Summary
Remote ischemische preconditionering (RIP) is een werkwijze voor het conditioneren weefsels tegen schadelijke stress. We hebben een methode van remote ischemie vastgesteld op de achterste ledematen, door het opblazen van een bloeddrukmeter manchet voor 5-10 min. De neurobeschermende capaciteiten van RIP zijn aangetoond in een model van retinale degeneratie in knaagdieren.
Abstract
Subletale ischemie weefsels beschermt tegen latere, meer ernstige ischemie door opregulatie van endogene mechanismen in het aangetaste weefsel. Subletale ischemie is ook aangetoond dat beschermingsmechanismen upregulate afgelegen weefsels. Een korte periode van ischemie (5-10 min) in de achterste ledematen van zoogdieren induceert zelfbeschermende reacties in de hersenen, longen, hart en retina. Het effect is bekend als remote ischemische preconditionering (RIP). Het is een therapeutisch veelbelovende manier van bescherming van vitale organen, en is nu al onder de klinische proeven voor het hart en de hersenen verwondingen. Deze publicatie toont een gecontroleerde, minimaal invasieve werkwijze voor het maken van een ledemaat - speciaal de achterpoot van een rat - ischemische. Een bloeddrukmanchet ontwikkeld voor humane neonaten is verbonden met een handmatige sfygmomanometer en gebruikt om 160 mmHg druk uitoefent rond het bovenste gedeelte van de achterste ledematen. Een sonde ontworpen om huidtemperatuur sporen wordt gebruikt om te controleren ischemia, door registratie van de temperatuurdaling huid veroorzaakt door drukgeïnduceerde occlusie van de beenslagaders en de temperatuurstijging wat afgifte van de manchet volgt. Deze methode van TNO biedt bescherming aan de rat retina tegen fel licht veroorzaakte schade en degeneratie.
Introduction
De overleving van de meeste, zo niet alle weefsels in aanwezigheid van metabole stress kan worden verbeterd door voorafgaande conditionering met een periode van subletale ischemie 1,2. Ischemische preconditionering (IP) in de praktijk is de blootstelling van weefsel subletale ischemie, voordat het weefsel ervaringen ernstiger stressoren, zoals een volgend ischemische schade. In diermodellen IP geeft opvallend bescherming aan de hersenen, retina, hart en longen 3-6. Dienovereenkomstig, waarnemingen bij patiënten met een beroerte toonde een verband tussen de eerdere TIA's en een betere klinische resultaten 7,8. IP beschermt ook retinale fotoreceptoren van niet-ischemische verwondingen 9.
De effectiviteit van IP in diverse weefsels en letsels suggereert dat het activeren van een aangeboren mechanisme van celoverleving in alle weefsels. Ischemische preconditionering van het myocard is gesuggereerd om beschermende effecten door de upregulation hebbenhypoxie induceerbare factor (HIF), bij velen bekend metabole routes te reguleren door het vrijkomen van adenosine of door de opening van de mitochondriale ATP kaliumkanalen 10,11. Adenosine afgifte en ATP kaliumkanalen zijn betrokken bij cerebrale ischemie maar onderzoek naar de neuroprotectieve mechanismen van ischemische conditionering tot nu toe gericht op modificaties van anti-excitotoxiciteit, anti-apoptotische en anti-inflammatoire pathways 12,13. Algemeen begrip van het moleculaire proces van ischemische conditionering voor bescherming neuronen beperkt.
Remote ischemische voorconditionering pogingen conditioneren verre kritisch belangrijke organen (hart, hersenen, long) door het opwekken van ischemie minder kritische weefsels. Remote ischemische preconditionering (RIP) met behulp van de achterste ledematen is aangetoond neuroprotectieve in knaagdiermodellen van een beroerte 14-17 te zijn. De werkwijze beschreven door ons een eenvoudige, betrouwbare en niet-invasieve protocol voor het induceren van TNO.
De overgrote meerderheid van RIP protocollen omvatten het achterste lidmaat, waarschijnlijk omdat de femorale slagader in het bovenste achterste ledematen gemakkelijk herkenbaar en toegankelijk voor chirurgische klem- en tourniquet toepassing. In ischemische ledematen invasieve studies voor het onderzoek van de hersenen en huidbescherming, ischemie geïnduceerd door het scheiden van de femorale slagader van de lies ligamenten en klemmend de femorale arterie 2,15,18.
De ischemie die uit een ledemaat cuffing of femorale slagader klemming is bevestigd door veranderingen op het onderdeel inclusief een verlies van puls afname oxygenatie en een daling van de huidtemperatuur. Remote ischemie kan worden bevestigd door het verlies van puls met laser Doppler of Doppler ultrasound 17-19. Huidtemperatuur kan worden gebruikt als alternatief voor Doppler hoewel de relatie niet lineair 20,21. Accurate temperatuur opnames zijn gemeengoed in laboratoria en blikgemakkelijk opgenomen in remote ischemische studies.
Een alternatief voor femorale vastklemmen operatie is de inductie van ischemie met een tourniquet. Tourniquet toepassing produceert vergelijkbaar ischemie is aan dat van vaartuig klemmen; Kutchner et al. vergeleken invasieve femorale arterie klemmen met een niet-invasieve tourniquet en vonden werkwijzen onderbroken bloedtoevoer naar de ledematen en verminderde huidbeschadiging in een plastische chirurgie model van ischemie huidflap 18. Cuffing hetzij een been of arm en verhogen van de manchetdruk boven de systolische bloeddruk is gevonden beschermde tegen ischemische schade bij varkens en mensen 17,19,22 te zijn.
Verschillende tourniquet zal remote-inducerende ischemische omvatten het gebruik van een bloeddrukmanchet of een elastische band 17,22,23. Het gebruik van een elastische band ischemie induceren een onveilige methode mogelijk die tot een ongereguleerde hoeveelheid druk in deledematen, met de druk stijgt boven de 500 mmHg wordt opgenomen bij de mens 24. Verder ischemie middels een elastische band leidt tot spierbeschadiging in ratten na verwijdering van de band 23, zoals beoordeeld door Evans Blue Dye, een in vivo marker van myofiber permeabiliteit 25. Daarentegen kan de afgifte van een geregelde druk aan de tourniquet worden bereikt met behulp van een bloeddrukmanchet verbonden met een sphygmomanometer 17,19,22,26.
In deze studie werd een lichte letselmodel van fotoreceptor degeneratie werd gebruikt voor het neuroprotectieve effect van externe ischemische preconditionering tonen. Remote ischemie werd onmiddellijk opgewekt voor lichte verwondingen, zodat de daaropvolgende fotoreceptor degeneratie zoals bevestigd door retinale functie testen. De bijbehorende video zal de toepassing van niet-invasieve remote ischemie aangetoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Het protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Universiteit van Sydney, AEC # 5657. Verdoving werd goedgekeurd door dier ethische commissie (Universiteit van Sydney, AEC # 5657).
1. apparatuur Voorbereiding
- Met real-time huidtemperatuur tracking. Schakel op de computer, en de data-acquisitie hardware.
- Open temperatuur opname-software en de temperatuur instelling om tussen de 30-35 ° C en de frequentie van de bemonstering op elke 100 msec te passen.
- Optioneel: Insert rectale thermometer om de kerntemperatuur te garanderen blijft stabiel op 37,5 ° C.
2. De kalibratie van de handleiding Sphygmomanometer
- Sluit neonatale manchet tot een grootte 2 manchet voor een 250-550 g rat sphygmomanometer.Use. Een adapter kan nodig zijn om de manchetslang sluiten op de sphygmomanometer.
- Leeglopen van de manchet door een van beide het losdraaien van de ontluchtingsventiel of het loskoppelen van de manchet slang van de aan te passenof. Zorg ervoor dat er geen druk blijft in de slang en de manometer naald rust op nul in de ovale / rechthoek.
- Controleer de druk tussen slangen, manometer en manchet. Blaas de manchet met zachte pompen van de inflatie lamp totdat het leest 100 mmHg op de manometer. Zorg ervoor dat de druk constant blijft. Leeglopen van de manchet door langzaam openen van de lucht vrijkomen waarde.
3. Animal Voorbereiding
Let op: dieren die aan het licht letsel ondergaan vereisen donkere aanpassing van de avond voor remote ischemie. Dieren die een lichte schade nodig donker opfok (12 uur licht: donker cyclus (5 lux))
- Voer remote ischemie in ofwel wakker of verdoofd knaagdieren. Zorg ervoor dat dieren een gezonde spierspanning. Zorg ervoor dat dit door het knijpen de bovenste achterste ledematen om te bevestigen dat er voldoende spier aanwezig. RIP-geïnduceerde bescherming tegen lichte verwondingen is getest in sedentaire ratten tot 6 maanden oud.
- Verdoofd voorbereiding voor RIP
- Injecteer ratten een intraperitoneale injectie van 60 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine. Controleer de diepte van anesthesie door uitbreiding van het been en het afklemmen van de huid aan de onderzijde van de voet. Het dier heeft geen reflex als het diep is verdoofd. Pas kunstmatige tranen om hoornvlies droog terwijl onder narcose te voorkomen.
- Plaats ratten op ofwel een warmte-pad of circulerende boiler slang aan op een constante lichaamstemperatuur van 37,5 ° C te houden. Plaats de rat in buikligging met de onderste ledematen 'voetzolen naar boven. Ofwel de rechter of linker ledematen kunnen remote ischemie ondergaan.
- Awake voorbereiding RIP
Opmerking: Wakker dierproeven vereist twee personen. Een persoon weerhoudt het dier en de tweede persoon werkt de handmatige bloeddrukmeter. De onderzoekers moeten vertrouwen om de procedure uit te voeren als terughoudendheid verhoogt het risico op verwonding van de verzorgers zijn. De ratten ondergingen afstand ischemie worden geconditioneerd to handleiding terughoudendheid. Afhankelijk intuïtieve richtlijnenboek beperking zou voortgang van 30 sec tot maximaal 5 min gedurende een aantal weken. Timide dieren die niet om te acclimatiseren op handmatig terughoudendheid moeten van wakker experimenten worden uitgesloten. Tenslotte handmatige beperking waarschijnlijk stress (en mogelijk verwart de studie voeren) voor dieren en een sham cohort (plaatsing van manchet zonder ontsteking) veroorzaken worden gebruikt om RIP studieresultaten te interpreteren.- Snijd een handdoek in een 15 cm x 30-50 cm stuk en plaats de korte zijde loodrecht op rug van de rat, die het hoofd naar de top van de achterpoten.
- Plooi de korte zijde onder de romp van de rat stevig en beginnen om de rat wrap met de resterende lange zijde van handdoek. Bevestig de verpakte dier onder de arm in rugligging. Als de rat wordt gehouden onder de linkerarm, bevrijden van de rat juiste ledematen van de handdoek.
4. Toepassing of huidtemperatuursonde
- Verleng de poot van de rat die ischemie ondergaan en plaats de huid sonde op de voetzool. Plaats de huid probe om contact tussen de temperatuur sonde en de huid te maximaliseren. Duw de sonde in de voetzool en brengen zij de sonde met papier tape.
- Controleer de huid probe plaatsing door het bijhouden van de temperatuur van de temperatuur opname software. Zorg ervoor dat de temperatuur van de huid is tussen 30-34 ° C en blijft stabiel. Volg de temperatuur van de huid voor 1-2 min. Pas de huidsensor bij temperaturen onstabiel of beneden 30 ° C.
5. Remote ischemie
- Leeglopen van de manchet en zorgen voor de luchtdruk gesloten is. Verleng de been en losjes omringen de manchet op de bovenste achterste ledematen. Gebruik de wijsvinger en duim aan het been en de lagere cijfers uit te breiden tot de losgemaakte manchet in positie te houden.
- Verhoog manchetdruk het verdoofd dier tot 160 mmHg, en in wakkere dieren Increase de manchetdruk naar 180 mmHg.
Opmerking: De verdoofd bloeddruk van ratten varieert 120-140 mmHg en stijgt tot 160 mmHg bij bewustzijn. Begin van de timer en de voet temperatuur opnames zodra de juiste druk is bereikt.
Opmerking: De voet temperatuur moet dalen met 2 ° C na 5 min van constante druk. - Handhaven positie van de manchet boven het dier "knee" gehele ischemie. Manchetdruk zal beginnen te dalen na enkele minuten, of als onderdeel van de rat beweegt.
- Herhaaldelijk pomp de inflatie lamp in korte uitbarstingen tot de gewenste manchetdruk herhaalde korte uitbarsting van pompen te behouden
- Remote ischemie kan continu tussen 5 en 15 min worden toegezonden. De ischemie-reperfusie protocol bevat 2 periodes van 5 min ischemie met een tussenliggende 5 min reperfusie.
- Leeglopen van de manchet druk door de luchtdruk ventiel los te draaien. Controleer de temperatuurverandering in de loop van de ischemie proprotocol. Laat de manchet.
- Ga verder met letsel experimenteren. Animals onder invloed van anesthesie dient een warmte pad worden geplaatst. Doorgaan met dieren controleren totdat ambulante. Dieren kunnen niet worden teruggestuurd naar behuizing tot wandelen.
6. Licht Schade - retinale degeneratie Model
- Dark passen de dieren 's nachts (12-15 uur). Onmiddellijk na remote ischemie conditionering of sham remote ischemie (dier terughoudendheid) plaats dieren in perspex behuizing met voedsel en water.
- Schakel de TL-verlichting (1000 lux) zich boven Perspex woningen tegen 09:00 gedurende 24 uur. Na blootstelling aan licht, de terugkeer van de dieren aan cyclische verlichting dimmen voor 7 dagen.
7. Post-remote Ischemia Procedures
- Vision assessment met electroretinogram (ERG):
Opmerking: De ERG set-up en flash protocol gevolgd Brandli en Stone 26.- Dark passen dieren 's nachts (12-15 uur). Ondergedimd rode verlichting verdoven dieren door intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine (60 mg / kg en 5 mg / kg, respectievelijk). Mydriatische (atropinesulfaat 1,0%), corneale anesthetische (proxymetacaïne 0,5%).
- Breng corneale hydratatie (Carbomer polymeer) oogdruppels direct op de cornea. Breng ooggel op 20 min tussenpozen hoornvlies hydratatie te behouden.
- Teken een losjes gebonden draad rond de oogbol om stabiele ERG opnames helpen. Monitor temperatuur met een rectale sonde en handhaven lichaamstemperatuur dier bij 37-37,5 ° C.
- Plaats de kop in een Ganzfeld bolfotometer.
Opmerking: De Ganzfeld is een volledig programmeerbaar lichte prikkel die uniform whit flitsen levert van LEDs voor het oog. - Noteer de electroretinogram behulp van een op maat gemaakte 4 mm platina positieve elektrode lichtjes het hoornvlies aan te raken en een 2 mm diameter Ag / AgCl pellet elektrode ingebracht in de mond. Referentie beide elektroden aan een roestvrij stalen naaldsubcutaan ingebracht in de romp.
- Record signalen banddoorlaat- instelling van 0.3-1,000 Hz (-3 dB), met een 2 kHz overname tarief (AD Instruments). Na een stabiele ERG opname vastgesteld onder het dier aan een 10 min aanpassing aan het donker alvorens opnamen.
- Volg het flash protocol zoals eerder beschreven door Brandli en Stone 26.
- Programmeer de duur van de flitser (we gebruikt knippert 1-2 msec duur), en stel de intensiteit -4,4 tot 2,0 log scot cd.sm -2. Gebruik heldere flitsen (2,0 log scot cd.sm -2, 1 ms) aan het netvlies functie te meten. In deze studie is de vergelijking tussen controle, licht letsel en licht letsel met RIP.
8. TUNEL Assay
- Euthanaseren dieren door intraperitoneale injectie van fenobarbital overdosis (100 mg / kg). Ophelderen van de ogen en lossen in 4% paraformaldehyde.
- Was de ogen in PBS vóór cyroprotectingogen 's nachts in sucrose 30% (w / v). Insluiten de ogen in OCT verbinding en gesneden in 20 urn sagittale secties met behulp van een cryostaat.
- Voer de TUNEL test op het netvlies secties met DAPI kleuring volgens het protocol van Maslim et al. 27
- Gebruik fluorescentiemicroscopie voor TUNEL tellingen van het netvlies. TUNEL cellen werden geregistreerd van de buitenste nucleaire laag (ONL); de buitenste laag van het netvlies die fotoreceptorcellen kernen bevat. In deze studie werden TUNEL tellingen in drievoud voor elk oog, met 5 ogen voor elke behandelingsgroep.
- Gebruik one-way ANOVA statistische vergelijking groep betekent controle, licht letsel en lichte verwondingen + RIP ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een bloeddrukmanchet verhoogd tot boven 160 mmHg stopt de bloedstroom naar de achterste ledematen zoals duidelijk te zien in figuur 1B. Het ontbreken van weefseloxygenatie resulteerde in een reducerende temperatuur van de voeten van het dier voor ischemie-reperfusie protocol (Figuur 2). De voet temperatuur (33 ° C) lager dan de eigen temperatuur en betrouwbaar verlaagd gedurende manchetdruk elevatie (31 ° C) stijgt wanneer de manchet is leeggelopen (32 ° C). Een enkele 1.000 lux licht letsel werd geleverd om te dimmen verhoogd albino ratten met of zonder afstandsbediening ischemische preconditionering. Retinale functie werd opgenomen en beoordeeld met behulp van de electroretinogram (ERG).
De ERG is de optelling van elektrische responsen uitgaande van de binnenste en buitenste neuronen van het netvlies lichtstimulatiebron zoals weergegeven in figuur 3. De ERG golfvorm vroeg negatieve piek voortvloeien uit fototransductie (ten minste ongeveer 10 msec na licht flits) aangeduid als de a-golf en een grote positieve piek van de binnenste retina (maximaal ongeveer 80 msec na lichtflits) aangeduid als de b-golf. De donker aangepaste ERG uit een normale dim verhoogde rat liet een grote afdrukband en innerlijke netvlies reactie op een heldere 2,0 log cd.sm -2 flash (figuur 3A). Een week na lichte blessure de ERG opnames had een ernstige vermindering van de amplitude ten opzichte van de controles, als gevolg van het verlies van fotoreceptoren; zie figuur 3B. Voorconditionering de achterste ledematen met ischemie met behulp van een reperfusie protocol van 2 x 5 min onmiddellijk vóór ischemie beschermde de fotoreceptoren van licht letsel. De RIP ERG amplitudes groter dan lichte schade alleen waren, met een lichte verlaging van het a-wave (Afbeelding 3C). Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) test op ingevroren secties van het netvlies bevestigde een reductie van apoptotische cellen in licht beschadigde dieren die RIP reltieve om sham-behandelde lichte verwondingen dieren (figuur 4).
De inductie van ischemie aan het achterste ledematen afhankelijk van de correcte plaatsing van de manchet, zoals gezien in figuur 1. Manchet onder de "knie" geplaatst ofwel geen fotoreceptoren bescherming tegen licht schade zoals blijkt uit de lagere amplitudes ERG, zie figuur 3D.
Tot slot, wanneer het wordt toegediend correct achterpoot ischemie in staat was om het netvlies neuronen bescherming tegen licht letsel.
Figuur 1:. Manchet plaatsing en het effect van de manchet druk boven 160 mmHg (A) Toont de achterste ledematen en voeten voordat manchetdruk hoogte. (B) Geeft de voet tijdens de hoogte van manchetdruk boven 160 mmHg. Let op de positie van de manchet boven "k nee ". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Foot temperatuur tijdens manchetinflatie verlaagde opblazen van de manchet op de achterpoot gedurende 2 x 5 minuten bij 160 mm Hg verlaagd huidtemperatuur tijdens ischemie. (A) Toont de groep gemiddelde van 2 x 5 min RIP voet temperatuurveranderingen. (B) toont een representatief voet (° C) tracering voor 2 x 5 min ischemie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
00 "/>
Figuur 3:. RIP behoudt retinale functie, zoals aangetoond in de ERG in vergelijking met lichte schade ratten Blootstelling aan fel licht gedurende 24 uur beschadigt de fotoreceptoren van het netvlies. Het ERG meet de gezondheid van de binnenste en buitenste retina als een elektrische respons (microvolts [mV]) aan het licht stimulatie. De normale retinale respons op 2,0 log cd.sm -2 lichtstimulatiebron gezien in (A). Fotoreceptor schade door fel licht resulteert in een kleinere ERG amplitude (B). RIP was in staat om de fotoreceptoren volgende licht letsel (C) te redden. Onjuiste manchet plaatsing tijdens TNO niet fotoreceptoren te beschermen tegen verwondingen (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 4: TUNEL + cellen. Een staafdiagram vergelijken groepsresultaat voor lichte verwondingen, letsel + RIP tonen de vermindering van apoptose met RIP. TUNEL + cellen werden geteld in de hele overspanning van het netvlies (8000 pm). Top panel: groep gemiddeld TUNEL + cellen waren lager voor RIP behandelde ratten (210 ± 4,9, n = 5) in vergelijking met licht letsel alleen (255 ± 10, n = 5), p <0,01, one-way ANOVA. Onbeschadigd netvliezen (geen licht letsel) had zeer laag (3,0 ± 1,4, n = 5), apoptotische cellen. (A) representatief beeld van superieure licht gewond netvlies. (B) representatief beeld van superieure RIP-licht gewond netvlies. (C) representatief beeld van inferieure licht gewond netvlies. (D) representatief beeld van inferieure RIP-licht gewond netvlies. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Knaagdier achterpoot ischemie werd geïnduceerd met succes een manuele bloeddrukmeter en manchet levert neuroprotectie de fotoreceptoren van de retina. Een bevinding consistent met ischemische conditioning geïnduceerde bescherming van de fotoreceptoren van licht letsel 9,28.
In wezen, remote ischemie veroorzaakt korte zuurstoftekort aan weefsels. Derhalve remote ischemische voorconditionering veel overeenkomsten ischemische conditioneren of als alternatief genoemd ischemische tolerantie, hypoxische voorconditionering en gedeeltelijk, anaërobe oefening. Cellen reageren op ischemische uitdaging door het vrijgeven van een grote verscheidenheid aan eiwitten, nucleoside en transcriptiefactoren die ofwel bieden neuroprotectie rechtstreeks beïnvloeden of cellen tolerant voor de volgende metabole stress 13 geworden.
In de literatuur zijn verre ischemie protocols verschillende duur en frequenties inbegrepen. Ons laboratorium heeft getest 5, 10,en 2 x 5 min ischemie protocollen op de normale retina functie 26. Van deze protocollen 2 x 5 min bracht het grootste ERG amplitudeveranderinrichting in normale ratten en is gekozen om te testen in een model van licht letsel. Kort en herhaalde 5 min ischemische gebeurtenissen bleken ook preventief recurring slagen bij de mens en de infarctgrootte te verminderen experimentele beroerte bij varkens 17,22. Echter, de meest geschikte periode van ischemische preconditionering waarschijnlijk afhankelijk van het diermodel vroeger. Bijvoorbeeld, is een vermindering van infarctgrootte tegen focale ischemie waargenomen bij meer 2 x 15 min en 3 x 15 min protocollen, maar niet in 3 x 5 min protocollen bij ratten 15.
De tijd tussen IP en ischemische letsel moet ook worden overwogen voor een effectieve neuroprotectie. Twee tijdvensters zijn geclassificeerd voor cardioprotectie veroorzaakt door IP. Dit zijn het venster "klassieke conditionering", die 0-12 uur optreedt na IP ende "tweede window", die 3-4 dagen optreedt na IP 29. In een centraal beroerte model, werd RIP gevonden beschermend op verschillende tijdstippen, ook buiten de klassieke en tweede windows 15 te zijn. Echter, zijn er weinig studies die de termijnen van neuroprotectie in RIP en IP hebben vergeleken geweest.
Een andere overweging voor remote bescherming ischemie is de timing van de conditionering, inclusief of dit wordt toegepast voordat letsel (preconditionering) of na een blessure (postconditioning). De meerderheid van de afstandsbediening ischemie testen is preconditionering gebruikt ondanks postconditioneren studies die onlangs zijn gevonden beschermend van zowel retinale en cerebrale neuronen 30,31 te zijn.
Samengevat, de inductie van neuroprotectie in achterste ledematen ischemische conditioning beschrijft het ziektemodel, diersoorten, de duur van de ischemie en de timing van ischemie. Een beoordeling door Kaniora et al. provides verdere details over de verscheidenheid van remote ischemie protocollen, met inbegrip van de soort, RIP protocollen, RIP sites, letsel modellen, letsel resultaten en voorgestelde beschermingsmechanismen 32.
De minimaal invasieve manchet op de achterpoot maakt RIP in zowel wakker en dieren overeenkomstig de lichaamstemperatuur wordt gehandhaafd. In verdoofde experimenten, moet de lichaamstemperatuur van het dier worden gehandhaafd om onderkoeling te voorkomen. Intern toezicht temperatuur zal het dier ondergaat onderkoeling of hyperthermie te voorkomen. Onderkoeling en hyperthermie zijn bekende pre-conditioning stimuli zowel in takt modellen en lichte verwondingen 33-36. De JoVE gepresenteerde methode kan worden uitgevoerd in wakkere dieren waardoor lichaamstemperatuur verwart voorkomen.
Anesthetica kan een andere set verwart in RIP experimenten te introduceren. Isofluraan kan deelnemen aan bescherming myocardium via opening van ATP gevoelige kaliumkanalen channels, een dergelijke beschermende mechanisme gerapporteerd ischemische conditioneren 37. Hoewel de omvang van het infarct in takt modellen groot blijft in schijn-behandelde dieren die isofluraan, kan de onderliggende moleculaire mechanisme afstand ischemie conditionering worden gemaskeerd door het effect van anesthetica. Ketamine, een NMDA antagonist, heeft een veelheid van beschermende effecten in vivo 38, inclusief de mogelijkheid om excitotoxiciteit te voorkomen neuronen, activeert de mTOR-route en laat BDNF in het serum 39-41. Ketamine is vermeld dat neuronale overleving na hersentrauma verbeteren bij mensen en vermindering lichte schade knaagdieren fotoreceptoren 42,43. Onderzoek naar het mechanisme van remote ischemische conditionering met wakker bloeddruk cuffing zal voorkomen verdoving verwart.
Effectieve achterpoot ischemie is gebaseerd op de correcte plaatsing van de manchet, de consistentie van de manchet druk en manchetdruk hoogte boven Systolic bloeddruk zoals gezien in figuur 1. Manchet onder de "knie" geplaatst ofwel geen fotoreceptoren bescherming tegen licht schade zoals blijkt uit de verminderde electroretinogram (ERG) amplitudes. Het verschil bij conditionering gebaseerd op de positie van de manchet is waarschijnlijk te wijten aan verschillen in spiermassa en de nabijheid van de femorale slagader. Voorts moeten de dieren worden gestandaardiseerd voor leeftijd, gewicht, lichaamstemperatuur en geslacht.
Samenvattend kan op afstand ischemie geïnduceerd door een niet-invasieve bloeddrukmanchet, welke spierletsel vermeden en heeft de flexibiliteit wakker of verdoofd experimenten. Remote ischemische preconditionering is een opkomende neuroprotectieve strategie en dit protocol zal verdere studies staat in zijn mechanismen en toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer | Welch Allyn | DS56 | Manual Sphygmomanometer |
| Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack | Welch Allyn | 5082-102-1 | Limb blood pressure cuff |
| Luer lock adaptor | Welch Allyn | 5082-178 | Adaptor for neonatal cuff |
| Thermistor pod | AD Instruments | ML 309 | skin tempertature unit |
| Skin temperture probe | AD Instruments | MLT 422/A | |
| Powerlab, 4 channel acquistion hardware | AD Instruments | PL 35044 | |
| Homeothermic blanket system with flexible probe | Harvard Appartus | 507222F | |
| Towel | optional: awake remote ischemia | ||
| Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) | Abbot Animal Health | 05260-05 | optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia |
| Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia | |
| Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia |
References
- Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4 (1), 40-50 (2013).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (5), 851-859 (2012).
- Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35 (6), 1264-1273 (2002).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29 (9), 1937-1950 (1998).
- Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (5), 777-785 (1998).
- Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35 (3), 616-621 (2004).
- Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30 (9), 1851-1854 (1999).
- Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (3), 1348-1354 (2003).
- Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890 (1), 118-129 (2001).
- Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70 (2), 212-221 (2006).
- Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4666-4670 (1995).
- Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26 (5), 248-254 (2003).
- Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33 (5), 514-519 (2011).
- Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151 (4), 1099-1103 (2008).
- Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
- Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123 (7), 714-721 (2011).
- Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109 (7), 2398-2404 (2002).
- Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106 (23), 2881-2883 (2002).
- Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5 (2), 211-230 (1965).
- Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94 (10), L78-L80 (2008).
- Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79 (18), 1853-1861 (2012).
- Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42 (10), 921-929 (2009).
- Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A (6), 865-868 (1986).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200 (1), 69-79 (2002).
- Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55 (4), (2014).
- Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (9), 1667-1677 (1997).
- Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8 (7), 718-724 (2002).
- Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 251-254 (2011).
- Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42 (2), 439-444 (2011).
- Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50 (1), 63-74 (2006).
- Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84 (4), 445-458 (2007).
- Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29 (10), 2171-2180 (1998).
- Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347 (8999), 422-425 (1996).
- Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241 (4874), 1817-1820 (1988).
- Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24 (7), 730-735 (2002).
- Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (1), H61-H68 (2002).
- Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
- Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18 (4), 479-483 (1993).
- Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11 (10), 666 (2010).
- Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (1), 140-144 (2008).
- Wassle, H.
- Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).
