hvis rottens lemmer er i bevægelse.
- Gentagne gange pumpe inflation pære i korte stød at opretholde det ønskede manchettrykket gentagne korte burst af pumpning
- Remote iskæmi kan leveres kontinuerligt i mellem 5 og 15 min. Den iskæmireperfusion Protokollen omfatter 2 perioder af 5 min iskæmi med en mellemliggende 5 min reperfusion.
- Tømme manchetten trykket ved at løsne lufttrykket ventil. Check temperaturændringen i løbet af iskæmi proprotokol. Slip manchetten.
- Fortsæt med skade eksperimenter. Dyr under påvirkning af anæstesi skal være placeret på en varmepude. Fortsætte med at overvåge dyrene indtil ambulant. Dyr kan ikke returneres til huset, indtil du går.
6. Light skade - Retinal Degeneration Model
- Mørk tilpasse dyrene natten over (12-15 timer). Umiddelbart efter remote iskæmi konditionering eller sham fjernbetjening iskæmi (animalsk tilbageholdenhed) sted dyr i Perspex boliger med mad og vand.
- Tænd lysstofrør (1.000 lux) placeret over Perspex boliger klokken 9 til 24 timer. Efter lyseksponering returnere dyrene at dæmpe cyklisk belysning i 7 dage.
7. Post-remote iskæmi Procedurer
- Vision vurdering elektroretinogram (ERG):
Bemærk: ERG opsætning og flash-protokol fulgte Brändli og Stone 26.- Mørk tilpasse dyr natten over (12-15 timer). Underdim rød belysning bedøver dyrene ved intraperitoneal injektion af ketamin og xylazin (60 mg / kg og 5 mg / kg). Mydriatisk (atropinsulfat 1,0%), corneal bedøvelsesmiddel (proxymetacaine 0,5%).
- Anvende hornhinde hydratisering (Carbomer polymer) øjendråber straks til hornhinden. Anvende eye gel ved 20 minutters intervaller for at opretholde hornhindens hydrering.
- Tegn en løst bundet tråden omkring øjeæblet for at hjælpe stabile ERG optagelser. Overvåge temperatur ved hjælp af en rektal sonde og opretholde dyrets kropstemperatur ved 37-37,5 ° C.
- Placer hovedet inde i en Ganzfeld integrerende kugle.
Bemærk: Den Ganzfeld er en fuldt programmerbar lys stimulus, der leverer ensartede Whit blinker fra lysdioder til øjet. - Optage elektroretinogrammet anvendelse af en specialfremstillet 4 mm platin positive elektrode let rører hornhinden og en 2 mm diameter Ag / AgCl pellet elektrode indsat i munden. Referere begge elektroderne til en kanyle af rustfrit stålindsat subkutant i rumpen.
- Optag signaler med band-pass indstilling 0.3-1,000 Hz (-3 dB), med en 2 kHz erhvervelse sats (AD Instruments). Efter en stabil ERG optagelse er etableret emne dyret til en 10 min mørk tilpasning før de påbegynder optagelser.
- Følg flash-protokol som tidligere beskrevet af Brändli og Stone 26.
- Programmere varigheden af flash (vi brugte blinker 1-2 msek i varighed), og sæt dens intensitet til -4,4 til 2,0 log scot cd.sm -2. Brug lyse blinker (2,0 log scot cd.sm -2, 1 ms) for at måle nethindens funktion. I denne undersøgelse er det sammenligningen mellem kontrol, lys skade og lette skader med RIP.
8. TUNEL Assay
- Aflive dyr ved intraperitoneal injektion af phenobarbital overdosis (100 mg / kg). Enucleate øjnene og løse i 4% paraformaldehyd.
- Vask øjnene i PBS, før cyroprotectingøjne natten over i 30% sucrose (w / v). Integrer øjnene i oktober sammensatte og skæres i 20 um sagittale snit ved hjælp af en kryostat.
- Udfør TUNEL-analysen på retinale sektioner med DAPI farvning efter protokollen af Maslim et al. 27
- Anvende fluorescensmikroskopi for TUNEL tællinger af nethinden. TUNEL-celler blev registreret fra det ydre cellekernelag (ONL); det yderste lag af nethinden, som indeholder fotoreceptor kerner. I denne undersøgelse blev TUNEL tællinger foretaget in triplo for hvert øje, med 5 øjne for hver behandlingsgruppe.
- Brug en-vejs ANOVA statistiske sammenligne gruppe betyder kontrol, lys skade, og lys skade + RIP rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En blodtryksmanchet hævet til over 160 mmHg stopper blodtilførslen til bagben, som det ses tydeligt i figur 1B. Den manglende vævsoxygenering resulterede i en reduktion af dyrets mund temperatur i en iskæmi-reperfusion protokol (figur 2). Foden temperatur (33 ° C) var lavere end kernetemperatur og pålideligt reduceret under manchettrykket elevation (31 ° C) stiger, når manchetten blev tømt for luft (32 ° C). Et enkelt 1.000 lux lys skade blev leveret til dim rejst albinorotter med eller uden fjernbetjening iskæmisk konditionering. Retinafunktionen blev registreret og vurderet under anvendelse af elektroretinogram (ERG).
ERG er summation af elektriske reaktioner stammer fra de indre og ydre neuroner i nethinden for lys stimulation som vist i figur 3. ERG bølgeform har en tidlig negativ top skyldes fototransduktion (mindst ca. 10 msek efter light flash) betegnes a-bølge og en stor positiv højdepunkt fra den indre nethinde (maksimum ca. 80 ms efter lysglimt) betegnes b-bølgen. Den mørke-tilpasset ERG fra en normal dim hævet rotte viste en stor fotoreceptor og indre nethinde reaktion på en lys 2,0 log cd.sm -2 flash (figur 3A). En uge efter lys skade de ERG optagelser haft en alvorlig reduktion i amplitude i forhold til kontrol, hvilket afspejler tabet af fotoreceptorer; se figur 3B. Prækonditionering bagbenet med iskæmi under anvendelse af en reperfusion protokol på 2 x 5 minutter umiddelbart før iskæmi beskyttet fotoreceptorerne fra lette skade. De RIP ERG amplituder var større end lyset skade alene, med en lille reduktion til a-bølge se (figur 3C). Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay på kryopræserverede afsnit af nethinden bekræftede en reduktion af apoptotiske celler i lette beskadigede dyr, der modtog RIP reltiv til sham-behandlede lys skade dyr (figur 4).
Induktionen af iskæmi til bagbenet er afhængig af den korrekte placering af manchetten, som ses i figur 1. En manchet placeret under "knæ" ikke beskytter fotoreceptorer mod lys skade som afspejlet i de reducerede ERG-amplituder, se figur 3D.
Afslutningsvis, når det administreres korrekt bagben iskæmi var i stand til at beskytte retinale neuroner mod lys skade.
Figur 1:. Cuff placering og effekt af manchetten tryk over 160 mmHg (A) Viser bagben og fod før manchettryk elevation. (B) viser foden under forøgelse af manchettrykket over 160 mmHg. Bemærk placeringen af manchetten over "k nee ". Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Foot temperatur reduceres under manchetten inflation Inflationen af manchetten på bagben i 2 x 5 minutter ved 160 mmHg reducerede hudtemperatur under iskæmi. (A) Viser gennemsnittet gruppen for 2 x 5 min RIP fod temperaturændringer. (B) viser et repræsentativt fod temperatur (° C) sporing for 2 x 5 min iskæmi. Klik her for at se en større version af dette tal.
00 "/>
Figur 3:. RIP bevarer retinal funktion påvist i ERG i forhold til lys skader rotter Udsættelse for skarpt lys i 24 timer skader fotoreceptorer i nethinden. ERG måler sundhed indre og ydre nethinde som en elektrisk reaktion (mikrovolt [μV]) til lys stimulation. Den normale retinale respons på 2,0 log cd.sm -2 lysstimulering set i (A). Fotoreceptor skader fra lyse lys resulterer i en mindre ERG amplitude (B). RIP var i stand til at redde fotoreceptorer følgende lys skade (C). Forkert placering manchet under RIP beskytter ikke fotoreceptorer fra skade (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4: TUNEL + celletal. En søjlediagram sammenligner koncernresultat for let tilskadekomst, skade + RIP demonstrerer reduktionen i apoptose med RIP. TUNEL + celle blev talt på tværs af hele spektret af nethinden (8.000 um). Topplade: gruppe gennemsnit af TUNEL + -celler var lavere for RIP behandlede rotter (210 ± 4.9, n = 5) sammenlignet med lys skade alene (255 ± 10, n = 5), p <0,01, envejs ANOVA. Ubeskadigede nethinder (intet lys skade) havde meget lav (3,0 ± 1,4, n = 5) apoptotiske celler. (A) Repræsentant billede af fineste lys sårede nethinden. (B) Repræsentant billede af fineste RIP-lys såret nethinden. (C) Repræsentant billede af ringere lys sårede nethinden. (D) Repræsentant billede af ringere RIP-light sårede nethinden. Klik her for at se en større version af dettefigur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gnaver bagben iskæmi blev induceret med succes med en manuel blodtryksmåler og manchet leverer neurobeskyttelse til fotoreceptorerne i nethinden. Et fund i overensstemmelse med iskæmisk konditionering induceret beskyttelse af fotoreceptorer mod lys skade 9,28.
Væsentlige, remote iskæmi forårsager korte ilt afsavn til væv. Derfor remote iskæmisk prækonditionering har mange ligheder med iskæmisk konditionering eller alternativt betegnet iskæmisk tolerance, hypoksisk forkonditionering og i nogen grad, anaerob motion. Celler reagerer på iskæmisk udfordring ved at frigive en lang række proteiner, nukleosid- og transkriptionsfaktorer, som enten giver neurobeskyttelse direkte eller påvirker celler til at blive tolerant over efterfølgende metabolisk stress 13.
I litteraturen har fjerntliggende iskæmi protokoller omfattede en række varigheder og frekvenser. Vores laboratorium har testet 5, 10,og 2 x 5 min iskæmi protokoller om normal retina-funktion 26. Af disse protokoller 2 x 5 min produceret den største ERG amplitude ændring i normale rotter og blev valgt til at teste i en model for lys skade. Korte og gentagne 5 min iskæmiske hændelser er også blevet vist at være forebyggende i tilbagevendende slagtilfælde hos mennesker og reducere infarktstørrelse i eksperimentel slagtilfælde hos svin 17,22. Imidlertid vil sandsynligvis være afhængig af den anvendte dyremodel den mest hensigtsmæssige varighed iskæmisk prækonditionering. For eksempel er der blevet observeret en reduktion i infarktstørrelse mod fokal iskæmi i længere 2 x 15 minutter og 3 x 15 min protokoller, men ikke i 3 x 5 min protokoller i rotter 15.
Tiden mellem IP og iskæmisk skade skal også overvejes for effektiv neuroprotektion. To tidsvinduer er blevet klassificeret for kardiobeskyttelse induceret af IP. Dette er de "klassiske condition" vinduet, som opstår 0-12 timer efter IP ogden "anden vindue", som opstår 3-4 dage efter IP 29. I et samlingspunkt slagtilfælde model blev RIP fundet at være beskyttende på flere tidspunkter, herunder uden for de klassiske og andet vinduer 15. Der har dog været få undersøgelser, der har sammenlignet de perioder af neurobeskyttelse i RIP og IP.
En yderligere overvejelse til fjernbetjening iskæmi beskyttelse timingen af konditionering, herunder om det anvendes før skade (konditionering), eller efter skade (postconditioning). Størstedelen af fjerntliggende iskæmi test har brugt forkonditionering trods postconditioning undersøgelser har for nylig vist sig at være beskyttende både retinale og cerebrale neuroner 30,31.
Sammenfattende induktionen af neurobeskyttelse i bagbenet iskæmisk konditionering er specifik for sygdomsmodel, dyreart, varigheden af iskæmi, og timingen af iskæmi. En gennemgang af Kaniora et al. provides yderligere detaljer om de mange forskellige fjerntliggende iskæmi protokoller, herunder arter, RIP protokoller, RIP sites, skade modeller, skade resultater og foreslåede beskyttelsesmekanismer 32.
Den minimalt invasiv manchetten på bagbenet tillader RIP i både vågen og dyr billede kropstemperaturen opretholdes. I bedøvede eksperimenteren, skal dyrets kropstemperatur sikres for at undgå hypotermi. Overvågning indre temperatur vil forhindre dyret undergår hypotermi og hypertermi. Hypotermi og hypertermi er velkendte pre-conditioning stimuli i både slagtilfælde modeller og let skade 33-36. Den JOVE metode præsenteres kan udføres i vågne dyr derved forhindrer kropstemperatur andre variable.
Bedøvelsesmidler kan indføre et andet sæt af andre variable i RIP eksperimenter. Isofluran kan deltage i myocardium beskyttelse via åbningen ATP-sensitive kalium- ch afannels, en lignende beskyttende mekanisme rapporteret i iskæmisk konditionering 37. Selv om størrelsen af infarktet med slagtilfælde modeller forbliver store i sham-behandlede dyr, der fik isofluran, kan den molekylære mekanisme underliggende remote iskæmisk konditionering være maskeret af virkningerne af anæstetika. Ketamin, en NMDA-antagonist, har et væld af beskyttende virkninger in vivo 38, herunder muligheden for at forhindre excitotoksicitet til neuroner, aktivere mTOR pathway og frigivelse BDNF i serum 39-41. Ketamin er blevet rapporteret at forbedre neuronal overlevelse efter hjernetraume i mennesker og reducere lys skade i gnavere fotoreceptorer 42,43. Undersøgelser mekanismen for remote iskæmisk konditionering med vågen blodtryk infiltration undgår bedøvende andre variable.
Effektiv bagben iskæmi er afhængig af den korrekte placering af manchetten, konsekvens af manchettrykket og manchettrykket højde over systolic blodtryk, som det ses i figur 1. En manchet placeret under "knæet" beskytter ikke fotoreceptorer mod lys skade som afspejlet i de reduceret elektroretinogram (ERG) amplituder. Forskellen i konditionering baseret på positionen af manchetten er sandsynligvis på grund af forskelle i muskelmasse og nærhed til den femorale arterie. Desuden skal dyrene standardiseret for alder, vægt, kropstemperatur og køn.
Sammenfattende kan remote iskæmi induceres ved en ikke-invasiv blodtryksmanchet, som undgår muskelskade og har fleksibiliteten for vågen eller bedøvet eksperimenter. Fjernbetjening iskæmisk konditionering er en spirende neuroprotektiv strategi og denne protokol vil sætte yderligere undersøgelser i sine mekanismer og applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer | Welch Allyn | DS56 | Manual Sphygmomanometer |
| Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack | Welch Allyn | 5082-102-1 | Limb blood pressure cuff |
| Luer lock adaptor | Welch Allyn | 5082-178 | Adaptor for neonatal cuff |
| Thermistor pod | AD Instruments | ML 309 | skin tempertature unit |
| Skin temperture probe | AD Instruments | MLT 422/A | |
| Powerlab, 4 channel acquistion hardware | AD Instruments | PL 35044 | |
| Homeothermic blanket system with flexible probe | Harvard Appartus | 507222F | |
| Towel | optional: awake remote ischemia | ||
| Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) | Abbot Animal Health | 05260-05 | optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia |
| Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia | |
| Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia |
References
- Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4 (1), 40-50 (2013).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (5), 851-859 (2012).
- Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35 (6), 1264-1273 (2002).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29 (9), 1937-1950 (1998).
- Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (5), 777-785 (1998).
- Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35 (3), 616-621 (2004).
- Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30 (9), 1851-1854 (1999).
- Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (3), 1348-1354 (2003).
- Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890 (1), 118-129 (2001).
- Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70 (2), 212-221 (2006).
- Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4666-4670 (1995).
- Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26 (5), 248-254 (2003).
- Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33 (5), 514-519 (2011).
- Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151 (4), 1099-1103 (2008).
- Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
- Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123 (7), 714-721 (2011).
- Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109 (7), 2398-2404 (2002).
- Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106 (23), 2881-2883 (2002).
- Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5 (2), 211-230 (1965).
- Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94 (10), L78-L80 (2008).
- Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79 (18), 1853-1861 (2012).
- Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42 (10), 921-929 (2009).
- Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A (6), 865-868 (1986).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200 (1), 69-79 (2002).
- Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55 (4), (2014).
- Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (9), 1667-1677 (1997).
- Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8 (7), 718-724 (2002).
- Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 251-254 (2011).
- Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42 (2), 439-444 (2011).
- Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50 (1), 63-74 (2006).
- Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84 (4), 445-458 (2007).
- Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29 (10), 2171-2180 (1998).
- Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347 (8999), 422-425 (1996).
- Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241 (4874), 1817-1820 (1988).
- Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24 (7), 730-735 (2002).
- Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (1), H61-H68 (2002).
- Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
- Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18 (4), 479-483 (1993).
- Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11 (10), 666 (2010).
- Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (1), 140-144 (2008).
- Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5 (10), 747-757 (2004).
- Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).
