Abstract
Red טיפול / אור האינפרה-אדום קרוב (R / NIR-LT), מועבר על ידי לייזר או אור דיודה (LED), משפר את התוצאות תפקודיות ומורפולוגיים במגוון של פציעות של מערכת עצבים מרכזיות בגוף חי, ככל הנראה על ידי הפחתת לחץ חמצוני. עם זאת, השפעות של R / NIR-LT על סטרס חמצונים הוכחו להשתנות בהתאם לאורך גל או עוצמת הקרינה. מחקרים שהשוו בין פרמטרים טיפול חסרים, בשל העדר מכשירים זמינים מסחרי המספקים אורכי גל מרובים או עוצמות, מתאימים לגבוהה דרך-לשים במחקרי אופטימיזציה מבחנה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה למסירה של אור בטווח של אורכי גל ועוצמות כדי לייעל את המינונים טיפוליים הנדרשים למודל פציעה נתון. חוקרים שערנו כי שיטה להעברת אור, שבו בקלות אפשר לשנות פרמטרים אורך גל ועוצמת, יכולה להקל על קביעת מינון אופטימלי של R / NIR-LT להפחתת מיני חמצן מגיבים(ROS) במבחנה.
אור קסנון ללא קוהרנטית היה מסונן דרך מסנני התערבות פס צר כדי לספק אורכי גל שונים (אורכי גל מרכז 440, 550, 670 ו810nm) וfluences (8.5 x 10 -3 ל -3.8 x 10 -1 J / 2 סנטימטר) של אור לתאים בתרבית. תפוקת אור מהמנגנון כוילה לפלוט מינונים רלוונטיים טיפולי, שווים quantal של אור בכל אורך גל. מינים תגובתי אותרו בגלוטמט הדגיש תאים שטופלו באור, באמצעות DCFH-DA וH 2 O 2 צבעי ניאון רגישים.
אנחנו בהצלחה נמסרו אור בטווח של אורכי גל רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית וטיפולי ועוצמות, לתאים בתרבית נחשפו לגלוטמט כמודל של פגיעה במערכת העצבים המרכזית. בעוד fluences של R / NIR-LT השתמש במחקר הנוכחי לא להפעיל השפעה על ROS שנוצר על ידי התאים בתרבית, השיטה של מסירת אור ישימה למערכות חלקות אחרותEMS לרבות מבודד מיטוכונדריה או יותר מבחינה פיזיולוגית מודלים תרבות הפרוסה organotypic רלוונטיות, ויכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות על מגוון של מדדי תוצאה של מטבוליזם חמצוני.
Introduction
מיני חמצן מגיבים (ROS) נדרשים למגוון רחב של מסלולי העברת אותות ותגובות נורמליות של חילוף חומרים תאיים, כוללים אלה של neuroprotection 1. עם זאת, כאשר המנגנון נוגד חמצון אנדוגני אינו מסוגלים לשלוט בייצור של ROS, תאים עשויים להיכנע ללחץ חמצוני 2,3. בעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזי, העליות הקשורות בנוכחות של ROS וסטרס חמצונים הם חשבו לשחק תפקיד משמעותי בהתקדמות נזק 4,5. למרות המספר הרב של אסטרטגיות להחלשת לחץ חמצוני שכבר העריך, אין כיום, אסטרטגיות נוגדת חמצון רלוונטיים קליני יעילות לחלוטין להחלשת ייצור ROS וסטרס החמצונים הקשורים בשימוש קליני הבא neurotrauma 6. לכן הנחתה של סטרס חמצונים נשארה מטרה חשובה להתערבות טיפולית 7.
שיפורי מעקבR ing / NIR-LT כבר דיווח במגוון רחב של פציעות ומחלות, כולל הפחתה בגודל Cardial אוטם, סיבוכי כליות וכבדים בסוכרת, ניוון רשתית, פגיעה במערכת העצבים המרכזית ושבץ 8, אולי על ידי הפחתת לחץ חמצוני. בהתייחס בפרט לפגיעה במערכת העצבים המרכזית, מחקרים פרה-קליניים של יעילות של 670nm אור הראו השפעות טובות במודלים של ניוון רשתית 9-11, פגיעה בחוט השדרה 12, מוות עצבי 13. ניסויים קליניים שנערכו לגיל יבש הקשורים ניוון מקולרים והם מתנהלים כיום לשבץ 14, אולם התוצאות של ניסויים אלה אינם מופיעים מבטיחות, אולי בשל כשל להעסיק טיפול יעיל פרמטרים 15. ככזה, R / NIR-LT לא אומץ באופן נרחב כחלק מפרקטיקה קלינית רגילה בneurotrauma, למרות היותו קל לניהול, לא פולשנית וטיפול זול יחסית. חסמים לתרגום קליני כוללים חוסר CLמוקדם הבין מנגנון פעולה והיעדר 16,17 פרוטוקול טיפול יעיל סטנדרטי. ספרות הקיימת לגבי טיפול באור מגלה שפע של וריאציה בפרמטרי טיפול ביחס למקורות קרינה (LED או לייזר), גל (לדוגמא, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), מינון כולל (ג 'אול של קרינה / יחידת שטח), משך (זמן חשיפה), תזמון (עלבון מראש או שלאחר), תדירות טיפול ובמצב האספקה (דופק או מתמשך) 8. ההשתנות בפרמטרי טיפול בין המחקרים עושה השוואה קשה ותרמה לספקנות לגבי יעילות 16.
לכן, אופטימיזציה של R / NIR-LT בבירור נדרשת, עם מערכות תרבית תאים מסוגלים לספק את מנגנון הקרנת התפוקה הגבוהה הדרוש כדי להשוות את המשתנים המרובים. עם זאת יש מערכות תאורה זמינות מסחרי כמה שיכול לספק גמישות מספקת ושליטה על wavelength ועוצמה לבצע ניסויי אופטימיזציה כזה. מסחרי התקני LED זמינים הם בדרך כלל לא מסוגלים לספק אורכי גל מרובים או עוצמות, וכתוצאה מכך חוקרי העסקת התקני LED מרובים של יצרנים שונים, אשר עשוי להשתנות לא רק בעצמה, אלא גם את הספקטרום של אורך גל של האור הנפלט. יש לנו לטפל בבעיה זו על ידי שימוש במקור אור בפס רחב קסנון המסונן דרך מסנני התערבות צר, ובכך לייצר מגוון רחב של אורכי גל וfluences של אור, המאפשר שליטה הדוקה, מדויקת של הפרמטרים של R / NIR-LT.
חשוב לציין כי המינון הטיפולי של טיפול מוגדר במספר הפוטונים אינטראקציה עם photoacceptor (chromophore), אשר, במקרה של R / NIR-LT הנחה היא להיות מונואמין ג ציטוכרום (COX) 18. אנרגיית פוטון נמסרה משתנה עם אורך גל; כלומר מינונים שווים של אנרגיה באורכי גל שונה יהיה comיקר של מספרים שונים של פוטונים. לכן, האור הנפלט מהמכשיר כויל לפלוט מספר שווה של פוטונים לכל אחד מאורכי הגל שנבחרו להיבדק. פיתחנו מערכת שיכול לשמש כדי לספק R / NIR-LT במגוון של אורכי גל ועוצמות לתאים במבחנה והפגנתי היכולת למדוד את ההשפעות של R מועבר / NIR-LT על ייצור ROS בתאים נתון ל לחץ גלוטמט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כיול אופטי: מדידת תפוקת אור
- כדי להכין את מנגנון מסירת האור, להתחבר למקור אור בפס רחב (למשל, קסנון או מנורת טונגסטן) לאספקת חשמל מתאימה. מקם עדשת collimating מול מקור האור כדי לייצר קרן collimated של אור. להעביר את האור דרך מסנן חום נוזלי כדי להסיר ביותר של החום מקרן האור. בהתאם ליישום, למקד את אלומת collimated על צמצם הכניסה של מדריך אור נוזלי, אשר מספק למסירה גמישה יותר של האור (לדוגמא., לחממה).
- בקצה השני של ספר אור הנוזלי, למקם את העדשה שנייה collimating ולאחר מכן בעל להפרעות ומסנני צפיפות ניטראליים. בדוק שהסדר זה מייצר מקום מואר באופן שווה של אור של תחום הגלים ועוצמה הרצויים.
הערה: המרחק בין סוף ספר האור ומטוס הדגימה ייתכן שיהיה צורך להשתנות בהתאם להאזור זה חייב להיות מואר, אך יש לזכור כי ככל שהמרחק מהקצה של עליות מדריך אור, עוצמת אור תקטן. במחקר הנוכחי, מרחק זה הוא 14cm ומייצר חתך קורה שבאופן שווה מאיר אזור היטב 3x3 על צלחת 96-היטב. - ודא שאור תועה מהמנורה והרכיבים אופטיים הקשורים הוא לא הצליח להגיע לדגימה.
- הפעל את מתקן המים הקרים למסנן החום הנוזלי ולהבטיח שיש חילופי מים דרך מסנן המעיל. הפעל את מקור כוח המנורה ולחכות לפחות 5 דקות למקור אור בפס רחב לייצוב. הערה: השימוש במים הקריר נדרש כדי למנוע חימום יתר של המכשיר.
- בחר מסנן התערבות צר (בדרך כלל שתואר על ידי אורך הגל שלהם המרכז, העברת שיא ורוחב חצי מקסימום רוחב פס (FWHM)) על מנת ליצור את תחום הגלים הרצויים של תאורה. הערה: מסנני ההתערבות צר ששמשו במחקר הנוכחי היו 442 ננומטר, 550 ננומטר, 671 ננומטר ו810 ננומטר.
- מדוד את האור המיוצר על ידי המנורה במטוס שבו הדגימה היא להיות ממוקמת במהלך טיפול. למדוד אור באמצעות בדיקה מכוילת irradiance (אספן קוסינוס) מחוברת לspectroradiometer מתאים, באמצעות תוכנת תקינות לפי הוראות יצרן.
- השתמש במסנני צפיפות ניטראליים כדי להתאים את עוצמת האור עד התפוקה הרצויה מתקבלת. הערה: במחקר הנוכחי, את עוצמת האור שנתקבל בכל מסנן התערבות מותאמת לתת תפוקת quantal שווה בכל אחד מארבעת תחומי תדרי הטיפול. חשוב לבדוק את הכיול באופן קבוע, כפלט המנורה עשוי להשתנות.
הערה: בעקבות ההגדרה של המנגנון, התאים מוכנים להיות מואר איור 1 הוא ייצוג של מנגנון אספקת האור השתמש במחקר הנוכחי..
תמונת איור 1. של מנגנון משלוח האור. אילוסטרייטד היא מקור כוח האור, מנורת קסנון עם דיור, עדשת collimating, מסנן מים, צמצם כניסה, מדריך אור נוזלי, עדשת collimating שנייה, בעל מסנן, מסגרת טיפול ושחור כרטיס מט. שים לב כי מסנני אורך הגל ועוצמת צרי אינם מוצגים.
2. תא הכנה
- שיטת ההצגה המתוארת R / NIR-LT יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא או במערכת מודל חוץ גופית; כתיאורים של תרבית תאים כגון הבאים הם כלליים, תוך שימוש בטכניקות מבוססות היטב לpheochromocytoma התרבות (PC12), Müller (rMC1) ותאי רשתית מעורבים עיקריים.
- לפני זריעת תאים לטיפול באור וassay סטרס חמצונים, התרבות הנציחה תאים בתקשורת הצמיחה שלהם המכילות תוספים מתאימים (לדוגמא., FBS, אנטיביוטיקה) בflas T75ks עד מחוברות 70-80%.
- ניתוק תאים הונצחו מצלוחיות T75, תוך שימוש בשיטה מתאימה לסוג התא להיבדק למשל., טריפסין. אם יש צורך, לפני שתמשיך עם הזריעה של תאים ב96-גם צלחות assay, בארות צלחת assay המעיל עם 10μg / poly-L ליזין מיליליטר עבור 1h (למשל., לתאי PC12) או 10μg poly-L ליזין / מ"ל ל 1H ואחריו O / דגירה N עם 10μg / ml laminin (למשל., לתאי רשתית מעורבים).
- תאי צנטריפוגה כדי לאסוף מתאימים כ( למשל., 3 דק 'ב 405 XG לתאי PC12 או 10 דקות ב 218 XG לתאי rMC1), להסיר את supernatant וגלול ב8 מיליליטר של תקשורת בתרבות התא המתאימה.
- אם תאים ברשתית מעורב הם לשמש, להכין מגורי חולדה ילוד P0-5 על ידי עיכול אנזימטי (פפאין) על פי נהלים שנקבעו 19
- לספור את מספר תאי קיימא בניכוי 0.4% (w / v) צבע כחול trypan, באמצעות haemocytometer.
- התאם suc צפיפות תאיםh כי תאים יהיו כ 70-80% ומחוברות לאחר 24 או 48 שעות בתרבות. (לתאי PC12 צפיפות הזריעה היא 4.0 x 10 5 תאים / מיליליטר קיימא, לתאי rMC1, זה 2.5 x 10 5 תאי קיימא / מיליליטר ולתאי רשתית מעורבים זה 8 x 10 5 תאים / מיליליטר קיימא). לאחר הוספת תאים לאו 96-גם צלחות ברורות או שחורות (המשמשות לH 2 O 2 או assay DCFH-DA בהתאמה), בתקשורת של צמיחה המתאימה 100 μl, לאפשר צלחת לשבת על משטח שטוח על 37 מעלות צלזיוס, 5 % CO 2 (או מה תנאים מתאימים לסוג תא המסוים) לפחות 24 שעות כדי לאפשר לדבקות תא.
- תרבות תאים בתקשורת צמיחה במגשי 96 גם המתאימים עד שהם ומחוברות 70-80% (24 שעות לPC12 ותאי rMC1, 48h לתאי רשתית מעורבים).
3. הוספת גלוטמט לחץ לתאים
- הכן ריכוזי לחץ מימה מלח L-גלוטמית מונוסודיום החומצה של 0-10mM בgrow המלא המתאיםתקשורת ותרבות ה.
- הסר את המדיה מהתאים ולשטוף בעדינות תאים 3 פעמים עם PBS (PC12) או HBSS (rMC1 ותאי רשתית מעורבים). לאחר שטיפה, להוסיף מדיה המכיל גלוטמט להיקף כולל של 100 μl / טוב.
4. ראשית מינונים של טיפול אור
- מייד עם תוספת של גלוטמט או הלחץ של בחירה, חושף את התאים לטיפול באור באורכי הגל והעוצמות הרצויים על ידי הצבת תחת מנגנון אספקת האור מוכן. הקפד לשנות את פלט quantal של קרן האור באמצעות שילובים הוקמו במסנני צפיפות ניטראליים בהתאם לאורך הגל להיות מנוהלת.
הערה: בניסויים הנוכחיים, חושף את התאים לטיפול באור 3 דקות לשמור על הטמפרטורה על ידי נח 96 הצלחות גם על משטח חום C 37 o. זמן טיפול עשוי להיות מגוון, כנדרש.- הנח שחור מט כרטיס מתחת לתאים כדי למנוע אור המשקף לבארות סמוכות ב96-welמגש l מיועד לפרמטרים טיפול אחרים.
- אם הטיפול הוא רצוי לאורכי זמן ארוכים יותר, להוסיף למאגר 25mm Hepes לשמור pH של התקשורת בתרבות תא או באופן אידיאלי, במקום צלחות המנגנון וטיפול בתוך חממה עם ריכוז CO 2 המוסדרים עד 5% CO 2, או תנאים שהם אופטימליים לסוג תא המסוים.
- לאחר השלמת הטיפול באור, למקם את התאים על משטח ישר ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (או מה תנאים אופטימליים לסוג התא) ל24h.
הערה: מינונים נוספים של R / NIR-LT יכולים להינתן כמתואר לעיל, כרצונכם.
5. סופי מינון של אור טיפול ואיתור של ROS
- לפני ביצוע הסיבוב של טיפול באור האחרון, להכין את חומרים כימיים שישמשו לזיהוי ROS. הכן חיץ 50mm ציטרט (pH6.0), טריטון X100, וH 2 O 2 מגיב זיהוי עובדפתרון (1: 2: 97 יחס של 2 O 2 פתרון מניות מגיב זיהוי 10mm H; 10 U / peroxidase חזרת מיליליטר; נתרן ציטרט 50mm (pH 6.0)). הכן DCFH-DA בריכוז סופי של 100μM בתקשורת מתאימה.
הערה: מגיב DCFH-DA לתאי PC12 הוא בתקשורת RPMI, מגיב DCFH-DA לתאי rMC1 הוא בתקשורת DMEM. שים לב שיש לי ריאגנטים זיהוי זמינים מסחרי רגישויות ההפרש לROS הספציפי ויש לבחור ריאגנטים בקפידה כדי לספק את המידע מבוקש עבור יישום בודד. - לנהל טיפול באור לתאים, כמתואר בשלב 4.1-4.1.2. מטופלים להבטיח את התאים עם fluences / אורכי הגל הרצויים של אור.
- מייד לאחר טיפול באור, להסיר את המדיה המכיל גלוטמט ולשטוף פעמיים עם פתרון חיץ מתאים (לתאי PC12, PBS משמש ולתאי rMC1, HBSS משמש). לבצע את מבחני ROS בתאים באופן הבא:
- H 2 O 2 2 במשך 15 דקות. הוסף 50 μl של H 2 O 2 פתרון עובד איתור ודגירה של 30 דקות ב RT. למדוד הקרינה באמצעות קורא צלחת עם גל עירור של 530nm ואורך גל פליטה של 480nm.
- assay DCF: להוסיף משל DCFH-DA הפתרון 100 מיקרומטר לכל אחד מהבארות 100 μl ו דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הסר את המדיה המכילה 100 מיקרומטר DCFH-DA ולשטוף עם פתרון חיץ מתאים (כמתואר לעיל) פעמיים. להוסיף 90 μl של פתרון חיץ ו -10 μl טריטון X100 לכל אחד מהבארות ובעדינות לנער על שייקר מסלולית למשך 30 שניות לפני 15 דקות דגירה על 37 מעלות צלזיוס. למדוד הקרינה נגזרה DCF באמצעות קורא צלחת עם גל עירור של 480nm וwavel פליטהength של 530nm.
- Express ROS ערכים ביחס לריכוז החלבון של תאים שנותרו בבארות, באמצעות ערכת colorimetric לכמת ריכוז חלבון על פי הוראות יצרן, תוך התייחסות לעקומה סטנדרטית לחישוב חלבון מ"ג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפלט של אור נמסר באורך גל של 670nm כויל באמצעות מסנני צפיפות ניטראליים כדי להקרין תאים עם מגוון רחב של fluences מקיף מינון של 670nm אור הראה בעבר להיות מועיל in vivo (0.3 J / cm 2) 20. ככל שמספר מסנני צפיפות ניטראליים מול מקור האור גדל, עוצמת (W / m 2) ירד, מה שמאפשר פחות אור לעבור לאזור היעד. לוח 1 מציג את נתוני הכיול של 670nm אור שנוצרו ממצויד במסנן אורך גל מקור האור וכולל מספר של מסנני ND משמשים ואת עוצמת האור שנוצרה כתוצאה מכך, במרחקים שתוארו מתפוקת האור. Fluence, או מנה של 670nm אור (J / 2 סנטימטר), חושבה מהמשוואה: [Dose (J / 2 סנטימטר) = זמן x (s) (עוצמת אור (W / m 2) / 10,000)], שבו זמן טיפול היה 180s.
| מספר מסנני ND | מרחק מתפוקת אור (סנטימטר) | עוצמה (W / m ^ 2) | מינון (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0.38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0.19 |
| 1 | 14 | 4.91 | 0.075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0.041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0.018 |
| 4 | 14 | 0.47 | .0085 |
| 5 | 14 | 0.21 | 0.0038 |
| 6 | 14 | וחושב תוך 0.094 | .00169 |
| 7 | 14 | 0.045 | .00081 |
| 8 | 14 | 0.021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0.013 | 0.000234 |
טבלה 1: פלט של מצויד במסנן אורך גל 670nm .Number של מסנני ND מנגנון אספקת האור מתייחס למספר של מסנני צפיפות ניטראליים מצוידים לחזית של פלט מקור האור. עוצמה (ג / מ W 2) מתייחסת לעוצמת האור כפי שדווח על ידי התוכנת תקינות דואר. Fluence, או מינון מחושב על ידי המשוואה [Dose (J / 2 סנטימטר) = זמן x (s) (עוצמת אור (W / m 2) / 10,000)], שבו זמן חשיפה היה 180s ומרחק מתפוקת האור היה 10.5 או 14 סנטימטר.
שתי fluences quantal הרלוונטי קליני של אור נבחר לחקור השפעות שונות של R אורך גל / NIR-LT על ייצור של ROS. מנה שיכול להגיע שטחי CNS הבאים שידור דרך רקמות שמעליה באמצעות התקני LED (כלומר, 1.78 W / m 2 ב670nm) 20 השווה ל 0.03 J / 2 סנטימטר לטיפול 3 דקות, או 4.9 x 10 14 פוטונים / 2 סנטימטר / s. מקור האור מצויד במסננים כדי לגרום לפליטה של 442, 550, 670 או 830nm אז מכויל באמצעות שילובים של מסנני צפיפות ניטראליים לפלוט יציאות quantal שווים (פוטונים) לכל אורך גל בניגוד לתפוקות אנרגיה (J / 2 סנטימטר), והמינונים (J / 2 סנטימטר) וintensities בW / m 2 מחושבים (לוח 2 א). מינון גבוה יותר נוסף שהיה במסגרת ההנחיות המומלצת להמרצת פעילות תאית 21 שימשו גם (1.29 x 10 15 פוטונים / 2 / s סנטימטרים), וכיול שנערך לכל אורך גל (טבלה 2 ב).
| אורך גל (λ) | מינון (J / cm ^ 2) | עוצמה (W / m ^ 2) | פליטה (פוטונים / סנטימטר ^ 2 / s) |
| 442 | 0.057 | 3.21 | 4.8 x 10 ^ 14 |
| 550 | .051 | 2.87 | 5.0 x 10 ^ 14 |
| 670 | 0.032 | 1.78 | 4.9 x 10 ^ 14 |
| 830 | 0.018 | 1.01 | 4.9 x10 ^ 14 |
טבלה 2:. כיול של עוצמת המינון מועבר על ידי מספר שווה של פוטונים של אור באורכי גל שונה בעצימות (W / m 2), מינון לטיפול 3 דקות (J / 2 סנטימטר) ופליטה (פוטונים / 2 סנטימטר / s) כאשר פלט של אור קסנון פולטות 442, 550, 670 ו830nm מכויל לפלוט) 4.9 x 10 14 פוטונים / 2 שעה / סנטימטר או B) 1.3 x 10 15 פוטונים / 2 סנטימטר / s במרחק של 14 סנטימטרים מ תפוקת אור.
על מנת להעריך האם האור מועבר על ידי המנגנון היה רעיל לתאים במינונים המשמשים, אנו הערכנו את תכולת החלבון שנותרה בבארות תרבית תאי PC12 הבאים מבחני ROS, באמצעות assay חלבון colorimetric. לא היה אובדן משמעותי של חלבון בכל מינונים של התפוקה גבוהות יותר של האור (P> 0.05), המצביע על כך את המינון של אור נמסר לא היה גורם למוות של תאים (figurדואר 2), והוא מתאים לשימוש בהערכות מטבוליזם חמצוני.
איור 2: השפעה של משתנה מנות של אור על ריכוז החלבון הכולל שנותר בבארות התרבות הבאות R / NIR-LT וassay ROS. הברים היסטוגרמה הם ממוצעים ± SEM ריכוזי חלבון בבארות תרבית תאי PC12, 6 חזרות / ריכוז, ניסויים חוזרים ונשנים 3 פעמים. לא היו הבדלים משמעותיים סטטיסטי בין שליטה ואף אחת מקבוצות הטיפול, כפי שנקבעו על ידי ניתוח שונות (ANOVA), p> 0.05.
אנחנו בתחילה הערכנו את ההשפעות של 670nm אור, נמסרו בfluences החל .0085-0.38 J / 2 סנטימטר, כאורך גל דוגמא להעריך את ההתאמה של מנגנון אספקת האור. אין EFF המשמעותיect של 670nm אור נצפה בכל fluences נבדק בעת ההערכה או H 2 O 2 או הקרינה DCF בPC12, rMC1 או תאי רשתית מעורבים הדגישה עם גלוטמט (איור 3, P> 0.05). בדומה לכך, לא היו השפעה משמעותית של משתנה אורכי גל של R / NIR-LT נמסר על 4.9 x 10 14 פוטונים / 2 סנטימטר s / או 1.3 x 10 15 פוטונים / 2 סנטימטר / s על ייצור ROS, כאשר להערכת H 2 O 2 או הקרינה DCF (P> 0.05, מידע לא מוצג). היכולת שלנו לזהות שינויים במינים תגובתי אושר על ידי עלייה בקרינה של הצבע תגובתי DCFH-DA ב13.44 ± 0.67 מ"מ לגלוטמט 22.10 ± 2.10 ב10mm גלוטמט. בעוד הנתונים שלנו לא חושפים השפעות חיוביות של R / NIR-LT מסופק לגידולים באמצעות מנגנון אספקת האור שלנו בייצור ROS במערכת המודל שנבחרה, לא היו שם תופעות שליליות כמו תאים לא נפגעו, שצוינו על ידי תכולת חלבון מתמשכת בתרבותבארות הבאות טיפול באור (איור 2). ככזה, בשיטה המתוארת מספקת פרוטוקול לטיפול בתאים או המיטוכונדריה עם מינון מוגדר של פוטונים במגוון רחב של אורכי גל ועשויה לשמש כדי להעריך את מינון ומדדי תוצאה חלופיים, אשר עשוי לאפשר אופטימיזציה של פרמטרים / NIR-LT R גבוהים יותר.
איור 3: כימות H 2 O 2 (AC) וDCF הקרינה (DF) בPC12 (A, D), rMC1 (B, E) או תאים ברשתית מעורבים (C, F) תרבויות בנוכחות לחץ גלוטמט 10mm, לאחר טיפול קרינת 670nm במינונים שטף החל 0-0.38 J / 2 סנטימטר. ברים ההיסטוגרמה מייצגים את חלבון יחידות הקרינה שרירותיות הממוצעת / מיקרוגרם ± SEM. לא היו משמעותי מבחינה סטטיסטיתהבדלים בין שליטה ואף אחת מקבוצות הטיפול, כפי שנקבעו על ידי ANOVA, p> 0.05, 6 משכפל לכל קבוצה, ניסויים חוזרים ונשנים 3 פעמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו להתאים בהצלחה מערכת אספקת האור מדויקת ומכוילת לספק מנגנון למחקר של אופטימיזציה של R / NIR-LT במבחנה. פרמטרים אורך גל ועוצמת R / NIR-LT מסוגלים לטפל בצורה מדויקת ויעיל באמצעות מערכת זו. אנחנו קבענו כי טיפול באור של התאים לא הובילו למוות של תאים, אם כי ROS לא הוקטן באורכי הגל והמינון נמסרו, בסוגי התאים שנבדקו. העוצמות המרביות מושגת על ידי המערכת הנוכחית ב670nm (20.11W / m 2) נמצאות בעודף של צעדים שפורסמו בעבר של חדירות של קרינה למוח החולדה, שבי 1.17 W / m 2 הגיע למשטח הגחון של העצב ו0.3W האופטיים / M 2 הגיע למשטח הגחון של מקרה המוח. כאשר נמסרו למשך 30 דקות, במינון שקיבל תאים של עצב הראייה בvivo לכן .054-0.31 J / 2 סנטימטר. המינונים של 670nm אור נמסר במחקר הנוכחי (עד 0.38J / 2 סנטימטר) ולכן להקיף אלה שהתקבלו על ידי תאים במחקרים הקודמים שלנו in vivo.
התאוריה המקובלת ביותר של R יעילות / NIR-LT היא זה של מערכת מבוססת photoacceptor 18, לכן זה הכרחי כדי להבטיח שתאים שטופלו באורכי גל שונים לקבל fluences quantal שווה של אור (פוטונים / 2 / s סנטימטרים) 8. בנוסף, זמן החשיפה המשמש להעברת שטף מסוים של אור חייב להיות כל הזמן עולה בקנה אחד בין טיפולים, עם רק עוצמת האור משתנה כדי להגדיל ולהקטין את השטף כולל לאורך זמן. מחקרים קודמים הראו ששינוי זמן החשיפה כדי לספק תוצאות fluences שווה בהבדלים במדדי תוצאה ויכול לפעול כגורם בלבול, ולעכב את זיהוי של הפרמטרים אורך גל / שטף האופטימלי הנדרשים למודל פציעה מסוים 22,23. ככזה, אנו ממליצים כיול המדוקדק של מינוןבכל אורך גל שנבדק, כדי להבטיח אופטימיזציה שימושית של R / NIR-LT.
הטכניקה המתוארת מאפשרת משלוח של אור למגוון רחב של מערכות מודל במבחנה כולל תרבויות פרוסה organotypic, אשר עלול לגרום לתוצאות משמעותיות יותר בשל השימור של אדריכלות סלולרית ואינטראקציות בין-תאיות מורכבות. וריאציות על מודל הפציעה עשויות לדרוש הבדלים בפרמטרי טיפול בR / NIR-LT. טכניקה זו היא מוגבלת על ידי ההספק המרבי השגה עם המכשור תאר. תפוקות חשמל גבוהות עשויות להידרש לחלק במבחנה וביותר ביישומי vivo. אם תפוקות גבוהות יותר של אור נדרשים, המנגנון עשוי להשתנות כדי להגדיל את עוצמת האור המגיע לדגימות. קיצור המרחק בין תאי סיום ויעד האור יגביר את עוצמת האור המגיע לצלחת. לחלופין, ניתן האור מוחזר מן מראה ועל גבי התאים כOPPOsed למסונן דרך ספר אור נוזלי, אך אורך גל חלופי ומסנני צפיפות ניטראליים יידרשו כדי להשיג את זה. גם תפוקות גבוהות יותר באמצעות מקור אור חזק יותר היו נדרשו אם השיטה הייתה להיות מותאמות למסירה של R / NIR-LT בin vivo מודלים של פגיעה במערכת העצבים המרכזית, בשל המינונים הגדולים יותר שיידרשו כדי להבטיח חדירות יעילות של קרינת 8,20 .
לסיכום, המחקר הנוכחי מתאר שיטה חדשה של משלוח האור שמספק אמצעי יעיל לשנות פרמטרים עוצמה ואורך גל של אור בלימודים / NIR-LT R. מתודולוגיה זו תהיה שימושית באופטימיזציה של R / NIR-LT משתמשת במגוון של מדדי תוצאה ובמודלי פציעת מבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
