Abstract
Red / terapia near-infrared luz (R / NIR-LT), entregue por laser ou diodo emissor de luz (LED), melhora os resultados funcionais e morfológicas em uma série de lesões do sistema nervoso central em vivo, possivelmente reduzindo o estresse oxidativo. No entanto, os efeitos do R / NIR-LT sobre o stress oxidativo têm sido mostrados para variar, dependendo do comprimento de onda, ou a intensidade da irradiação. Estudos comparando parâmetros de tratamento são escassos, devido à ausência de dispositivos disponíveis no mercado que oferecem vários comprimentos de onda ou intensidade, adequado para alta through-colocar em estudos de otimização in vitro. Este protocolo descreve uma técnica para a distribuição de luz num intervalo de comprimentos de onda e intensidades para optimizar as doses terapêuticas requeridas para um dado modelo de lesão. Colocámos a hipótese de que um método de entrega de luz, na qual os parâmetros de comprimento de onda e intensidade pode ser facilmente alterada, pode facilitar a determinação de uma dose óptima de R / NIR-LT para reduzir as espécies reactivas de oxigénio(ROS) in vitro.
Luz de xénon não coerente foi filtrada através de filtros de interferência de banda estreita para proporcionar diferentes comprimentos de onda (comprimentos de onda centro de 440, 550, 670 e 810 nm) e as densidades de energia (8,5 x 10 -3 a 3,8 x 10 -1 J / cm 2) de luz para células de cultura. A emissão de luz a partir do aparelho foi calibrado para emitir, as doses terapeuticamente relevantes quantais iguais de luz em cada comprimento de onda. Espécies reactivas foram detectados em glutamato salientou células tratadas com a luz, utilizando DCFH-DA e H 2 O 2 corantes fluorescentes sensíveis.
Nós entregue com sucesso luz na faixa de fisiologicamente e comprimentos de onda e intensidades terapeuticamente relevantes, para células de cultura expostas a glutamato como um modelo de lesão do SNC. Embora as densidades de energia de R / NIR-LT utilizados no presente estudo, não exerceu um efeito sobre ROS gerada pelas células cultivadas, o método de entrega de luz é aplicável a outros sistems incluindo mitocôndrias ou mais modelos de cultura fisiologicamente relevantes fatia organotípicas isolado, e poderia ser utilizado para avaliar os efeitos sobre uma gama de medidas de resultado do metabolismo oxidativo.
Introduction
Espécies reactivas de oxigénio (ROS) são necessárias para uma variedade de vias de transdução de sinal, e por reacções normais do metabolismo celular, incluindo aqueles de uma neuroprotecção. No entanto, quando o mecanismo antioxidante endógeno são incapazes de controlar a produção de ROS, as células podem sucumbir ao estresse oxidativo 2,3. Após lesão do SNC, os aumentos associados na presença de ROS e stress oxidativo estão pensados para desempenhar um papel importante na progressão da lesão 4,5. Apesar da extensa série de estratégias para atenuar o estresse oxidativo que foram avaliados, não existem actualmente, estratégias anti-oxidantes clinicamente relevantes totalmente eficazes para atenuar a produção de ROS e estresse oxidativo associado no uso clínico seguinte neurotrauma 6. Por conseguinte, a atenuação de estresse oxidativo continua a ser um objectivo importante para a intervenção terapêutica 7.
Melhorias seguiring R / NIR-LT têm sido relatados em uma ampla gama de lesões e doenças, incluindo reduções no tamanho do infarto do miocárdio, complicações renais e hepáticas durante diabetes, degeneração da retina, lesões do SNC e acidente vascular cerebral 8, talvez por reduzir o estresse oxidativo. Com especial atenção às lesões do SNC, os estudos pré-clínicos de eficácia de luz 670nm têm mostrado bons efeitos em modelos de degeneração da retina 9-11, lesão medular 12, a morte neuronal 13. Os ensaios clínicos foram conduzidos para a idade degeneração macular relacionada à seca e estão em andamento para o curso de 14, no entanto, os resultados destas experiências não parecem promissores, talvez devido a uma falha de empregar um tratamento eficaz parâmetros 15. Como tal, R / NIR-LT não tem sido amplamente adotado como parte da prática clínica normal em neurotrauma, apesar de ser um fácil de administrar, não-invasivo e tratamento relativamente barato. Barreiras à tradução clínica incluem a falta de uma clprimitiva entendeu mecanismo de ação e ausência de uma efetiva 16,17 protocolo de tratamento padronizado. A literatura atual sobre a terapia da luz revela uma infinidade de variações nos parâmetros de tratamento no que diz respeito às fontes de irradiação (LED ou laser), comprimento de onda (por exemplo, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), a dose total (joules de irradiação / unidade de área), duração (tempo de exposição), timing (pré ou pós-insulto), frequência de tratamento e tipo de parto (pulso ou contínuo) 8. A variabilidade dos parâmetros de tratamento entre os estudos torna a comparação difícil e tem contribuído para o ceticismo quanto à eficácia 16.
Portanto, a optimização de R / NIR-LT é claramente necessária, com sistemas de cultura de células com capacidade para fornecer o mecanismo de rastreio de alto débito necessário para comparar as múltiplas variáveis. No entanto, existem alguns sistemas de iluminação disponíveis no mercado que podem fornecer flexibilidade e controle suficiente sobre wavelength e intensidade para realizar tais experimentos de otimização. Comercialmente disponíveis dispositivos LED, geralmente não são capazes de fornecer múltiplos comprimentos de onda ou de intensidade, resultando em vários investigadores que utilizam dispositivos de diferentes fabricantes de LED, a qual pode variar não só na intensidade, mas também o espectro de comprimento de onda da luz emitida. Temos abordado esta questão através do emprego de uma fonte de luz Xenon banda larga filtrada através de filtros de interferência de banda estreita, gerando assim uma gama de comprimentos de onda e fluências de luz, permitindo um controlo apertado, preciso dos parâmetros do R / NIR-LT.
É importante notar que a dose terapêutica do tratamento é definido pelo número de fotões que interagem com o photoacceptor (cromóforo), que, no caso de R / NIR-LT é postulada como sendo o citocromo c oxidase (COX) 18. Energia Photon entregue varia de acordo com o comprimento de onda; significando doses iguais de energia em diferentes comprimentos de onda será comvalorizada de diferentes números de fótons. Por conseguinte, a luz emitida a partir do dispositivo foi calibrado para emitir um igual número de fótons por cada um dos comprimentos de onda escolhidos para ser testado. Nós desenvolvemos um sistema que pode ser utilizado para entregar R / NIR-LT a uma gama de comprimentos de onda e intensidades para as células in vitro e demonstraram a capacidade para medir os efeitos da entregues R / NIR-LT sobre a produção de ROS nas células sujeitas a estresse glutamato.
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Protocol
1. Optical Calibration: Medindo Light Output
- Para preparar o aparelho de distribuição de luz, ligar uma fonte de luz de banda larga (por exemplo, Xenon ou lâmpada de tungsténio) para uma fonte de alimentação adequada. A posição de uma lente de colimação em frente da fonte de luz para produzir um feixe colimado de luz. Passar a luz através de um filtro de calor líquido para remover a maior parte do calor do feixe de luz. Dependendo da aplicação, focar o feixe colimado sobre a abertura de entrada de um guia de luz líquido, o qual proporciona uma distribuição mais flexível da luz (por exemplo., Numa incubadora).
- Na outra extremidade do guia de luz líquido, posicionar uma segunda lente de colimação e, em seguida, um suporte para a interferência e filtros de densidade neutros. Verifique se esse arranjo produz um local uniformemente iluminado de luz da faixa de onda e intensidade desejada.
Nota: A distância entre a extremidade do guia da luz e o plano da amostra pode necessitar de variar em funçãoa área que deve ser iluminado, mas lembrar que, como a distância entre a extremidade do guia da luz aumenta, a intensidade da luz diminui. No presente estudo, essa distância é de 14 centímetros e produz uma secção transversal da viga que ilumina uniformemente numa área bem 3x3 sobre uma placa de 96 poços. - Certifique-se de que a luz difusa entre a lâmpada e componentes ópticos associados é incapaz de alcançar o espécime.
- Ligue o refrigerador de água para o filtro de calor líquido e garantir que há intercâmbio de água através do revestimento do filtro. Ligue a fonte de energia da lâmpada e aguarde pelo menos 5 min para a fonte de luz de banda larga para se estabilizar. Nota: O uso do sistema de arrefecimento a água é necessária para impedir o excesso de aquecimento do dispositivo.
- Selecione um filtro de interferência de banda estreita (geralmente descrito por seu comprimento de onda centro, transmitância de pico e largura à meia altura FWHM) de largura de banda () para gerar a banda desejada de iluminação. Nota: Os filtros de interferência de banda estreita utilizados no estudo foram 442 nm, 550 nm, 671 nm e 810 nm.
- Medir a luz produzida pela lâmpada no plano em que a amostra está a ser posicionado durante o tratamento. Medir a luz utilizando uma sonda calibrada irradiância (colector de co-seno) ligado a um espectroradiómetro adequado, utilizando um software proprietário de acordo com as instruções do fabricante.
- Use filtros de densidade neutra para ajustar a intensidade de luz até a saída desejado é obtido. Nota: No presente estudo, a intensidade de luz que passou por cada filtro de interferência é ajustada para proporcionar uma saída quantal igual em cada uma das quatro bandas de ondas de tratamento. É importante verificar a calibração regularmente, como a saída da lâmpada está sujeita a alterações.
Nota: Seguindo-se o conjunto do aparelho, as células estão prontas para ser iluminado a Figura 1 é uma representação do equipamento de difusão de luz utilizado no presente estudo..
Figura 1. Imagem do aparelho de distribuição de luz. Illustrated são a fonte de energia de luz, lâmpada de xenon com habitação, lente de colimação, filtro de água, abertura de entrada, guia de luz líquido, segunda lente collimating, porta-filtro, quadro tratamento e fosco cartão preto. Note-se que os filtros de comprimento de onda e intensidade de banda estreita não são mostrados.
2. Preparação celular
- O R / NIR-LT método de entrega descrito pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou no sistema de modelo in vitro; como tal, as descrições seguintes de cultura de células são em geral, utilizando técnicas bem estabelecidas para a cultura de feocromocitoma (PC12), Müller (RMC1) e células da retina mistas primárias.
- Antes da semeadura de células para tratamento de luz e ensaio de estresse oxidativo, cultura células imortalizadas em seus respectivos meios de crescimento contendo suplementos adequados (eg., FBS, antibióticos) em flas T75ks até 70-80% de confluência.
- Separar as células imortalizadas a partir de frascos T75, usando o método apropriado para o tipo de célula a ser testada, por exemplo., Tripsina. Se necessário, antes de prosseguir com a sementeira de células em 96 poços de placas de ensaio, os poços da placa de ensaio revestimento com 10 ug / ml de poli-L-lisina durante 1 hora (por ex., Para células PC12) ou 10 ug / ml de poli-L-lisina para 1h, seguida por uma incubação de S / N com 10 ug / ml de laminina (por exemplo., para as células da retina mistos).
- Células de centrífuga para recolher o apropriado (por exemplo., 3 min a 405 xg durante células PC12 ou 10 min a 218 xg durante células RMC1), remover o sobrenadante e ressuspender em 8 ml de meio de cultura celular apropriado.
- Se as células da retina são misturados a ser utilizado, a partir de preparar P0-5 filhotes de ratos neonatal por digestão enzimática (papaína), de acordo com os procedimentos estabelecidos 19
- Contar o número de células viáveis excluindo 0,4% (w / v) de corante azul de tripano, utilizando um hemocitómetro.
- Ajustar a densidade celular such células que será de aproximadamente 70-80% confluentes após 24 ou 48 horas em cultura. (Para células PC12 a densidade de sementeira é de 4,0 x 10 5 células viáveis / ml, para as células RMC1, é 2,5 x 10 5 células viáveis / mL e para as células da retina mistos é 8 x 10 5 células viáveis / ml). Após a adição de células ou para placas de 96 poços claras ou negras (usados para a H 2 O 2 ou ensaio de DCFH-DA, respectivamente), em 100 ul de meio de crescimento adequado, permitir que a placa se sentar sobre uma superfície plana a 37 ° C, 5 % de CO 2 (ou o que quer que as condições são apropriadas para o tipo específico de célula) durante pelo menos 24 horas para permitir a aderência das células.
- Células de cultura em meios de crescimento nos apropriados 96 bandejas bem até que eles sejam 70-80% confluentes (24h de PC12 e as células RMC1, 48h para as células da retina em comum).
3. A adição de glutamato Stressor a Células
- Prepare monossódico do ácido L-glutâmico concentrações hidrato de sal estressor de 0-10mm em grow completo adequadomeios de cultura th.
- Remova a mídia a partir das células e lavar cuidadosamente as células 3 vezes com PBS (PC12) ou HBSS (RMC1 e células da retina mistas). Após lavagens, adicionar meio contendo glutamato para um volume total de 100 ul / poço.
4. Primeiro doses de tratamento com luz
- Imediatamente após a adição de glutamato ou o estressor de escolha, expor células para tratamento de luz nos comprimentos de onda e intensidades desejados, colocando sob o aparelho de distribuição de luz preparada. Certifique-se de alterar o resultado da quantal do feixe de luz, utilizando as combinações estabelecidas de filtros de densidade neutra, dependendo do comprimento de onda a ser administrado.
Nota: Nas experiências actuais, expor as células a tratamento com luz durante 3 min a manter a temperatura em repouso as placas de 96 poços em um bloco 37 o C de calor. O tempo de tratamento pode ser variada como requerido.- Coloque um cartão preto fosco debaixo das células para evitar a luz refletindo em poços adjacentes no 96-well tabuleiro designado para outros parâmetros de tratamento.
- Se se deseja o tratamento por longos períodos de tempo, adicionar tampão de Hepes 25 mM para manter o pH do meio de cultura celular ou, de preferência, colocar as placas e aparelhos de tratamento dentro de uma incubadora com CO 2 a concentração regulado para 5% de CO 2, ou as condições que são óptimas para o tipo de célula específico.
- Após a conclusão do tratamento de luz, colocar as células numa superfície nivelada e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 (ou qualquer outra coisa condições são óptimas para o tipo de célula), durante 24 h.
Nota: dosagens adicionais de R / NIR-LT pode ser administrado como descrito acima, se o desejar.
5. final Dosagem de tratamento de luz e Detecção de ROS
- Antes de realizar a etapa final do tratamento de luz, preparar os reagentes a serem utilizados para a detecção de ROS. Preparar tampão de citrato 50 mM (pH 6,0), Triton X-100, e H 2 O 2 reagente de detecção funcionandosolução de (1: 2: 97 proporção de 10 mM de solução stock de reagente de H 2 O 2 de detecção; 10 U / ml de peroxidase de rábano; citrato de sódio 50 mM (pH 6,0)). Prepare a DCFH-DA com uma concentração final de 100 uM em meio adequado.
Nota: reagente DCFH-DA por células PC12 está em meio RPMI, reagente DCFH-DA para células RMC1 está em meio DMEM. Note-se que os reagentes de detecção disponíveis comercialmente têm sensibilidades diferenciadas para ROS específico e reagentes devem ser escolhidos com cuidado para fornecer a informação desejada para uma aplicação individual. - Administrar o tratamento de luz para as células, como descrito no passo 4.1-4.1.2. Assegurar que as células estão sendo tratados com as fluências desejados / comprimentos de onda da luz.
- Imediatamente após o tratamento de luz, remova a mídia contendo glutamato e lavar duas vezes com solução tampão apropriado (para células PC12, PBS é usado e para células RMC1, HBSS é usado). Realizar os ensaios de ROS nas células, como se segue:
- H 2 O 2 2 durante 15 minutos. Adicionar 50 ul de H 2 O 2 a solução de trabalho de detecção e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Medir a fluorescência utilizando um leitor de placas com um comprimento de onda de excitação de 530 nm e um comprimento de onda de emissão de 480 nm.
- DCF ensaio: adicionar 100 uL da solução de DCFH-DA de cada um dos poços de 100 uM e incubar durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Remover o meio contendo 100 uM DCFH-DA e lava-se com solução tampão adequado (como descrito acima) duas vezes. Adicionar 90 ul de solução tampão e 10 ul de Triton X-100 a cada um dos poços e agitar suavemente num agitador orbital durante 30 segundos antes dos 15 minutos de incubação a 37 ° C. Meça DCF fluorescência derivada usando um leitor de placas com um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um Wavel emissãoength de 530nm.
- Expresso ROS valores relativos à concentração de proteína de células remanescentes nos poços, utilizando um kit colorimétrico para quantificar a concentração de proteína de acordo com as instruções do fabricante, com referência a uma curva padrão para calcular mg de proteína.
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Representative Results
A saída de luz emitido num comprimento de onda de 670 nm foi calibrado usando filtros de densidade neutra, de modo a irradiar células com uma gama de densidades de energia que engloba uma dose de luz de 670 nm previamente demonstrado ser benéfico in vivo (0,3 J / cm 2) 20. Como o número de filtros de densidade neutra em frente da fonte de luz aumentou, a intensidade (W / m 2) diminuída, permitindo que menos que a luz passe para a área alvo. A Tabela 1 apresenta os dados de calibração de luz 670nm gerados a partir da fonte de luz equipado com um filtro de comprimento de onda e inclui o número de filtros ND usados e a intensidade da luz gerada como um resultado, a distâncias descritos a partir da saída de luz. Fluência, ou dose de luz de 670nm (J / cm 2), foi calculada a partir da equação: [Dose (J / cm 2) = (A intensidade da luz (W / m 2) / 10.000) x tempo (s)], onde o tempo de tratamento foi de 180 s.
| Número de filtros ND | Distância de saída de luz (cm) | Intensidade (W / m ^ 2) | Dose (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0,38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0,19 |
| 1 | 14 | 4,91 | 0,075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0,041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0,018 |
| 4 | 14 | 0,47 | 0,0085 |
| 5 | 14 | 0,21 | 0,0038 |
| 6 | 14 | 0,094 | 0,00169 |
| 7 | 14 | 0,045 | 0,00081 |
| 8 | 14 | 0,021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0,013 | 0.000234 |
Tabela 1: A saída do aparelho de distribuição de luz equipado com o filtro de comprimento de onda de 670nm .número de filtros ND refere-se ao número de filtros de densidade neutros montados para a frente da saída da fonte de luz. Intensidade (W / m 2) refere-se à intensidade de luz, como relatado por thsoftware e decoro. Fluência, ou dose foi calculada pela equação [Dose (J / cm 2) = (A intensidade da luz (W / m 2) / 10.000) x tempo (s)], onde o tempo de exposição foi de 180 s e a distância a partir da saída de luz foi de 10,5 ou 14 cm.
Dois fluences quantais clinicamente relevantes de luz foram escolhidos para investigar efeitos diferenciais de R comprimento de onda / NIR-LT sobre a produção de ROS. Uma dose que pode atingir vias do SNC seguintes transmissão através do tecido de sobreposição usando dispositivos de LED (ou seja, 1,78 W / m2 a 670nm) 20 equiparado a 0,03 J / cm 2, por um tratamento de 3 minutos, ou 4,9 x 10 14 fotões / cm2 / s. A fonte de luz equipado com filtros para resultar na emissão de 442, 550, 670 ou 830 nm foi então calibrado usando combinações de filtros de densidade neutra para emitir saídas quantais iguais (fotões) para cada comprimento de onda, em oposição às saídas de energia (J / cm 2), e as dosagens (J / cm 2) e intensities em W / m 2 calculados (Tabela 2A). Uma dose adicional maior que estava dentro das orientações recomendadas para estimular a actividade celular 21 também foi usado (1,29 x 10 15 fotões / cm2 / s), e de calibração realizado para cada comprimento de onda (Tabela 2b).
| Comprimento de onda (λ) | Dose (J / cm ^ 2) | Intensidade (W / m ^ 2) | Emissão (fótons / cm ^ 2 / s) |
| 442 | 0,057 | 3.21 | 4,8 x 10 ^ 14 |
| 550 | 0,051 | 2,87 | 5.0 x 10 ^ 14 |
| 670 | 0,032 | 1,78 | 4,9 x 10 ^ 14 |
| 830 | 0,018 | 1.01 | 4.9 x10 ^ 14 |
Tabela 2:. Calibração da intensidade de dosagem distribuída por igual número de fotões de luz em comprimentos de onda que variam de intensidade (W / m 2), de dosagem para um tratamento de 3 minutos (J / cm2) e de emissão de fotões (/ cm 2 / s) quando a saída de luz de xénon emissores 442, 550, 670 e 830 nm são calibrados para emitir um) 4,9 x 10 14 fotões / cm 2 / s ou B) 1,3 x 10 15 fotões / cm 2 / s a uma distância de 14 cm a partir da saída de luz.
A fim de avaliar se a luz emitido pelo aparelho era tóxico para as células, nas dosagens utilizadas, avaliou-se o teor de proteína remanescente em poços de cultura de células PC12 seguintes ensaios de ROS, utilizando um ensaio colorimétrico de proteína. Não houve perda significativa da proteína em qualquer das doses mais elevadas de saída da luz (P> 0,05), indicando que a dose de luz administrada não foi causando a morte celular (Figure 2) e é adequada a utilização de avaliações do metabolismo oxidativo.
Figura 2: Efeito de diferentes doses de luz sobre a concentração total de proteína remanescente em poços de cultura seguintes R / NIR-LT e ensaio de ROS. Barras de histograma são a média ± SEM concentrações de proteína em poços de cultura de células PC12, 6 repetições / concentração, as experiências foram repetidas três vezes. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre o controlo e qualquer dos grupos de tratamento, tal como determinado por análise de variância (ANOVA), p> 0,05.
Inicialmente, avaliou os efeitos de luz 670nm, entregues em fluências que vão ,0085-0,38 J / cm 2, como um exemplo de comprimento de onda para avaliar a adequação do equipamento de difusão de luz. Sem eff significativaect luz de 670 nm foi observada em qualquer das densidades de energia testadas quando se avalia qualquer um de H 2 O 2 ou DCF fluorescência em células PC12, as células da retina RMC1 ou mistos forçado com glutamato (Figura 3, P> 0,05). Da mesma forma, não houve efeitos significativos de diferentes comprimentos de onda da R / NIR-LT entregue em 4,9 x 10 14 fótons / cm 2 / s ou 1,3 x 10 15 fótons / cm 2 / s sobre a produção de ROS, ao avaliar H 2 O 2 ou DCF fluorescência (P> 0,05, dados não apresentados). A nossa capacidade para detectar alterações em espécies reactivas é confirmada por um aumento na fluorescência do corante reactivo DCFH-DA em 13,44 ± 0,67 mM de glutamato para 22,10 ± 2,10 a 10 mM de glutamato. Embora nossos dados não revelam efeitos positivos do R / NIR-LT entregues usando nosso aparelho de distribuição de luz na produção de ROS no sistema modelo selecionado, nem se os efeitos negativos que as células não foram comprometidos, indicado pelo teor de proteína sustentada na culturapoços seguintes terapia de luz (Figura 2). Como tal, o método descrito proporciona um protocolo para o tratamento de células ou mitocôndrias com uma dosagem específica de fotões numa gama de comprimentos de onda e pode ser utilizado para avaliar dosagens mais elevadas e medidas de resultado alternativos, que podem permitir optimização de parâmetros R / NIR-LT.
Figura 3: Quantificação de H 2 O 2 (AC) e DCF (DF) de fluorescência em células PC12 (A, D), RMC1 (B, E) ou células de retina misto culturas na presença de 10 mM de glutamato estressor (C, F), após a terapia de irradiação de 670nm em doses variando de fluência 0-0,38 J / cm 2. Barras de histograma representam a proteína unidades arbitrárias de fluorescência médios / ug ± SEM. Não houve significância estatísticaas diferenças entre o controlo e qualquer dos grupos de tratamento, tal como determinado por ANOVA, p> 0,05, 6 réplicas por grupo, as experiências foram repetidas três vezes.
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Discussion
Temos adaptadas com êxito um sistema de entrega de luz preciso e calibrado para proporcionar um mecanismo para o estudo de optimização de R / NIR-LT in vitro. Parâmetros de comprimento de onda e intensidade da R / NIR-LT são capazes de ser manipulado com precisão e de forma eficaz usando este sistema. Determinou-se que o tratamento de luz das células não levar à morte da célula, apesar de ROS não foram reduzidos nos comprimentos de onda e as doses entregues, nos tipos de células testadas. As intensidades máximas alcançadas pelo sistema atual em 670nm (20.11W / m 2) está em excesso de medidas previamente publicados de penetrância de irradiação para o cérebro de ratos, onde 1,17 W / m 2 alcançou a superfície ventral do nervo óptico e 0.3W / m 2 de atingir a superfície ventral do cérebro caso. Quando entregue durante 30 min, a dose recebida pelas células do nervo óptico in vivo é, por conseguinte, 0,054-0,31 J / cm 2. As doses de luz 670nm entregue no estudo atual (até 0.38J / cm 2), por conseguinte, abranger aqueles recebidos por células nos nossos estudos prévios in vivo.
A teoria mais amplamente aceita de R / NIR-LT eficácia é a de um sistema baseado photoacceptor 18, portanto, é imperativo assegurar que as células tratadas com comprimentos de onda diferentes receber fluences quantais iguais de luz (fótons / cm 2 / s) 8. Além disso, o tempo de exposição utilizado para entregar uma fluência de luz em particular deve ser mantida consistente entre os tratamentos, com apenas a intensidade da mudança de luz para aumentar ou diminuir ao longo do tempo total de fluência. Estudos anteriores demonstraram que a mudança do tempo de exposição para entregar fluências resultados iguais em diferenças de medidas de resultados e pode atuar como um fator de confusão, e dificultar a identificação dos parâmetros de comprimento de onda / fluência ideais necessárias para um modelo de lesão especial 22,23. Como tal, recomenda-se a calibração cuidadosa da doseem cada comprimento de onda testados, para garantir a otimização útil do R / NIR-LT.
A técnica descrita permite a entrega de luz para uma gama de sistemas in vitro modelo incluindo culturas fatia organotypic, que podem resultar em resultados mais significativos devido à preservação da arquitetura celular e interações inter-celulares complexos. Variações sobre o modelo de lesão pode exigir diferenças nos parâmetros de tratamento de R / NIR-LT. Esta técnica é limitada pela potência de saída máxima alcançável com a instrumentação descrita. Potências mais elevadas podem ser necessárias para alguns in vitro e mais em aplicações in vivo. Se forem necessárias saídas superiores de luz, o aparelho pode ser alterado para aumentar a intensidade de luz que atinge as amostras. Encurtando a distância entre as células alvo e de terminação de luz vai aumentar a intensidade de luz que atinge a placa. Como alternativa, a luz pode ser refletida por um espelho e sobre as células como OPPOsed de ser filtrado através de um guia de luz líquido, no entanto alternativa comprimento de onda e filtros de densidade neutra será necessário para alcançar este objectivo. Saídas superior usando um mais potente fonte de luz também seria necessária se o método foram de ser adaptado para a entrega do R / NIR-LT in vivo em modelos de lesão CNS, devido ao aumento das dosagens necessárias para garantir a penetração eficaz de irradiação 8,20 .
Em conclusão, o estudo descreve um novo método de entrega de luz que fornece um meio de efetivamente alterar parâmetros de intensidade e comprimento de onda de luz em estudos R / NIR-LT. Esta metodologia será útil na optimização de R / NIR-LT empregando uma gama de medidas de resultados e em modelos de lesão in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
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