Abstract
Красный / около инфракрасный свет терапия (R / NIR-LT), с которым выступил лазерном или светоизлучающий диод (LED), улучшает функциональные и морфологические результаты в диапазоне центральная система повреждений нервной в естественных условиях, возможно, за счет снижения окислительного стресса. Тем не менее, влияние R / NIR-LT на окислительный стресс, как было показано варьироваться в зависимости от длины волны и интенсивности облучения. Исследования, сравнивающие параметры лечения не хватает, из-за отсутствия коммерчески доступных устройств, которые обеспечивают несколько длин волн или интенсивности, подходящие для высокой пропускной положить в пробирке исследования оптимизации. Этот протокол описан способ доставки света в диапазоне длин волн и интенсивности для оптимизации терапевтических доз, необходимых для данной модели травмы. Мы предположили, что метод доставки света, в которых могут быть легко изменены длины волны и интенсивности параметры, может облегчить определение оптимального дозы R / NIR-LT для снижения реактивных форм кислорода(ROS) в пробирке.
Некогерентное ксеноновые фары фильтруют через узкополосных интерференционных фильтров, чтобы доставить различные длины волн (в центре длины волн 440, 550, 670 и 810nm) и флюенсы (8,5 × 10 -3 до 3,8 × 10 -1 Дж / см 2) света в культивируемых клетках. Светоотдача из устройства калибруют, чтобы излучать соответствующие терапевтически, равные квантовых дозы света на каждой длине волны. Активные формы были обнаружены в глутамат подчеркнул клетки, обработанные с учетом, используя DCFH-DA и H 2 O 2 чувствительных флуоресцентных красителей.
Мы успешно доставлено свет в диапазоне физиологически и терапевтически соответствующих длин волн и интенсивностей, в культивируемых клетках, подвергшихся воздействию глутамата в качестве модели повреждения ЦНС. В то время как флюенсами R / NIR-LT, используемых в данном исследовании не оказывают влияния на ROS, генерируемого культивируемых клеток, способ доставки света применимо к другим систEMS включая изолированные митохондрии или более физиологически соответствующие органотипической модели ломтик культура, и может быть использован для оценки воздействия на целый ряд критериев исхода окислительного метаболизма.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) требуется для ряда сигнальных путей трансдукции и нормальных реакций клеточного метаболизма, в том числе нейропротекции 1. Однако, когда эндогенный антиоксидант механизм не в состоянии контролировать производство АФК, клетки могут поддаваться окислительным стрессом 2,3. После травмы ЦНС, что приводит к повышению в присутствии АФК и окислительного стресса, как полагают, играют существенную роль в прогрессировании повреждения 4,5. Несмотря на широкое ряда стратегий для ослабления окислительного стресса, которые были оценены, не существует в настоящее время нет полностью эффективных, клинически значимые стратегии антиоксидантные для ослабления АФК и связанного с окислительного стресса в клинической практике следующие нейротравме 6. Поэтому ослабление окислительного стресса остается важной целью для терапевтического вмешательства 7.
Улучшения следоватьчисле R / NIR-LT были зарегистрированы в широком диапазоне повреждений и заболеваний, включая сокращение размера инфаркта сердечной, почечной и печеночной осложнений во время диабета, дегенерации сетчатки, травмы ЦНС и инсульта 8, возможно, снижая окислительный стресс. Что касается непосредственно повреждения ЦНС, доклинические исследования эффективности 670 нм света показали хорошие эффекты в моделях дегенерации сетчатки 9-11, повреждение спинного мозга 12, гибели нейронов 13. Клинические испытания были проведены для сухой возрастной макулярной дегенерации и в настоящее время инсульта 14, однако результаты этих исследований не выглядят многообещающими, возможно, из-за сбоя использовать эффективное лечение параметров 15. Таким образом, R / NIR-LT не были широко приняты как часть обычной клинической практике в нейротравме, несмотря на то, легка в управлении, неинвазивный и относительно недорогое лечение. Барьеры на пути к клинической перевода включают в себя отсутствие в клраннего понимать механизм действия и отсутствие стандартизованной эффективного 16,17 протокол лечения. Текущий литература о световой терапии показывает множество вариаций в параметрах лечения по отношению к источникам облучения (LED или лазером), длины волны (например, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), общая доза (Дж облучения / на единицу площади), продолжительность (время экспозиции), сроки (до или после оскорблять), частота лечения и способ родоразрешения (импульсный или непрерывный) 8. Изменчивость параметров обработки между исследованиями делает сравнение трудным и внесла свой вклад в скептицизм в отношении эффективности 16.
Таким образом, оптимизация R / NIR-LT Очевидно, что необходимо, с систем клеточных культур, способных обеспечивать механизм высокопроизводительного скрининга необходимо сравнить несколько переменных. Однако есть несколько коммерчески доступных осветительные системы, которые могут обеспечить достаточную гибкость и контроль над ваvelength и интенсивность выполнять такие эксперименты по оптимизации. Коммерчески доступные устройства СИД, как правило, не способны доставить несколько длин волн или интенсивности, в результате чего исследователей, использующих несколько светодиодных устройств от разных производителей, которые могут меняться не только в интенсивности, но и спектр волны излучаемого света. Мы решили эту проблему путем использования широкополосного ксеноновые источник света фильтруют через узкополосный интерференционных фильтров, тем самым создавая диапазоне длин волн и флюенсах света, что позволяет близко, точный контроль параметров R / NIR-LT.
Важно отметить, что терапевтическая доза лечения определяется число фотонов, взаимодействующих с photoacceptor (хромофора), который, в случае R / NIR-LT является предполагаемым быть цитохром с оксидазы (COX) 18. Энергия фотона доставлен изменяется с длиной волны; это означает, равные дозы энергии на различных длинах волн будет комценится из различного числа фотонов. Таким образом, свет, испускаемый из устройства калибруют, чтобы излучать одинаковое количество фотонов для каждого из выбранных длин волн для тестирования. Мы разработали систему, которая может быть использована для доставки R / NIR-LT в диапазоне длин волн и интенсивностей в клетки в пробирке и продемонстрировал способность измерять воздействие при поставке R / NIR-LT на продукции АФК в клетках, подвергнутых глутамат стресс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оптический Калибровка: Измерение светового выхода
- Чтобы подготовить световой аппаратурой доставки, подключения широкополосного источника света (например, ксенон или вольфрамовая лампа) к соответствующему источнику питания. Установите коллимирующей линзы перед источником света для получения коллимированного пучка света. Пропускают свет через фильтр жидкого тепла, чтобы удалить большую часть тепла от светового луча. В зависимости от применения, сфокусировать коллимированный пучок на входной апертуре жидкой световода, который обеспечивает более гибкое доставки света (например., В инкубаторе).
- На другом конце световода жидкости, положение второй коллимирующей линзы, а затем держатель для интерференции и фильтры нейтральной плотности. Убедитесь, что это устройство производит равномерно освещенного пятна света от желаемого диапазона длин волн и интенсивности.
Примечание: расстояние между концом световода и плоскости образца может потребоваться варьироваться в зависимости отобласть, которая должна быть освещена, но помните, что по мере удаления от конца световода возрастает, интенсивность света уменьшается. В настоящем исследовании, это расстояние 14 см и производит поперечное сечение пучка, который равномерно освещает область также 3x3 на 96-луночный планшет с. - Убедитесь, что рассеянный свет от лампы и связанных с ними оптических компонентов не может достичь образца.
- Включите охладитель воды для фильтра жидкого тепла и обеспечить происходит обмен воды через рубашку фильтра. Включите источник питания лампы и подождите не менее 5 мин для широкополосного источника света для стабилизации. Примечание: использование кулера необходимо для предотвращения перегрева устройства.
- Выберите фильтр узкополосных помех (обычно описывается их длины волны центра, пик пропускания и Полуширина (FWHM) пропускной способности) для создания нужной полосы освещения. Примечание: узкополосного интерференционных фильтров, используемых в данном исследовании были 442 нм, 550 нм, 671 нм и 810 нм.
- Измерьте свет, излучаемый лампой в плоскости, где образец должен быть расположен во время лечения. Измерьте свет с помощью калиброванного освещенности датчик (косинус коллектор) соединен с подходящей спектрорадиометра, используя соответствующее программное обеспечение в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Используйте нейтральные фильтры, чтобы регулировать интенсивность света, пока не будет получен желаемый результат. Примечание: В настоящем исследовании, интенсивность света, прошедшего от каждого фильтра помех регулируется, чтобы дать равные квантовых выход на каждом из четырех диапазонах обработки. Важно проверить калибровку регулярно, как выход лампы могут быть изменены.
Примечание: В соответствии с настроить устройства, клетки готовы для освещения Рисунок 1 является представлением света устройства доставки, используемого в данном исследовании..
Рисунок 1. Изображение световой аппаратурой доставки. Проиллюстрированы свет источник питания, ксеноновая лампа с жильем, коллимирующей линзы, фильтр для воды, входного отверстия, жидкого световода, второй коллимирующей линзы, держателем фильтров, рамы лечения и матовой черной картой. Следует отметить, что узкополосные длин волн и интенсивность фильтрации, не показаны.
2. Сотовый Подготовка
- Описанный R / NIR-LT способ доставки может быть применен к любому типу клеток или в пробирке модельной системы; поскольку такие следующие описания клеточной культуре являются общими, с использованием хорошо зарекомендовавших себя методов культуры феохромоцитома (PC12), Мюллер (RMC1) и первичных смешанных клеток сетчатки.
- До посева клеток для легкой обработки и окислительного стресса анализа, культуры увековечены клетки в их соответствующих питательных сред, содержащих соответствующие добавки (например,., FB, антибиотики) в Т75 FLASKS до 70-80% вырожденная.
- Отделить иммортализованных клеток из колбы Т75, используя метод, соответствующий типу клеток для тестирования напр., Трипсин. При необходимости, прежде чем приступить к высева клеток в 96-луночные планшеты для анализа, покрытие анализа планшетов с 10 мкг / мл поли-L-лизина в течение 1 часа (например., Для клетках PC12) или 10 мкг / мл поли-L-лизина для 1ч сопровождается O / N инкубации с 10 мкг / мл ламинин (например., для смешанных клеток сетчатки).
- Центрифуга клетки, чтобы собрать как необходимо (например., 3 мин при 405 мкг в течение РС12 клеток или 10 мин при 218 мкг в течение RMC1 клеток), удалить супернатант и ресуспендируют в 8 мл соответствующего культивирования клеток.
- Если смешанные клетки сетчатки, которые будут использоваться, готовят из P0-5 новорожденных крысят путем ферментативного пищеварения (папаин) в соответствии с установленными процедурами 19
- Подсчитайте число жизнеспособных клеток, за исключением 0,4% (вес / объем) трипанового синего красителя, с помощью гемоцитометра.
- Отрегулируйте плотность клеток SUCч, что клетки будут примерно 70-80% сливной после 24 или 48 часов в культуре. (Для клеток РС12 плотность посева является 4,0 × 10 5 жизнеспособных клеток / мл, по RMC1 клеток, то есть 2,5 х 10 5 жизнеспособных клеток / мл и для смешанных клеток сетчатки это 8 х 10 5 жизнеспособных клеток / мл). После добавления клетки либо прозрачный или черный 96-луночные планшеты (используемые для H 2 O 2 или DCFH-DA анализа соответственно), в 100 мкл соответствующей среде роста, позволяют пластины, чтобы сидеть на ровной поверхности на 37 ° С, 5 % CO 2 (или любой другой надлежащих условий для конкретного типа клеток), по крайней мере 24 часа, чтобы дать сотовый приверженность.
- Культуры клеток в среде для выращивания в соответствующих 96-лотков, пока они не 70-80% сливной (24h для PC12 и RMC1 клеток, 48h для смешанных клеток сетчатки).
3. Добавление глутамата стрессора клеток
- Подготовка L-глутаминовой кислоты мононатриева концентрации соли гидрат СТРЕССОР на 0-10 мм в соответствующем полной растутго культура СМИ.
- Удалить носитель из клеток и осторожно мыть клетки 3 раза ЗФР (PC12) или HBSS (RMC1 и смешанных клеток сетчатки). После промывки, добавления глутамата-содержащий носитель в общем объеме 100 мкл / лунку.
4. Сначала Дозы Лечение светом
- Сразу же после того глутамата или стресс выбора, подвергать клетки к свету лечения в нужных длин волн и интенсивностей, поместив его под подготовленную аппарата свет доставки. Будьте уверены, чтобы изменить квантовых выход светового пучка с помощью установленных комбинации фильтров нейтральной плотности в зависимости от длины волны вводимого.
Примечание: В нынешних экспериментов, подвергать клетки легкого лечения в течение 3 мин поддержания температуры, отдыхая хорошо пластины 96 на 37 ° С тепла площадку. Время обработки может изменяться в соответствии с требованиями.- Поместите матовую черную карту под клетках, чтобы предотвратить света, отражающегося в соседних скважин в 96-вэйл лоток предназначен для других параметров обработки.
- Если лечение желательно в течение более длительных периодов времени, добавление 25 мМ Hepes буфера для поддержания рН среды для культивирования клеток или, в идеале, разместить устройства и обработки пластин в инкубаторе с CO 2 концентрацией доводитс до 5% CO 2, или условия, которые являются оптимальными для конкретного типа клеток.
- После завершения светолечение, поместите клеток на ровной поверхности и инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 (или любые условия, являются оптимальными для данного типа клеток) в течение 24 часов.
Примечание: Дополнительные дозы R / NIR-LT можно вводить, как описано выше, по желанию.
5. Окончательный Дозировка Лечение светом и обнаружения АФК
- Перед выполнением заключительного тура светолечение, подготовить реагенты, которые будут использоваться для обнаружения ROS. Подготовка 50 мМ цитрат буфер (pH6.0), Тритон X100 и H 2 O 2 реагент обнаружения работырешение (1: 2: 97 Соотношение 10мм H 2 O 2 обнаружения реагента раствора; 10 ед / мл пероксидазы хрена; 50 мМ цитрат натрия (рН 6,0)). Подготовка DCFH-DA в конечной концентрации 100 мкМ в соответствующих средствах массовой информации.
Примечание: DCFH-DA реагент для клеток РС12 в среде RPMI СМИ, DCFH-DA реагент для RMC1 клеток в DMEM средств массовой информации. Следует отметить, что коммерчески доступные реагенты для детекции имеют дифференциальные чувствительности к конкретному АФК и реагенты должны быть выбраны тщательно, чтобы предоставить информацию, требуемую для индивидуального применения. - Администрирование светолечение к клеткам, как описано в стадии 4.1-4.1.2. Убедитесь, что клетки лечат с желаемыми флюенсы / длин волн света.
- Сразу же после светолечение, удалите глутамата средах, содержащих и мыть два раза с соответствующим буферным раствором (для клеток РС12, PBS используется и для RMC1 клеток, HBSS используется). Выполнение анализов ROS на клетках следующим образом:
- H 2 O 2 2 в течение 15 мин. Добавить 50 мкл H 2 O 2 рабочего раствора обнаружения и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Измерьте флуоресценции с использованием планшет-ридер с длиной волны возбуждения 530 нм и длине волны эмиссии 480nm.
- ДДП анализа: добавьте 100 мкл 100 мкМ раствора DCFH-DA в каждую лунку и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С и 5% СО 2. Извлеките носитель, содержащий 100 мкМ DCFH-DA и промывают соответствующим буферным раствором (как описано выше) в два раза. Добавить 90 мкл буферного раствора и 10 мкл Тритона X100, чтобы каждый из скважин и осторожно встряхнуть на орбитальном шейкере в течение 30 секунд до 15 мин инкубации при 37 ° С. Измерьте DCF, полученную флуоресценцию с помощью планшет-ридер с длиной волны возбуждения 480nm и Вавель выбросовength из 530 нм.
- Экспресс РОС значения по отношению к концентрации белка клеток, оставшихся в лунках, с использованием колориметрического набора для количественного определения концентрации белка в соответствии с инструкциями производителя, со ссылкой на стандартной кривой для расчета мг белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выход света доставлен на длине волны 670 нм была откалибрована с помощью фильтры нейтральной плотности, чтобы облучать клетки с диапазоном плотности энергии, охватывающих дозу 670 нм света было показано ранее, полезными в естественных условиях (0,3 Дж / см 2) 20. По мере увеличения числа нейтральных фильтров плотности перед источником света увеличивается, интенсивность (Вт / м 2) уменьшается, следовательно, меньше света проходит в целевую область. В таблице 1 представлены данные калибровки 670 нм свет, генерируемый источником света оснащен фильтром длин волн и включает в себя ряд ND фильтров, используемых и интенсивность света, излучаемого в результате, в описанных расстояниях от светового потока. Плотность энергии, или доза света 670 нм (Дж / см 2), рассчитывали по формуле: [Доза (Дж / см 2) = (Интенсивность света (Вт / м 2) / 10000) х раз (а)], где Время обработки было 180s.
| Количество нейтральных фильтров | Расстояние от светового потока (см) | Интенсивность (Вт / м ^ 2) | Доза (Дж / см ^ 2) |
| 0 | 10,5 | 20.11 | 0,38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0,19 |
| 1 | 14 | 4.91 | 0,075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0,041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0,018 |
| 4 | 14 | 0,47 | 0,0085 |
| 5 | 14 | 0,21 | 0,0038 |
| 6 | 14 | 0,094 | 0,00169 |
| 7 | 14 | 0,045 | 0,00081 |
| 8 | 14 | 0,021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0,013 | 0.000234 |
Таблица 1: Выход светового устройства подачи, установленного на 670 нм с длиной волны фильтра .Number НД фильтров относится к числу нейтральной плотности фильтров, установленных на передней части выхода источника света. Интенсивность (Вт / м 2) относится к интенсивности света, как сообщает гое соответствующее программное обеспечение. Fluence, или доза рассчитывается по формуле [доза (Дж / см 2) = (интенсивность света (Вт / м 2) / 10000) х раз (а)], где время воздействия было 180s и расстояние от светового потока был 10,5 или 14 см.
Два клинически значимых квантовые флюенсы света были выбраны для исследования дифференциальных эффекты R / NIR-LT волны на производство АФК. Доза, которая может достигать ЦНС участки после передачи через вышележащие ткани с использованием светодиодных устройств (т.е., 1,78 Вт / м 2 при 670 нм) 20 приравнивается к 0,03 Дж / см 2 для лечения 3 мин, или 4,9 х 10 14 фотонов / см 2 / с. Источник света оснащен фильтрами, приведет к эмиссии 442, 550, 670 или 830нм затем калибруется с помощью комбинации фильтров нейтральной плотности для излучения равные квантовые выходы (фотонов) для каждой длины волны, в отличие от энергетических выходов (Дж / см 2), и дозы (Дж / см 2) и интеnsities в Вт / м 2 рассчитывается (Таблица 2а). Дополнительная высокие дозы, что было в пределах рекомендуемых руководящих принципов, чтобы стимулировать клеточную активность 21 был также использован (1,29 х 10 15 фотонов / см 2 / с), и калибровки проводится для каждой длины волны (табл 2b).
| Длина волны (λ) | Доза (Дж / см ^ 2) | Интенсивность (Вт / м ^ 2) | Выбросов (фотонов / см ^ 2 / с) |
| 442 | 0,057 | 3.21 | 4,8 х 10 ^ 14 |
| 550 | 0,051 | 2,87 | 5,0 х 10 ^ 14 |
| 670 | 0,032 | 1,78 | 4,9 х 10 ^ 14 |
| 830 | 0,018 | 1.01 | 4,9 х10 ^ 14 |
Таблица 2:. Калибровки интенсивности дозы поставляемого одинаковое количество фотонов света при различных длинах волн интенсивности (Вт / м 2), лекарственные для 3 мин обработки (Дж / см 2) и излучения (фотонов / см 2 / с) когда выход ксенонового света, излучающего 442, 550, 670 и 830нм откалиброваны излучать) 4,9 х 10 14 фотонов / см 2 / с или б) 1,3 х 10 15 фотонов / см 2 / с на расстоянии 14 см от световой поток.
Для того чтобы оценить свет доставлены с помощью устройства, был ли токсичен для клеток в используемых дозах, используемых, мы оценили содержание белка, остающегос в РС12 клеточных культур скважин следующих анализов ROS, с помощью колориметрического анализа белка. Там не было значительной потери белка в любом из более высоких дозах выходных свете (P> 0,05), что указывает на то доза света доставлен не вызывая гибель клеток (фигуре 2) и подходит для использования в оценках окислительного метаболизма.
Рисунок 2: Влияние изменения дозы света по отношению к общей концентрации белка, остающегося в культуральных лунок следующих R / NIR-LT и АФК анализа. Гистограммы представляют собой среднее ± SEM концентрации белка в культуре клеток РС12 скважин, 6 повторов / концентрация, эксперименты были повторены три раза. Там не было статистически значимых различий между контролем и любой из групп лечения, как определено с помощью дисперсионного анализа (ANOVA), р> 0,05.
Мы изначально оценивали эффекты 670 нм света, поставляемые при дозах от 0,0085 до 0,38 Дж / см 2, в качестве примера волны для оценки пригодности световой аппаратурой доставки. Нет существенных эффЭСТ 670 нм свет наблюдался в любом из флюенсах проверенных при оценке либо H 2 O 2 или DCF флуоресценции в PC12, RMC1 или смешанных клеток сетчатки подчеркнул глутаматом (рис 3, р> 0,05). Кроме того, не было никаких существенных эффектов различной длины волн R / NIR-LT, произнесенной на 4,9 х 10 14 фотонов / см 2 / с или 1,3 х 10 15 фотонов / см 2 / с по продукции АФК, при оценке H 2 O 2 или DCF флуоресценции (Р> 0,05, данные не показаны). Наша способность обнаруживать изменения в активных форм подтверждается увеличением флуоресценции реакционноспособного красителя DCFH-DA на 13,44 ± 0,67 мМ глутамата в 22,10 ± 2,10 при 10 мМ глутамата. В то время как наши данные не показывают положительные эффекты R / NIR-LT поставляется с помощью нашего световой аппаратурой доставки на продукции АФК в выбранную модель системы, ни там были негативные последствия, как клетки не нарушена, указывается устойчивого содержания белка в культурелунки после светолечения (рисунок 2). Таким образом, описанный способ обеспечивает протокол для лечения клеток или митохондрий с определенной дозе фотонов в диапазоне длин волн и может быть использовано для оценки более высокие дозы и альтернативные меры результат, который может позволить оптимизацию параметров R / NIR-LT.
Рисунок 3: Количественное определение H 2 O 2 (AC) и DCF (DF) флуоресценции в PC12 (A, D), RMC1 (В, Е) или смешанный сетчатки клеток (C, F) культуры в присутствии 10 мМ глутамата стрессора, после 670 нм лучевой терапии в дозовых дозах от 0 - 0,38 Дж / см 2. Гистограммы представляют собой среднее произвольные единицы флуоресценции / мкг белка ± SEM. Там не было статистически значимымРазличия между контролем и любой из групп лечения, как определено с помощью ANOVA, р> 0,05, 6 дубликатов на группы, эксперименты были повторены три раза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы успешно приспособлены точное и калиброванного системы доставки света, чтобы обеспечить механизм для изучения оптимизации R / NIR-LT в пробирке. Длина волны и интенсивность параметры R / NIR-LT могут манипулировать точно и эффективно использовать эту систему. Мы установили, что светолечение клеток не приводит к гибели клеток, хотя ROS не были сокращены на длинах волн и дозировках, поставляемых в клеточных типов испытания. Максимальные интенсивности, достигнутые нынешней системы на 670 нм (20.11W / м 2), превышают ранее опубликованные мер пенетрантностью облучения в головном мозге крыс, где 1,17 Вт / м 2, достигнутого вентральной поверхности зрительного нерва и 0,3 Вт / м 2 достигнута вентральной поверхности корпуса головного мозга. При доставке в течение 30 мин, доза, полученная клетками зрительного нерва в естественных условиях, следовательно, 0,054 - 0,31 Дж / см 2. Дозы 670 нм света поставляемого в данном исследовании (до 0.38J / см 2), следовательно, включать в себя тех, которые получают клеток в наших предыдущих в естественных условиях исследований.
Наиболее широко распространенная теория R / NIR-LT эффективности является то, что системы 18 на основе photoacceptor, поэтому крайне важно, чтобы убедиться, что клетки, обработанные с различными длинами волн получить равные квантовых флюенсы света (фотонов / см 2 / с) 8. Кроме того, время выдержки используются, чтобы предоставить конкретную плотность энергии света должно быть в соответствии между обработками, и только интенсивности света изменяющейся чтобы увеличить и уменьшить общую плотность энергии с течением времени. Предыдущие исследования показали, что изменение времени экспозиции, чтобы доставить равных дозах облучения приводит к различиям в результатах мер и может выступать в качестве сбивающий фактор, и помешать выявлению оптимальных параметров волны / дозовых необходимых для конкретного повреждения модели 22,23. Таким образом, мы рекомендуем тщательно калибровки дозировкина каждой длине волны тестируемого, чтобы обеспечить полезную оптимизацию R / NIR-LT.
Описанная методика позволяет доставлять света в диапазоне в пробирке модельных систем, включая органотипических культур срез, который может привести к более значимым результатам в связи с сохранением сотовой архитектуры и сложных межклеточных взаимодействий. Вариации на модели повреждения могут потребовать различия в параметрах обработки в R / NIR-LT. Эта методика ограничена максимальной выходной мощности достижимой с описанной аппаратуры. Более высокие выходы питания может потребоваться для некоторых в пробирке и наиболее естественных условиях применения. Если высшие выходы света требуется, устройство может быть изменен, чтобы увеличить интенсивность света, достигающего образцов. Сокращая расстояние между светом терминации и клеток-мишеней будут увеличивать интенсивность света, достигающего пластину. Кроме того, свет может отражаться от зеркала и на клетки, как OPPOСЭД, чтобы фильтровали через жидкую световода, однако альтернативы длины волны и нейтральные фильтры будут необходимы для достижения этой цели. Более высокие выходы, используя более мощный источник света также будет необходима, если метод были быть адаптированы для доставки R / NIR-LT в в естественных условиях модели повреждения ЦНС, в связи с увеличением дозы, необходимые для обеспечения эффективного пенетрантность облучения 8,20 ,
В заключение, данное исследование описывает новый метод светового доставки, что обеспечивает средство эффективно изменять интенсивность и длина волны параметров света в R исследований / NIR-LT. Эта методика будет полезна в оптимизации R / NIR-LT, использующей диапазон измерения результатов и в пробирке моделей травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
