Abstract
أحمر / العلاج شبه ضوء الأشعة تحت الحمراء (R / NIR-LT)، وسلمت عن طريق الليزر أو ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED)، ويحسن النتائج الفنية والصرفية في مجموعة من إصابات الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي، وربما عن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، فقد ثبت آثار R / NIR-LT على الاكسدة تختلف اعتمادا على الطول الموجي أو شدة الإشعاع. الدراسات التي تقارن المعلمات العلاج غير موجودة، نظرا لعدم وجود الأجهزة المتوفرة تجاريا التي تقدم موجات متعددة أو شدة، ومناسبة لأعلى مستوى من خلال وضع في الدراسات الأمثل المختبر. يصف هذا البروتوكول تقنية للتسليم من الضوء على مجموعة واسعة من الأطوال الموجية وشدة لتحسين الجرعات العلاجية المطلوبة للنموذج إصابة معينة. لقد افترضنا أن وسيلة لإيصال الضوء، والتي يمكن بسهولة تغيير الطول الموجي وشدة المعلمات، يمكن أن يسهل تحديد جرعة المثلى لR / NIR-LT للحد من أنواع الاكسجين التفاعلية(ROS) في المختبر.
تم تصفيتها غير متماسك زينون الضوء من خلال مرشحات تدخل ضيقة النطاق لتقديم موجات متفاوتة (موجات مركز 440، 550، 670 و 810nm) وfluences (8.5 × 10 -3 إلى 3.8 × 10 -1 J / سم 2) من الضوء إلى الخلايا المستزرعة. تم معايرة الضوء الناتج من الجهاز لتنبعث منها جرعات كمي ذات الصلة علاجيا، متساوية من الضوء في كل الطول الموجي. تم الكشف عن الأنواع المتفاعلة في وأكدت الغلوتامات الخلايا المعالجة مع الضوء، وذلك باستخدام DCFH-DA وH 2 O 2 الأصباغ الفلورية الحساسة.
سلمنا بنجاح الضوء على مجموعة من الناحية الفسيولوجية وعلاجيا موجات وشدة ذات الصلة، إلى الخلايا المستزرعة تتعرض لالغلوتامات كنموذج للإصابة الجهاز العصبي المركزي. في حين أن fluences من R / NIR-LT المستخدمة في الدراسة الحالية لم ممارسة تأثير على ROS التي تولدها الخلايا المستزرعة، وطريقة التسليم الخفيف ينطبق على نظم ال آخريننظم الإدارة البيئية بما في ذلك الميتوكوندريا أو أكثر من الناحية الفسيولوجية نماذج ثقافة شريحة عضوي النمط ذات الصلة معزولة، ويمكن استخدامها لتقييم الآثار على مجموعة من التدابير نتائج الأيض التأكسدي.
Introduction
يرجى ملء أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) لطائفة من إشارة مسارات نقل وردود الفعل الطبيعية من الأيض الخلوي، بما في ذلك الحماية العصبية 1. ومع ذلك، عندما آلية مضادة للأكسدة الذاتية غير قادرة على السيطرة على إنتاج ROS، الخلايا قد فريسة لالاكسدة 2،3. وبعد إصابة في الجهاز العصبي المركزي، ويعتقد أن الزيادات المرتبطة بحضور ROS والاكسدة للعب دور كبير في تطور الضرر 4،5. على الرغم من العدد واسعة من استراتيجيات لتخفيف الاجهاد التأكسدي التي تم تقييمها، وهناك حاليا أي والاستراتيجيات المضادة للأكسدة فعالة تماما ذات الصلة سريريا لتخفيف إنتاج ROS والاكسدة المرتبطة بها في الاستخدام السريري التالية رضح عصبي 6. وبالتالي تخفيف الإجهاد التأكسدي يبقى هدفا مهما للتدخل العلاجي 7.
تحسينات تتبعتم الإبلاغ جي R / NIR-LT في مجموعة واسعة من الإصابات والأمراض بما في ذلك تخفيض في فؤادي حجم احتشاء، والمضاعفات الكلوية والكبدية أثناء مرض السكري، وتنكس الشبكية أو الإصابة CNS والسكتة الدماغية 8، ربما عن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي. مع إيلاء اهتمام خاص إلى إصابة الجهاز العصبي المركزي، وقد أظهرت الدراسات قبل السريرية من فعالية ضوء 670nm آثار جيدة في نماذج من تنكس الشبكية 9-11، واصابات الحبل الشوكي 12، موت الخلايا العصبية (13). وقد أجريت التجارب السريرية لسن الجافة بتحلل البقعة الصفراء والتي تجرى حاليا للسكتة الدماغية 14، إلا أن نتائج هذه التجارب لا تظهر واعدة، وربما يرجع ذلك إلى عدم توظيف علاج فعال المعلمات 15. على هذا النحو، لم يعتمد R / NIR-LT على نطاق واسع كجزء من الممارسة السريرية العادية في رضح عصبي، على الرغم من كونه وسيلة سهلة لإدارة، غير الغازية والعلاج غير مكلفة نسبيا. وتشمل الحواجز على الترجمة السريرية عدم وجود CLأدركت منذ البداية آلية العمل وعدم وجود موحد فعال 16،17 بروتوكول العلاج. الأدب الحالي بشأن العلاج بالضوء يكشف عن عدد كبير من التباين في المعايير في المعاملة بين مصادر الإشعاع (LED أو ليزر)، والطول الموجي (على سبيل المثال، 630، 670، 780، 810، 830، 880، 904nm)، الجرعة الإجمالية (جول من الإشعاع / وحدة المساحة)، ومدة (زمن التعرض) والتوقيت (إهانة ما قبل أو ما بعد)، وتواتر العلاج وطريقة التسليم (نبض أو مستمر) 8. التباين في المعاملة بين المعلمات دراسات يجعل المقارنة صعبة وساهم في الشكوك بشأن فعالية 16.
لذلك، والتحسين من R / NIR-LT مطلوب بشكل واضح، مع أنظمة قادرة على توفير آلية فحص عالية الإنتاجية اللازمة لمقارنة متغيرات متعددة ثقافة الخلية. ولكن هناك عدد قليل من النظم الإضاءة المتاحة تجاريا التي يمكن أن توفر ما يكفي من المرونة والسيطرة على واvelength وشدة لأداء مثل هذه التجارب الأمثل. تجاريا المتاحة أجهزة LED هي عموما ليست قادرة على تقديم الأطوال الموجية أو شدة متعددة، مما أدى إلى المحققين توظيف عدة أجهزة LED من مختلف الصانعين، والتي قد تختلف ليس فقط في شدة، ولكن أيضا الطيف من الطول الموجي للضوء المنبعث. لقد تناولت هذه القضية من خلال توظيف مصدر ضوء زينون النطاق العريض التي تمت تصفيتها من خلال مرشحات تدخل الضيق، وبالتالي توليد مجموعة من الأطوال الموجية للضوء وfluences، مما يسمح ثيقة، مراقبة دقيقة من المعلمات من R / NIR-LT.
من المهم أن نلاحظ أن الجرعة العلاجية من العلاج تم تعريفه من قبل عدد من الفوتونات التفاعل مع photoacceptor (حامل اللون)، والتي، وافترض في حالة R / NIR-LT أن تكون السيتوكروم ج أوكسيديز (COX) 18. طاقة الفوتون تسليمها يختلف مع الطول الموجي. وهذا يعني جرعات متساوية للطاقة في أطوال موجية مختلفة يكون كومنفيسة من أرقام مختلفة من الفوتونات. ولذلك، فإن الضوء المنبعث من الجهاز تم معايرة لتنبعث منها عدد متساو من الفوتونات لكل من الأطوال الموجية المختار لفحصها. قمنا بتطوير نظام التي يمكن استخدامها لتقديم R / NIR-LT في مجموعة واسعة من الأطوال الموجية وشدة إلى خلايا في المختبر، وأثبت القدرة على قياس الآثار المترتبة على تسليمها R / NIR-LT على الإنتاج ROS في الخلايا تعرض ل الإجهاد الغلوتامات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بصري المعايرة: قياس الضوء الناتج
- لإعداد جهاز تسليم خفيفة، توصيل مصدر الضوء النطاق العريض (على سبيل المثال، زينون أو مصباح التنجستن) لامدادات الطاقة المناسب. ضع العدسة الموازاة أمام مصدر الضوء لإنتاج شعاع موازى للضوء. تمرير الضوء من خلال مرشح الحرارة السائل لإزالة معظم الحرارة من شعاع ضوء. اعتمادا على التطبيق، والتركيز شعاع موازى إلى فتحة مدخل دليل ضوء السائل، والذي ينص على تسليم أكثر مرونة من الضوء (على سبيل المثال، إلى حاضنة).
- في الطرف الآخر من دليل ضوء السائل، ضع العدسة الموازاة الثانية ثم حامل للتدخل ومرشحات الكثافة محايدة. تحقق من أن هذا الترتيب ينتج بقعة مضيئة بالتساوي من ضوء و waveband المطلوب وشدة.
ملاحظة: المسافة بين نهاية نور الهداية والطائرة العينة قد تحتاج إلى تختلف تبعا لالمنطقة التي يجب أن تكون مضيئة، ولكن تذكر أن والمسافة من نهاية الزيادات دليل الخفيفة، وشدة الضوء ستنخفض. في هذه الدراسة، هذه المسافة هي ل 14cm وتنتج المقطع العرضي شعاع الذي ينير بالتساوي على المنطقة جيدا 3X3 على طبق من ذهب 96-جيدا. - تأكد من أن الضوء الشارد من مصباح والمكونات البصرية المرتبطة بها غير قادر على الوصول إلى العينة.
- بدوره على برودة الماء لتصفية حرارة السائل وضمان عدم وتبادل المياه من خلال سترة التصفية. بدوره على مصدر الطاقة مصباح والانتظار لمدة 5 دقائق على الأقل لمصدر ضوء النطاق العريض لتحقيق الاستقرار. ملاحظة: مطلوب استخدام برودة الماء لمنع الإفراط في التدفئة للجهاز.
- اختر مرشح تدخل الضيق (التي توصف عادة من قبل الطول الموجي لها مركز، النفاذية الذروة والعرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM) عرض النطاق الترددي) لتوليد و waveband المطلوب من الإضاءة. ملاحظة: وكانت المرشحات تدخل الضيق المستخدمة في الدراسة الحالية 442 نانومتر و 550 نانومتر، 671 نانومتر و 810 نانومتر.
- قياس الضوء التي تنتجها مصباح في الطائرة حيث العينة هو وضعه خلال فترة العلاج. قياس الضوء باستخدام مسبار الإشعاع معايرة (جيب التمام جامع) متصلة مقياس الطيف مناسبة، وذلك باستخدام برنامج اللياقة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- استخدام مرشحات الكثافة محايدة لضبط شدة الضوء حتى يتم الحصول على النتيجة المرجوة. ملاحظة: في هذه الدراسة، ويتم ضبط شدة مرت من قبل كل مرشح تدخل ضوء لإعطاء ناتج كمي على قدم المساواة في كل من wavebands العلاج الأربعة. فمن المهم للتحقق من معايرة بانتظام، والإخراج المصباح هو عرضة للتغيير.
ملاحظة: بعد مجموعة تتكون من جهاز، والخلايا جاهزة للمضيئة الشكل 1 هو تمثيل لجهاز تسليم ضوء المستخدمة في الدراسة الحالية.
الشكل 1. صورة الجهاز تسليم خفيفة. المصور هي مصدر الطاقة الخفيفة، مصباح زينون مع السكن، عدسة الموازاة، تصفية المياه، ومدخل الفتحة، دليل ضوء السائل، عدسة الموازاة الثانية، حامل مرشح، والإطار العلاج وغير لامع بطاقة سوداء. لاحظ أن الضيق الطول الموجي وشدة المرشحات لا تظهر.
2. خلية التحضير
- وR / NIR-LT طريقة التسليم وصفها يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا أو في نظام نموذجي المختبر. على هذا النحو الأوصاف التالية من زراعة الخلايا هي عامة، وذلك باستخدام تقنيات راسخة لورم القواتم الثقافة (PC12)، مولر (rMC1) وخلايا الشبكية المختلطة الابتدائية.
- قبل البذر خلية للعلاج الخفيفة والأكسدة الإجهاد الفحص، تخليد ثقافة الخلايا في وسائل الإعلام الخاصة النمو منها تحتوي على المكملات المناسبة (على سبيل المثال، FBS والمضادات الحيوية) في إف إل أي إس T75كانساس حتى 70-80٪ متموجة.
- فصل خلايا خلدت من قوارير T75، وذلك باستخدام الطريقة المناسبة لنوع من الخلايا لفحصها على سبيل المثال.، التربسين. إذا لزم الأمر، قبل الشروع في البذر من الخلايا في 96-جيدا لوحات الفحص والآبار لوحة معطف مقايسة مع 10μg / مل بولي-L-ليسين ل1H (على سبيل المثال، للخلايا PC12) أو 10μg / مل بولي-L-ليسين ل 1H يعقبه O / N الحضانة مع 10μg / مل laminin (على سبيل المثال، للخلايا الشبكية مختلطة).
- خلايا الطرد المركزي لجمع حسب الاقتضاء (على سبيل المثال، 3 دقائق في 405 x ج لخلايا PC12 أو 10 دقيقة في 218 x ج لخلايا rMC1)، وإزالة وطاف resuspend في 8 مل من المناسب سائل الإعلام ثقافة الخلية.
- إذا خلايا الشبكية مختلطة هي لاستخدامها، وإعداد من P0-5 الفئران الوليدة حديثي الولادة عن طريق الهضم الأنزيمي (غراء) وفقا للإجراءات المقررة 19
- حساب عدد خلايا قابلة للحياة باستثناء 0.4٪ (ث / ت) صبغة زرقاء التريبان، وذلك باستخدام haemocytometer.
- ضبط كثافة الخلية يرغب، يمثح أن الخلايا ستكون حوالي 70-80٪ متموجة بعد 24 أو 48H في الثقافة. (للخلايا PC12 كثافة البذر هي 4.0 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل، للخلايا rMC1، فمن 2.5 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل وللخلايا الشبكية المختلطة هو 8 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل). بعد إضافة خلايا إما لوحات 96-جيدا واضحة أو السوداء (التي تستخدم لH 2 O 2 أو DCFH-DA فحص على التوالي)، في 100 ميكرولتر من وسائط النمو المناسب، والسماح لوحة للجلوس على سطح مستو عند 37 درجة مئوية، 5 ٪ CO 2 (أو أيا كان الظروف المناسبة لنوع خلية معينة) لا يقل عن 24 ساعة للسماح الالتزام الخلية.
- خلايا الثقافة في وسائل الاعلام النمو في مناسبة 96 صواني جيدا حتى تكون 70-80٪ متموجة (24H لPC12 والخلايا rMC1، 48H لخلايا الشبكية مختلطة).
3. إضافة الغلوتامات الضغوطات إلى خلايا
- إعداد أحادية الصوديوم حمض تركيزات هيدرات الملح الضغوطات-L الجلوتاميك من 0-10mM في تنمو الكامل المناسبعشر وسائل الإعلام الثقافة.
- إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وغسل بلطف الخلايا 3 مرات مع PBS (PC12) أو HBSS (rMC1 وخلايا الشبكية مختلطة). يغسل بعد، إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على الغلوتامات إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد.
4. الأولى جرعات من العلاج الخفيفة
- فور إضافة الغلوتامات أو الإجهاد في الاختيار، وفضح الخلايا لعلاج الضوء على موجات المطلوب وشدة عن طريق وضع تحت جهاز استعداد تسليم النور. تأكد من تغيير المخرجات كمي من شعاع ضوء باستخدام تركيبات الثابتة للمرشحات الكثافة محايدة اعتمادا على الطول الموجي تدار.
ملاحظة: في التجارب الحالية، وتعريض الخلايا لعلاج الخفيفة لمدة 3 دقائق حفاظ على درجة الحرارة التي يستريح لوحات جيدا 96 على 37 درجة سادة C الحرارة. يجوز تغيير وقت العلاج على النحو المطلوب.- وضع بطاقة سوداء ماتي تحت الخلايا لمنع الضوء المنعكس في الآبار المجاورة في-96 أهلا وسهلال علبة المخصصة لمعلمات العلاج الأخرى.
- إذا كان المطلوب العلاج لفترات أطول من الوقت، إضافة عازلة 25MM HEPES للحفاظ على درجة الحموضة وسائل الإعلام ثقافة الخلية أو من الناحية المثالية، ووضع لوحات الأجهزة والعلاج داخل حاضنة مع CO 2 تركيز ينظم إلى 5٪ CO 2، أو الظروف التي هي الأمثل لنوع خلية معينة.
- وبعد الانتهاء من العلاج الخفيفة، ووضع الخلايا على سطح مستو واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (أو أيا كان الظروف المثالية للنوع من الخلايا) ل24H.
ملاحظة: يمكن أن تدار جرعات إضافية من R / NIR-LT كما هو موضح أعلاه، كما تريد.
5. النهائي جرعة من العلاج الضوء والكشف عن ROS
- قبل تنفيذ الجولة الاخيرة من العلاج الخفيفة، وإعداد الكواشف لاستخدامها للكشف عن ROS. إعداد 50MM عازلة سيترات (pH6.0)، تريتون X100، وH 2 O 2 كشف كاشف العمل(نسبة 97 من 10MM H 2 O 2 الكشف عن حل الأسهم كاشف، و 10 U / مل البيروكسيديز الفجل، 50MM سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0) 1: 2) حل. إعداد DCFH-DA بتركيز نهائي من 100μM في وسائل الإعلام المناسبة.
ملاحظة: DCFH-DA كاشف للخلايا PC12 في وسائل الإعلام RPMI، DCFH-DA كاشف للخلايا rMC1 هو في وسائل الاعلام DMEM. لاحظ أن الكواشف كشف المتاحة تجاريا لها الحساسيات التفاضلية لROS محددة ويجب اختيارها بعناية الكواشف لتوفير المعلومات المطلوبة لتطبيق الفردية. - إدارة العلاج الخفيفة إلى الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 4.1-4.1.2. يعالجون ضمان الخلايا مع المطلوب fluences / الأطوال الموجية للضوء.
- فورا بعد العلاج الخفيفة، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الغلوتامات ويغسل مرتين مع حل العازلة المناسب (للخلايا PC12، ويستخدم برنامج تلفزيوني وللخلايا rMC1، ويستخدم HBSS). إجراء فحوصات ROS على الخلايا على النحو التالي:
- H 2 O 2 2 لمدة 15 دقيقة. إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O 2 حل العاملة الكشف واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. قياس مضان باستخدام قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 530nm الطول الموجي وانبعاث 480nm.
- DCF الفحص: إضافة 100 ميكرولتر من حل 100 ميكرومتر من DCFH-DA إلى كل من الآبار واحتضان لمدة 30min في في 37 ° C وCO 2 5٪. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على 100 ميكرومتر DCFH-DA، ويغسل مع حل العازلة المناسب (كما هو موضح أعلاه) مرتين. إضافة 90 ميكرولتر من حل العازلة و 10 ميكرولتر تريتون X100 إلى كل من الآبار ويهز بلطف على شاكر المداري لمدة 30 ثانية قبل 15 دقيقة الحضانة عند 37 درجة مئوية. قياس DCF مضان المستمدة باستخدام قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 480nm ويفل الانبعاثاتength من 530nm.
- صريحة ROS تقدر نسبة إلى تركيز البروتين من الخلايا المتبقية في الآبار، وذلك باستخدام مجموعة اللونية لقياس تركيز البروتين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع الإشارة إلى منحنى القياسية لحساب ملغم بروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم معايرة إخراج ضوء ألقاها في طول موجة من 670nm باستخدام مرشحات الكثافة محايدة من أجل أشرق الخلايا مع مجموعة من fluences تشمل جرعة من الضوء 670nm هو موضح سابقا أن تكون مفيدة في الجسم الحي (0.3 J / سم 2) 20. حيث بلغ عدد مرشحات الكثافة محايدة أمام مصدر الضوء زيادة، وشدة (W / م 2) انخفضت، مما يسمح أقل ضوء بالمرور إلى المنطقة المستهدفة. ويعرض الجدول 1 بيانات المعايرة الضوء 670nm المولدة من مصدر الضوء مزودة مرشح الطول الموجي ويتضمن عدد من المرشحات ND المستخدمة وشدة الضوء ولدت نتيجة لذلك، على مسافات وصف من إخراج الضوء. فلوينس، أو جرعة من الضوء 670nm (J / سم 2)، تم حسابها من المعادلة: [الجرعة (J / سم 2) = (شدة الضوء (W / م 2) / 10،000) س الوقت (ق)]، حيث كان الوقت من العلاج 180S.
| عدد من المرشحات ND | المسافة من ناتج الضوء (سم) | كثافة (W / م ^ 2) | جرعة (J / سم ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0.38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0.19 |
| 1 | 14 | 4.91 | 0.075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0.041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0.018 |
| 4 | 14 | 0.47 | 0.0085 |
| 5 | 14 | 0.21 | 0.0038 |
| 6 | 14 | 0.094 | 0.00169 |
| 7 | 14 | 0.045 | 0.00081 |
| 8 | 14 | 0.021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0.013 | 0.000234 |
ويشير الناتج من جهاز تسليم خفيفة مزودة مرشح 670nm الطول الموجي .Number من المرشحات ND إلى عدد من مرشحات الكثافة محايدة تركيبها على الجزء الأمامي من الناتج مصدر الضوء: الجدول 1. كثافة (W / م 2) يشير إلى شدة الضوء كما ذكرت من قبل عشرالبريد ملاءمة البرمجيات. تم حساب فلوينس، أو جرعة من المعادلة [الجرعة (J / سم 2) = (شدة الضوء (W / م 2) / 10،000) س الوقت (ق)]، حيث كان وقت التعرض 180S والمسافة من ناتج الضوء كان 10.5 أو 14 سم.
وقد تم اختيار اثنين من fluences كمي ذات الصلة سريريا من الضوء للتحقيق في الآثار التفاضلية للR / NIR-LT الطول الموجي على إنتاج ROS. والجرعة التي يمكن أن تصل إلى مساحات CNS التالية انتقال العدوى عن طريق الأنسجة المغطي باستخدام أجهزة LED (أي 1.78 واط / م 2 في 670nm) 20 مساواته إلى 0.03 J / سم 2 للعلاج 3 دقائق، أو 4.9 × 10 14 الفوتونات / سم 2 / الصورة. مصدر الضوء مزودة بمرشحات ليؤدي إلى انبعاث 442، 550، 670 أو بعد ذلك معايرة 830nm باستخدام مزيج من مرشحات الكثافة محايدة لتنبعث منها مخرجات كمي متساوية (الفوتونات) لكل طول موجي وليس على النتائج الطاقة (J / سم 2)، وجرعات (J / سم 2) والأسواق العالمية ضغطهاnsities في W / م 2 المحسوبة (الجدول 2A). جرعة إضافية العليا التي كانت في إطار المبادئ التوجيهية الموصى بها لتحفيز النشاط الخلوي 21 كانت تستخدم أيضا (1.29 × 10 15 الفوتونات / سم 2 / ث)، والمعايرة التي أجريت لكل طول موجي (الجدول 2B).
| الطول الموجي (λ) | جرعة (J / سم ^ 2) | كثافة (W / م ^ 2) | الانبعاثات (الفوتونات / سم ^ 2 / ث) |
| 442 | 0.057 | 3.21 | 4.8 × 10 ^ 14 |
| 550 | 0.051 | 2.87 | 5.0 × 10 ^ 14 |
| 670 | 0.032 | 1.78 | 4.9 × 10 ^ 14 |
| 830 | 0.018 | 1.01 | 4.9 س10 ^ 14 |
الجدول 2: معايرة شدة الجرعة التي ألقاها أعداد متساوية من فوتونات الضوء بأطوال موجية مختلفة الكثافة (W / م 2)، جرعة للعلاج 3 دقيقة (J / سم 2) والانبعاثات (الفوتونات / سم 2 / ث) عندما يتم معايرة إخراج ضوء زينون انبعاث 442، 550، 670 و 830nm لتنبعث منها A) 4.9 × 10 14 الفوتونات / سم 2 / ثانية أو B) 1.3 × 10 15 الفوتونات / سم 2 / ث على مسافة 14 سم من ناتج الضوء.
من أجل تقييم ما إذا كان ضوء تسليمها من قبل جهاز سامة للخلايا في الجرعات المستخدمة، قمنا بتقييم محتوى البروتين المتبقية في PC12 الآبار ثقافة الخلية التالية المقايسات ROS، وذلك باستخدام بروتين فحص اللونية. لم يكن هناك خسارة كبيرة من البروتين في أي من جرعات أعلى من الناتج ضوء (P> 0.05)، مشيرا إلى أن جرعة من الضوء تسليمها لم يسبب موت الخلايا (شملت رقمه 2) وغير مناسبة لاستخدامها لتقييم الأيض المؤكسدة.
الشكل 2: تأثير جرعات متفاوتة من الضوء على تركيز البروتين الكلي المتبقية في الآبار ثقافة التالية R / NIR-LT وROS الفحص. الحانات الرسم البياني هي متوسط ± تركيزات البروتين SEM في الآبار زراعة الخلايا PC12، 6 مكررات / التركيز، وتكررت التجارب 3 مرات. لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين السيطرة وأي من مجموعات العلاج على النحو الذي يحدده تحليل التباين (ANOVA)، P> 0.05.
في البداية قمنا بتقييم آثار ضوء 670nm، ألقاها في fluences تتراوح ،0085-0،38 J / سم 2، على سبيل المثال الطول الموجي لتقييم مدى ملاءمتها لجهاز تسليم خفيفة. لا EFF كبيروقد لوحظ إلخ الضوء 670nm في أي من fluences اختبارها عند تقييم إما H 2 O 2 أو DCF مضان في PC12، rMC1 أو خلايا الشبكية مختلطة أكد مع الغلوتامات (الشكل 3، P> 0.05). وبالمثل، لم تكن هناك آثار كبيرة من الأطوال الموجية من R تسليمها / NIR-LT عند 4.9 × 10 14 الفوتونات / سم 2 / ثانية أو 1.3 × 10 15 الفوتونات / سم 2 / ث على الإنتاج ROS، متفاوتة عند تقييم H 2 O 2 أو DCF مضان (P> 0.05، لا تظهر البيانات). تأكيد لدينا القدرة على اكتشاف التغيرات في الأنواع رد الفعل زيادة في مضان من صبغ رد الفعل DCFH-DA في 13.44 ± 0.67 ملم الغلوتامات إلى 22.10 ± 2.10 في 10MM الغلوتامات. في حين أن بيانات دينا لا تكشف عن الآثار الإيجابية لR / NIR-LT يقدم باستخدام جهاز لدينا تسليم الضوء على إنتاج ROS في النظام نموذج المحدد، ولا كانت هناك آثار سلبية الخلايا لم تكن للخطر، يتبين من محتوى البروتين المستمر في ثقافةالآبار التالية العلاج بالضوء (الشكل 2). على هذا النحو، ويوفر الطريقة الموصوفة بروتوكول لعلاج الخلايا أو الميتوكوندريا مع جرعة محددة من الفوتونات في مجموعة واسعة من الأطوال الموجية، ويمكن استخدامه لتقييم جرعات أعلى ومقاييس النتائج البديلة، والتي قد تمكن الاستفادة المثلى من المعلمات R / NIR-LT.
الشكل (3): الكمي لH 2 O 2 (AC) وDCF (DF) مضان في PC12 (A، D)، rMC1 (B، E) أو خلايا شبكية المختلطة (C، F) الثقافات في وجود 10MM الغلوتامات الضغوطات، بعد العلاج بالإشعاع 670nm بجرعات تتراوح فلوينس 0-،38 J / سم 2. الحانات الرسم البياني تمثل البروتين متوسط وحدات مضان التعسفية / ميكروغرام ± SEM. لم تكن هناك دلالة إحصائيةالاختلافات بين السيطرة وأي من مجموعات العلاج على النحو الذي يحدده ANOVA، ص> 0.05، 6 تكرارات لكل مجموعة، وتكررت التجارب 3 مرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد تكيفت بنجاح نظام تسليم ضوء دقيقة ومحسوبة لتوفير آلية لدراسة تعظيم الاستفادة من R / NIR-LT في المختبر. الطول الموجي وشدة معالم R / NIR-LT قادرين على معالجته بدقة وفاعلية استخدام هذا النظام. أنشأنا أن العلاج الخفيفة من الخلايا لم تؤدي إلى موت الخلايا، على الرغم من ROS لم انخفاض في الأطوال الموجية وجرعات تسليمها، في أنواع الخلايا التي تم اختبارها. الحد الأقصى للكثافة من قبل النظام الحالي الذي تحقق في 670nm (20.11W / م 2) هي التي تزيد من التدابير التي تم نشرها مسبقا من انتفاذ التشعيع في الدماغ الفئران، حيث بلغ 1.17 واط / م 2 السطح البطني للعصب البصري و0.3W / م 2 وصلت إلى السطح البطني للقضية الدماغ. عندما سلمت لمدة 30 دقيقة، والجرعة التي يتلقاها خلايا العصب البصري في الجسم الحي هو بالتالي ،054-0،31 J / سم 2. جرعات من الضوء 670nm تسليمها في الدراسة الحالية (حتى 0.38J / سم 2) ولذا تشمل تلك الخلايا تلقى في دراساتنا السابقة في الجسم الحي.
نظرية الأكثر قبولا على نطاق واسع R / NIR-LT فعالية هي أن نظام يستند photoacceptor 18، وبالتالي فإنه لا بد من التأكد من أن الخلايا المعالجة مع موجات متفاوتة تتلقى fluences كمي متساوية من الضوء (الفوتونات / سم 2 / ث) 8. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الوقت التعرض المستخدمة لتقديم فلوينس معين من الضوء يجب أن تبقى متناسقة بين العلاجات، فقط مع شدة الضوء المتغيرة لزيادة وخفض إجمالي فلوينس مع مرور الوقت. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن تغيير وقت التعرض لتحقيق نتائج fluences متساوية في الاختلافات في مقاييس النتائج ويمكن أن يكون بمثابة عامل التباس، وتعيق التعرف على أفضل المعلمات الطول الموجي / فلوينس المطلوبة لنموذج معين إصابة 22،23. على هذا النحو، فإننا نوصي معايرة دقيقة للجرعةفي كل الطول الموجي اختبار، لضمان الاستفادة المثلى من المفيد R / NIR-LT.
تقنية الموضحة تتيح إيصال الضوء إلى مجموعة من الأنظمة نموذج في المختبر بما في ذلك الثقافات شريحة عضوي النمط، مما قد يؤدي إلى نتائج أكثر وضوحا بسبب الحفاظ على العمارة الخلوية والتفاعلات بين الخلوية المعقدة. قد تتطلب الاختلافات على نموذج إصابة الاختلافات في المعلمات علاج R / NIR-LT. وهذه التقنية محدودة بسبب أقصى انتاج الطاقة للتحقيق مع الأجهزة وصفها. قد تكون هناك حاجة مخرجات أعلى سلطة لبعض في المختبر، ومعظم التطبيقات في الجسم الحي. إذا كانت هناك حاجة مخرجات أعلى من الضوء، قد يكون تغيير الجهاز لزيادة شدة الضوء الوصول إلى العينات. سوف تقصير المسافة بين الخلايا إنهاء والهدف الخفيفة زيادة شدة الضوء الوصول إلى لوحة. بدلا من ذلك، وعلى ضوء قد ينعكس قبالة مرآة وعلى الخلايا كما ممن لهمالحوار الاقتصادي الاستراتيجي ليتم تصفيتها من خلال دليل ضوء السائل، ولكن سوف تكون هناك حاجة الطول الموجي البديل ومرشحات الكثافة محايدة لتحقيق ذلك. من شأنه أيضا أن تكون هناك حاجة مخرجات أعلى باستخدام مصدر ضوء أكثر قوة إذا ما تم تكييفها لطريقة لتسليم R / NIR-LT في الجسم الحي في نماذج من إصابة الجهاز العصبي المركزي، نظرا لزيادة الجرعات المطلوبة لضمان انتفاذ الفعال للتشعيع 8،20 .
في الختام، تصف الدراسة الحالية طريقة جديدة لتسليم الضوء الذي يوفر وسيلة لتغيير فعال كثافة والطول الموجي للضوء المعلمات في الدراسات R / NIR-LT. وهذه المنهجية أن تكون مفيدة في تعظيم الاستفادة من R / NIR-LT توظيف مجموعة من التدابير نتائج ونماذج إصابة المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
