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Biology

तरंगदैर्ध्य और oxidative तनाव पर लाल / अवरक्त के पास लाइट थेरेपी की तीव्रता का एक रेंज के प्रभाव का आकलन करने के लिए विधि Published: March 21, 2015 doi: 10.3791/52221
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3, 1
1Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Animal Biology, The University of Western Australia, 2School of Animal Biology and The Oceans Institute, The University of Western Australia, 3Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Anatomy, Physiology and Human Biology, The University of Western Australia

Abstract

लेजर या प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) द्वारा वितरित लाल / लगभग अवरक्त प्रकाश चिकित्सा (आर / NIR के एलटी), संभवतः oxidative तनाव को कम करने से vivo में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र चोटों की एक श्रृंखला में कार्यात्मक और रूपात्मक परिणामों में सुधार। हालांकि, oxidative तनाव पर आर / NIR के लेफ्टिनेंट के प्रभाव तरंगदैर्ध्य या विकिरण की तीव्रता के आधार पर भिन्न करने के लिए दिखाया गया है। इलाज के मापदंडों की तुलना अध्ययन की वजह से इन विट्रो अनुकूलन अध्ययन में डाल के माध्यम से उच्च लिए उपयुक्त कई तरंग दैर्ध्य या तीव्रता, उद्धार कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों के अभाव में, कमी कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल एक दिया चोट मॉडल के लिए आवश्यक चिकित्सीय खुराक अनुकूलन करने के लिए तरंग दैर्ध्य और तीव्रता के एक रेंज में प्रकाश की डिलीवरी के लिए एक तकनीक का वर्णन है। हम तरंगदैर्ध्य और तीव्रता मापदंडों आसानी से बदला जा सकता है, जिसमें प्रकाश वितरित की एक विधि है, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को कम करने के लिए आर / NIR के एलटी की एक इष्टतम खुराक के निर्धारण की सुविधा सकता धारणा है किइन विट्रो में (आरओएस)।

गैर संसक्त क्सीनन प्रकाश बदलती तरंग दैर्ध्य (440, 550, 670 के केंद्र और तरंग दैर्ध्य 810nm) और fluences देने के लिए संकीर्ण बैंड हस्तक्षेप फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड किया गया था (8.5 एक्स 10 -3 3.8 एक्स 10 -1 जम्मू / 2 सेमी) प्रकाश की संवर्धित कोशिकाओं को। तंत्र से लाइट आउटपुट प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में प्रकाश की चिकित्सा के लिए प्रासंगिक, बराबर quantal खुराक फेंकना करने के लिए calibrated किया गया था। ग्लूटामेट DCFH-डीए और एच 2 ओ 2 संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग, प्रकाश के साथ इलाज किया कोशिकाओं पर बल दिया में प्रतिक्रियाशील प्रजातियों का पता लगाया गया।

हम सफलतापूर्वक सीएनएस चोट की एक मॉडल के रूप में ग्लूटामेट उजागर करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं को, प्रासंगिक और तरंग दैर्ध्य तीव्रता physiologically और उपचारात्मक की एक श्रृंखला पर प्रकाश दिया। संवर्धित कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न आरओएस पर असर डालती नहीं था वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल आर / NIR के एलटी की fluences, वहीं प्रकाश प्रसव की विधि अन्य syst के लिए लागू हैईएमएस अधिक physiologically माइटोकॉन्ड्रिया या प्रासंगिक organotypic टुकड़ा संस्कृति मॉडल पृथक सहित, और ऑक्सीडेटिव चयापचय के परिणाम के उपायों की एक श्रृंखला पर प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) संकेत पारगमन रास्ते और neuroprotection एक के उन सहित सेलुलर चयापचय के सामान्य प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के लिए आवश्यक हैं। अंतर्जात एंटीऑक्सीडेंट तंत्र आरओएस के उत्पादन को नियंत्रित करने में असमर्थ हैं, हालांकि, जब कोशिकाओं oxidative तनाव 2,3 का शिकार हो सकता है। सीएनएस को चोट के बाद, आरओएस और oxidative तनाव की उपस्थिति में जुड़े बढ़ जाती क्षति 4,5 की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका अदा करने के लिए लगा रहे हैं। मूल्यांकन किया गया है कि oxidative तनाव attenuating के लिए रणनीति की व्यापक संख्या के बावजूद, neurotrauma 6 निम्न नैदानिक ​​प्रयोग में आरओएस उत्पादन और संबद्ध oxidative तनाव attenuating के लिए कोई पूरी तरह से प्रभावी, नैदानिक ​​प्रासंगिक एंटी ऑक्सीडेंट रणनीतियों वर्तमान में कर रहे हैं। इसलिए oxidative तनाव की क्षीणन चिकित्सकीय हस्तक्षेप 7 के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य रहता है।

सुधार का पालन करेंआईएनजी आर / NIR के लेफ्टिनेंट चोटों और शायद oxidative तनाव को कम करने से cardial रोधगलितांश आकार, मधुमेह के दौरान गुर्दे और यकृत जटिलताओं, रेटिना अध: पतन, सीएनएस चोट और स्ट्रोक 8 में कटौती, सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में सूचना दी गई है। सीएनएस चोट करने के लिए विशेष रूप से संबंध के साथ, 670nm प्रकाश की प्रभावकारिता के preclinical अध्ययन रेटिना अध: पतन 9-11, रीढ़ की हड्डी में चोट के 12, neuronal मौत 13 साल की मॉडल में अच्छा प्रभाव दिखाया है। क्लिनिकल परीक्षण हालांकि इन परीक्षणों के परिणाम 15 पैरामीटर प्रभावी उपचार को रोजगार के लिए शायद कारण एक विफलता के लिए, होनहार दिखाई नहीं देते, धब्बेदार अध: पतन संबंधित सूखी उम्र के लिए आयोजित की जाती है और स्ट्रोक 14 के लिए वर्तमान में चल रही किया गया है। जैसे, आर / NIR के लेफ्टिनेंट व्यापक रूप से एक गैर इनवेसिव, प्रशासन के लिए आसान है और अपेक्षाकृत सस्ती इलाज होने के बावजूद, neurotrauma में सामान्य नैदानिक ​​अभ्यास के हिस्से के रूप में अपनाया नहीं गया है। नैदानिक ​​अनुवाद के लिए बाधाओं को एक सीएल की कमी शामिलजल्दी एक मानकीकृत प्रभावी उपचार प्रोटोकॉल 16,17 की कार्रवाई और अभाव के तंत्र को समझा। प्रकाश चिकित्सा के संबंध में वर्तमान साहित्य विकिरण स्रोतों के संबंध में (एलईडी या लेजर), तरंग दैर्ध्य (जैसे, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), विकिरण की कुल खुराक (जूल / के साथ इलाज के मापदंडों में बदलाव के ढेर सारे पता चलता है इकाई क्षेत्र), अवधि (जोखिम समय), समय (पूर्व या बाद के अपमान), उपचार आवृत्ति और प्रसव के मोड () पल्स या लगातार 8। पढ़ाई के बीच इलाज के मानकों में परिवर्तनशीलता तुलना कठिन बना देता है और प्रभावकारिता 16 के बारे में संदेह करने के लिए योगदान दिया है।

इसलिए, आर / NIR के लेफ्टिनेंट के अनुकूलन स्पष्ट रूप से कई चर तुलना करने के लिए आवश्यक उच्च throughput स्क्रीनिंग तंत्र प्रदान करने में सक्षम सेल संस्कृति प्रणालियों के साथ, आवश्यक है। हालांकि वा अधिक पर्याप्त लचीलापन और नियंत्रण प्रदान कर सकते हैं कि कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोशनी व्यवस्था कर रहे हैंvelength और तीव्रता ऐसे अनुकूलन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलईडी उपकरणों आम तौर पर तीव्रता में न केवल अलग-अलग हो सकता है, जो विभिन्न निर्माताओं से कई एलईडी उपकरणों को रोजगार जांचकर्ताओं में जिसके परिणामस्वरूप कई तरंग दैर्ध्य या तीव्रता, उद्धार करने में सक्षम है, लेकिन यह भी उत्सर्जित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के स्पेक्ट्रम नहीं हैं। हम जिससे आर / NIR के लेफ्टिनेंट के मापदंडों के करीब है, सटीक नियंत्रण की अनुमति, तरंग दैर्ध्य और प्रकाश की fluences की एक श्रृंखला पैदा करने, नैरोबैंड हस्तक्षेप फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड एक ब्रॉडबैंड क्सीनन प्रकाश स्रोत को रोजगार से इस मुद्दे को संबोधित किया।

यह उपचार के चिकित्सीय खुराक आर / NIR के लेफ्टिनेंट के मामले में साइटोक्रोम ग ओक्सीडेस (कॉक्स) 18 होने की माने है, जो photoacceptor (क्रोमोफोर), के साथ बातचीत फोटॉनों की संख्या से परिभाषित किया गया है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। वितरित फोटॉन ऊर्जा तरंग दैर्ध्य के साथ बदलता रहता है; विभिन्न तरंगदैर्य पर ऊर्जा के बराबर खुराक अर्थ कॉम हो जाएगाफोटॉनों की अलग नंबरों की बेशकीमती। इसलिए, युक्ति से उत्सर्जित प्रकाश का परीक्षण किया जा करने के लिए चुना तरंग दैर्ध्य में से प्रत्येक के लिए फोटॉनों की संख्या बराबर फेंकना करने के लिए calibrated किया गया था। हम इन विट्रो में कोशिकाओं को तरंग दैर्ध्य और तीव्रता की एक सीमा पर आर / NIR के लेफ्टिनेंट देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक ऐसी प्रणाली विकसित की है और के अधीन कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन पर दिया आर / NIR के लेफ्टिनेंट के प्रभाव को मापने की क्षमता का प्रदर्शन किया है ग्लूटामेट तनाव।

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Protocol

1. ऑप्टिकल कैलिब्रेशन: माप प्रकाश उत्पादन

  1. प्रकाश वितरण तंत्र को तैयार करने के लिए, एक ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोत से कनेक्ट (उदाहरण के लिए, क्सीनन या टंगस्टन दीपक) एक उपयुक्त बिजली की आपूर्ति करने के लिए। प्रकाश की एक collimated बीम का उत्पादन करने के लिए प्रकाश स्रोत के सामने एक collimating लेंस स्थिति। प्रकाश किरण से गर्मी से अधिकांश को दूर करने के लिए एक तरल गर्मी फिल्टर के माध्यम से प्रकाश से गुजरती हैं। आवेदन के आधार पर, प्रकाश की अधिक लचीला वितरण (जैसे।, एक मशीन में) के लिए प्रदान करता है जो एक तरल प्रकाश गाइड के प्रवेश द्वार एपर्चर, पर collimated बीम ध्यान केंद्रित।
  2. तरल प्रकाश गाइड के दूसरे छोर पर, एक दूसरे collimating लेंस और फिर हस्तक्षेप और तटस्थ घनत्व फिल्टर के लिए एक धारक की स्थिति। इस व्यवस्था के वांछित waveband और तीव्रता के प्रकाश की एक समान रूप से प्रबुद्ध मौके पैदा करता है कि जाँच करें।
    नोट: प्रकाश गाइड और नमूना विमान के अंत के बीच दूरी के आधार पर भिन्न करने की आवश्यकता हो सकती हैप्रबुद्ध, लेकिन जाना चाहिए कि क्षेत्र प्रकाश गाइड बढ़ जाती है के अंत से दूरी के रूप में, प्रकाश की तीव्रता में कमी होगी कि याद है। वर्तमान अध्ययन में, इस दूरी 14cm है ​​और समान रूप से एक 96 अच्छी तरह से थाली पर एक 3x3 अच्छी तरह से क्षेत्र illuminates कि एक किरण पार अनुभाग पैदा करता है।
  3. दीपक ऑप्टिकल और संबंधित घटकों से उस आवारा प्रकाश सुनिश्चित नमूना तक पहुँचने में असमर्थ है।
  4. तरल गर्मी फिल्टर करने के लिए वाटर कूलर चालू करें और फिल्टर जैकेट के माध्यम से पानी का आदान-प्रदान होता है सुनिश्चित करते हैं। दीपक शक्ति के स्रोत पर मुड़ें और स्थिर करने के लिए ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोत के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। नोट: वाटर कूलर का उपयोग डिवाइस की ओवर-हीटिंग को रोकने के लिए आवश्यक है।
  5. रोशनी के वांछित waveband उत्पन्न करने के लिए (आमतौर पर आधा अधिकतम (FWHM) बैंडविड्थ पर उनके केंद्र तरंगदैर्ध्य, शिखर संप्रेषण और पूरी चौड़ाई द्वारा वर्णित) एक नैरोबैंड हस्तक्षेप फिल्टर का चयन करें। नोट: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल नैरोबैंड हस्तक्षेप फिल्टर 4 थे42 एनएम, 550 एनएम, 671 एनएम और 810 एनएम।
  6. नमूना इलाज के दौरान तैनात किया जा रहा है, जहां विमान में दीपक द्वारा उत्पादित प्रकाश उपाय। निर्माता के निर्देशों के अनुसार औचित्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एक उपयुक्त Spectroradiometer से जुड़ा एक calibrated विकिरण जांच (कोज्या कलेक्टर) का उपयोग करते हुए प्रकाश उपाय।
  7. वांछित उत्पादन प्राप्त किया जाता है जब तक प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करने के लिए तटस्थ घनत्व फिल्टर का प्रयोग करें। नोट: वर्तमान अध्ययन में, प्रत्येक हस्तक्षेप फिल्टर द्वारा पारित प्रकाश की तीव्रता चार उपचार wavebands में से प्रत्येक में एक समान quantal उत्पादन देने के लिए निकाला जाता है। यह दीपक उत्पादन में परिवर्तन के अधीन है, के रूप में नियमित रूप से अंशांकन जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    नोट: तंत्र की स्थापना के बाद, कोशिकाओं प्रबुद्ध होने के लिए तैयार कर रहे हैं एक वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल प्रकाश वितरण तंत्र का प्रतिनिधित्व है चित्रा।।

चित्र 1

प्रकाश वितरण तंत्र। इलस्ट्रेटेड के चित्रा 1. छवि प्रकाश शक्ति का स्रोत है, आवास, collimating लेंस, पानी फिल्टर, प्रवेश द्वार एपर्चर, तरल प्रकाश गाइड, दूसरा collimating लेंस, फिल्टर धारक, उपचार फ्रेम और मैट काले कार्ड के साथ क्सीनन दीपक हैं। नैरोबैंड तरंगदैर्ध्य और तीव्रता फिल्टर नहीं दिखाया जाता है कि ध्यान दें।

2. सेल तैयार

  1. वर्णित आर / NIR के लेफ्टिनेंट वितरण पद्धति किसी भी प्रकार की कोशिका करने के लिए या इन विट्रो मॉडल प्रणाली में लागू किया जा सकता है; सेल संस्कृति के ऐसे निम्न विवरण संस्कृति फीयोक्रोमोसाइटोमा (PC12), मुलर (rMC1) और प्राथमिक मिश्रित रेटिना की कोशिकाओं को अच्छी तरह से स्थापित की तकनीक का उपयोग, सामान्य हैं।
  2. प्रकाश उपचार और oxidative तनाव परख के लिए सेल बोने से पहले, संस्कृति T75 Flas में उचित आपूर्ति करता है (उदाहरण के लिए।, FBS के, एंटीबायोटिक दवाओं) युक्त उनके संबंधित विकास मीडिया में कोशिकाओं अमर70-80% मिला हुआ जब तक एस।
  3. उदाहरण के लिए परीक्षण किया जा सेल प्रकार के लिए उपयुक्त विधि का उपयोग कर, T75 बोतल से अमर कोशिकाओं को अलग करें।, ट्रिप्सिन। यदि आवश्यक हो, 96 अच्छी तरह से परख प्लेटों में कोशिकाओं के बोने के साथ आगे बढ़ने से पहले, कोट परख प्लेट (PC12 कोशिकाओं के लिए जैसे।) 1 के लिए 10μg / एमएल पाली एल Lysine के साथ कुओं या 10μg / एमएल पाली एल Lysine के लिए 10μg साथ एक हे / एन ऊष्मायन द्वारा पीछा 1H / एमएल laminin (जैसे।, मिश्रित रेटिना की कोशिकाओं के लिए)।
  4. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (उदा।, PC12 कोशिकाओं के लिए 405 XG या rMC1 कोशिकाओं के लिए 218 XG पर 10 मिनट में 3 मिनट) के रूप में उपयुक्त एकत्र करने के लिए, उपयुक्त सेल संस्कृति मीडिया के 8 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend हटा दें।
  5. मिश्रित रेटिना की कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं, स्थापित प्रक्रियाओं 19 के अनुसार enzymatic पाचन (papain) द्वारा P0-5 नवजात चूहे पिल्ले से तैयार करते हैं
  6. एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग करते हुए, 0.4% (w / v) trypan नीले डाई छोड़कर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना।
  7. सेल घनत्व सफलता को समायोजित करेंकोशिकाओं संस्कृति में 24 या 48h के बाद लगभग 70-80% मिला हुआ होगा कि एच। (PC12 कोशिकाओं के लिए बोने घनत्व rMC1 कोशिकाओं के लिए, यह 2.5 एक्स 10 5 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल है और मिश्रित रेटिना की कोशिकाओं के लिए यह 8 एक्स 10 5 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल है, 4.0 एक्स 10 5 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल) है। कोशिकाओं को जोड़ने के बाद या तो उचित विकास मीडिया के 100 μl में, (एच 2 ओ 2 या DCFH-डीए परख क्रमशः के लिए प्रयोग किया जाता) स्पष्ट या काले 96 अच्छी तरह प्लेटें, थाली 37 डिग्री सेल्सियस, 5 में एक फ्लैट सतह पर बैठने के लिए अनुमति देने के लिए % सीओ 2 के सेल पालन अनुमति देने के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए (या जो भी शर्तों के विशेष सेल प्रकार के लिए उपयुक्त हैं)।
  8. उचित 96 अच्छी तरह से ट्रे में विकास मीडिया में संस्कृति कोशिकाओं वे 70-80% मिला हुआ (PC12 और rMC1 कोशिकाओं के लिए 24 घंटों का, मिश्रित रेटिना की कोशिकाओं के लिए 48h) कर रहे हैं जब तक।

3. कोशिकाओं को ग्लूटामेट stressor जोड़ना

  1. उपयुक्त पूर्ण बढ़ने में 0-10mM के एल glutamic एसिड मोनोसोडियम नमक हाइड्रेट तनाव सांद्रता तैयार करेंवें संस्कृति मीडिया।
  2. कोशिकाओं से मीडिया निकालें और धीरे पीबीएस (PC12) या HBSS (rMC1 और मिश्रित रेटिना की कोशिकाओं) के साथ कोशिकाओं 3 बार धोएं। Washes के बाद, / अच्छी तरह से 100 μl की कुल मात्रा को ग्लूटामेट युक्त मीडिया जोड़ें।

लाइट उपचार 4. पहले Dosages

  1. इसके तत्काल बाद ग्लूटामेट या पसंद के तनाव के अलावा पर तैयार प्रकाश वितरण तंत्र के तहत रखकर वांछित तरंग दैर्ध्य और तीव्रता पर प्रकाश उपचार के लिए कोशिकाओं को बेनकाब। तरंग दैर्ध्य के आधार पर तटस्थ घनत्व फिल्टर की स्थापना की संयोजनों का उपयोग कर प्रकाश किरण के quantal उत्पादन प्रशासित किया जा रहा परिवर्तन करने के लिए सुनिश्चित करें।
    नोट: वर्तमान प्रयोगों में, 3 मिनट के लिए प्रकाश उपचार के लिए कोशिकाओं का पर्दाफाश एक 37 ओ सी गर्मी पैड पर 96 अच्छी तरह प्लेटें आराम से तापमान बनाए रखें। के रूप में आवश्यक उपचार समय अलग किया जा सकता है।
    1. 96 में wel में आसन्न कुओं में प्रकाश को दर्शाती को रोकने के लिए कोशिकाओं के नीचे एक मैट काले कार्ड की जगहएल ट्रे अन्य उपचार मापदंडों के लिए नामित किया गया।
  2. इलाज के समय की लंबी लंबाई के लिए वांछित है, इष्टतम कर रहे हैं, या शर्तों सेल संस्कृति मीडिया के पीएच बनाए रखने या आदर्श रूप में, 5% सीओ 2 को विनियमित सीओ 2 एकाग्रता के साथ एक मशीन के भीतर उपकरण और उपचार प्लेटें प्लेस करने के लिए 25mm HEPES बफर जोड़ने विशेष सेल प्रकार के लिए।
  3. प्रकाश उपचार के पूरा होने के बाद, एक स्तर की सतह पर कोशिकाओं की जगह और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 सेते 24 घंटों के लिए (या जो भी शर्तों सेल प्रकार के लिए इष्टतम) कर रहे हैं।
    नोट: ऊपर वर्णित के रूप में वांछित के रूप में आर / NIR के लेफ्टिनेंट के अतिरिक्त खुराकों, प्रशासित किया जा सकता है।

आरओएस के लाइट उपचार और जांच की 5. अंतिम खुराक

  1. प्रकाश उपचार के अंतिम दौर प्रदर्शन से पहले, अभिकर्मकों आरओएस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार करते हैं। 2 2 हे पता लगाने अभिकर्मक काम कर 50mm साइट्रेट बफर (pH6.0), ट्राइटन X100, और एच तैयार करेंसमाधान (1: 2: 10mM एच 2 ओ 2 पता लगाने अभिकर्मक शेयर समाधान का 97 अनुपात, 10 यू / एमएल हॉर्सरैडिश peroxidase; 50mm सोडियम साइट्रेट (पीएच 6.0))। उपयुक्त मीडिया में 100μM की एक अंतिम एकाग्रता में DCFH-डीए तैयार करें।
    नोट: PC12 कोशिकाओं के लिए DCFH-डीए अभिकर्मक RPMI मीडिया में है, rMC1 कोशिकाओं के लिए DCFH-डीए अभिकर्मक DMEM मीडिया में है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पता लगाने अभिकर्मकों विशिष्ट आरओएस के लिए अंतर संवेदनशीलता है और अभिकर्मकों एक व्यक्ति आवेदन के लिए वांछित जानकारी प्रदान करने के लिए सावधानी से चुना जाना चाहिए कि ध्यान दें।
  2. कदम 4.1-4.1.2 में वर्णित के रूप में, कोशिकाओं को प्रकाश उपचार प्रशासन। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को प्रकाश के वांछित fluences / तरंग दैर्ध्य के साथ इलाज किया जा रहा है।
  3. इसके तत्काल बाद ग्लूटामेट युक्त मीडिया को दूर करने और उचित समाधान बफर के साथ दो बार धोने, प्रकाश इलाज के बाद (PC12 कोशिकाओं के लिए, पीबीएस प्रयोग किया जाता है और rMC1 कोशिकाओं के लिए, HBSS के लिए किया जाता है)। इस प्रकार के रूप कोशिकाओं पर आरओएस assays के प्रदर्शन:
    1. एच 2 ओ 2 2 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5%। एच के 50 μl 2 2 हे पता लगाने के काम कर समाधान जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। 530nm के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 480nm की एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक प्लेट रीडर का उपयोग प्रतिदीप्ति उपाय।
    2. डीसीएफ परख: कुओं में से प्रत्येक के लिए DCFH-डीए के 100 माइक्रोन समाधान के 100 μl जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30min और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं। 100 माइक्रोन DCFH-डीए युक्त मीडिया निकालें और (ऊपर वर्णित) दो बार उपयुक्त समाधान बफर से धो लें। कुओं में से प्रत्येक के लिए बफर समाधान और 10 μl ट्राइटन X100 के 90 μl जोड़ें और धीरे 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड में 15 से पहले मिनट ऊष्मायन के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर हिला। 480nm के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और एक उत्सर्जन wavel के साथ एक प्लेट रीडर का उपयोग डीसीएफ व्युत्पन्न प्रतिदीप्ति उपाय530nm के ength।
    3. एक्सप्रेस आरओएस मिलीग्राम प्रोटीन की गणना के लिए एक मानक वक्र के संदर्भ के साथ, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन एकाग्रता यों के लिए एक वर्णमिति किट का उपयोग कर, कुओं में शेष कोशिकाओं के प्रोटीन एकाग्रता के सापेक्ष महत्व देता है।

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Representative Results

670nm की तरंग दैर्ध्य पर दिया प्रकाश के उत्पादन में पहले से विवो (0.3 जम्मू / 2 सेमी) 20 में फायदेमंद हो दिखाया 670nm प्रकाश की एक खुराक को शामिल fluences की एक सीमा के साथ कोशिकाओं को चमकाना के क्रम में तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग कर calibrated किया गया था। बढ़ी हुई प्रकाश स्रोत के सामने तटस्थ घनत्व फिल्टर की संख्या के रूप में, तीव्रता (डब्ल्यू / एम 2) कम प्रकाश लक्षित क्षेत्र के लिए पारित करने के लिए अनुमति देता है, कम किया है। तालिका 1 एक तरंग दैर्ध्य फिल्टर के साथ लगे प्रकाश स्रोत से उत्पन्न 670nm प्रकाश की अंशांकन डेटा प्रस्तुत करता है और प्रकाश उत्पादन से वर्णित दूरी पर इस्तेमाल एन डी फिल्टर की संख्या और एक परिणाम के रूप में उत्पन्न प्रकाश की तीव्रता, भी शामिल है। Fluence, या 670nm प्रकाश (जम्मू / 2 सेमी) की खुराक, समीकरण से गणना की गई: [खुराक (जम्मू / 2 सेमी) = (लाइट तीव्रता () एम 2 / डब्ल्यू / 10,000) एक्स समय (एस)], जहां उपचार के समय 180s था।

एनडी फिल्टर्स की संख्या प्रकाश उत्पादन से दूरी (सेमी) तीव्रता (डब्ल्यू / मी ^ 2) खुराक (जम्मू / सेमी ^ 2)
0 10.5 20.11 0.38
0 14 10.55 0.19
1 14 4.91 0.075
2 14 2.28 0.041
3 14 1.03 0.018
4 14 0.47 0.0085
5 14 0.21 0.0038
6 14 0.094 ०.००१६९
7 14 0.045 ०.००,०८१
8 14 0.021 0.000378
9 14 0.013 0.000234

तालिका 1: एन डी फिल्टर का 670nm तरंग दैर्ध्य फिल्टर .Number के साथ लगे प्रकाश वितरण तंत्र के आउटपुट प्रकाश स्रोत उत्पादन के सामने से सज्जित तटस्थ घनत्व फिल्टर की संख्या को दर्शाता है। वें द्वारा रिपोर्ट के रूप में तीव्रता (डब्ल्यू / एम 2) प्रकाश की तीव्रता को संदर्भित करता हैई औचित्य सॉफ्टवेयर। Fluence, या खुराक जोखिम के समय प्रकाश उत्पादन से 180s और दूरी था जहां समीकरण [खुराक (जम्मू / 2 सेमी) = (हल्की तीव्रता (डब्ल्यू / एम 2) / 10,000) एक्स समय (एस)], द्वारा गणना की गई 10.5 या 14 सेमी था।

प्रकाश के दो नैदानिक ​​प्रासंगिक quantal fluences आरओएस के उत्पादन पर आर / NIR के लेफ्टिनेंट तरंगदैर्ध्य का अंतर प्रभाव की जांच के लिए चुने गए हैं। Overlying ऊतक एलईडी उपकरणों का उपयोग कर के माध्यम से संचरण निम्नलिखित सीएनएस इलाकों तक पहुँच सकते हैं कि एक खुराक (यानी, 1.78 डब्ल्यू / 670nm पर एम 2) 20 एक 3 मिनट के इलाज के लिए 0.03 जम्मू / 2 सेमी के बराबर, या 4.9 एक्स 10 से 14 फोटॉनों / 2 सेमी / एस। , फिल्टर के साथ सुसज्जित प्रकाश स्रोत, 442 के उत्सर्जन में 550, 670 परिणाम के लिए या 830nm तो ऊर्जा outputs के लिए विरोध के रूप में प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए (जम्मू / 2 सेमी) बराबर quantal outputs (फोटॉनों) फेंकना करने के लिए तटस्थ घनत्व फिल्टर के संयोजन का उपयोग कर calibrated किया गया था और dosages (जम्मू / 2 सेमी) और inteडब्ल्यू / एम 2 गणना (तालिका 2A) में nsities। की सिफारिश की दिशा निर्देशों के भीतर था कि एक अतिरिक्त उच्च खुराक प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए आयोजित सेलुलर 21 भी (1.29 एक्स 10 से 15 फोटॉनों / 2 सेमी / एस) का इस्तेमाल किया गया था गतिविधि है, और अंशांकन प्रोत्साहित करने के लिए (तालिका 2 बी)।

तरंगदैर्ध्य (λ) खुराक (जम्मू / सेमी ^ 2) तीव्रता (डब्ल्यू / मी ^ 2) एमिशन (फोटॉनों / सेमी ^ 2 / एस)
442 0.057 3.21 4.8 x 10 ^ 14
550 0.051 2.87 5.0 x 10 ^ 14
670 0.032 1.78 4.9 x 10 ^ 14
830 0.018 1.01 4.9 एक्स10 ^ 14

तालिका 2:। बदलती पर तरंग दैर्ध्य प्रकाश की फोटॉनों के बराबर संख्या द्वारा वितरित खुराक की तीव्रता का कैलिब्रेशन तीव्रता (डब्ल्यू / एम 2), एक 3 मिनट के उपचार (जम्मू / 2 सेमी) और उत्सर्जन के लिए खुराक (फोटॉनों / 2 सेमी / एस) 442, 550, 670 और 830nm उत्सर्जक क्सीनन प्रकाश के उत्पादन में से 14 सेमी की दूरी पर) 4.9 एक्स 10 से 14 फोटॉनों / 2 सेमी / एस या बी) 1.3 एक्स 10 से 15 फोटॉनों / 2 सेमी / एस ए फेंकना करने के लिए calibrated हैं जब प्रकाश उत्पादन।

तंत्र द्वारा वितरित प्रकाश इस्तेमाल किया dosages में कोशिकाओं को विषाक्त था कि क्या आकलन करने के लिए, हम एक वर्णमिति प्रोटीन परख का उपयोग कर, आरओएस assays के निम्नलिखित PC12 सेल संस्कृति कुओं में शेष प्रोटीन सामग्री का आकलन किया। प्रकाश (पी> 0.05) के उच्च उत्पादन खुराकों में से किसी में प्रोटीन का कोई महत्वपूर्ण नुकसान (वितरित प्रकाश की खुराक कोशिका मृत्यु के कारण नहीं था कि Figur का संकेत था,ई 2) और ऑक्सीडेटिव चयापचय के आकलन के लिए उपयोग करने के लिए उपयुक्त है।

चित्र 2

चित्रा 2: आर / NIR के लेफ्टिनेंट और आरओएस परख निम्नलिखित संस्कृति कुओं में शेष कुल प्रोटीन एकाग्रता पर प्रकाश की खुराक बदलती का प्रभाव। हिस्टोग्राम सलाखों PC12 सेल संस्कृति कुओं में SEM प्रोटीन सांद्रता ± मतलब कर रहे हैं, 6 प्रतिकृति / एकाग्रता, प्रयोगों तीन बार दोहराया गया। विचरण के विश्लेषण (एनोवा), पी> 0.05 द्वारा निर्धारित नियंत्रण और उपचार समूहों में से किसी के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद थे।

हम शुरू में प्रकाश वितरण तंत्र की उपयुक्तता का आकलन करने के लिए एक उदाहरण के तरंगदैर्ध्य के रूप में, 0,0085 से 0.38 जम्मू / 2 सेमी से लेकर fluences पर दिया 670nm प्रकाश के प्रभाव का मूल्यांकन। कोई महत्वपूर्ण effएच 2 ओ 2 या PC12, rMC1 या मिश्रित रेटिना की कोशिकाओं में डीसीएफ प्रतिदीप्ति ग्लूटामेट (चित्रा 3,> 0.05 पी) के साथ जोर दिया या तो आकलन जब 670nm प्रकाश की ect के परीक्षण किया fluences में से किसी में मनाया गया। इसी तरह, एच 2 ओ 2 का आकलन करते समय / NIR के लेफ्टिनेंट 4.9 एक्स 10 से 14 फोटॉनों पर दिया आर / 2 सेमी / एस या 1.3 एक्स 10 से 15 फोटॉनों / सेमी आरओएस उत्पादन पर 2 / एस, की तरंग दैर्ध्य में परिवर्तन के कोई महत्वपूर्ण प्रभाव वहाँ थे या डीसीएफ प्रतिदीप्ति (पी> 0.05, डेटा नहीं दिखाया गया है)। प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए हमारी क्षमता 10mM ग्लूटामेट पर 22.10 ± 2.10 को 13.44 ± 0.67 मिमी ग्लूटामेट पर DCFH-डीए प्रतिक्रियाशील डाई की प्रतिदीप्ति में वृद्धि के द्वारा पुष्टि की है। हमारे डेटा चयनित मॉडल प्रणाली में आरओएस उत्पादन पर हमारे प्रकाश वितरण तंत्र का उपयोग कर दिया आर / NIR के लेफ्टिनेंट का सकारात्मक प्रभाव का पता चलता है, वहाँ न तो कोशिकाओं संस्कृति में निरंतर प्रोटीन सामग्री ने संकेत दिया, समझौता नहीं किया गया के रूप में नकारात्मक प्रभाव थे नहीं हैप्रकाश चिकित्सा (चित्रा 2) निम्नलिखित कुओं। जैसे, वर्णित विधि तरंग दैर्ध्य की दूरी पर फोटॉनों का एक निर्धारित खुराक के साथ कोशिकाओं या माइटोकॉन्ड्रिया के इलाज के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है और उच्च dosages और आर / NIR के लेफ्टिनेंट मानकों के अनुकूलन के लिए सक्षम हो सकता है, जो वैकल्पिक परिणाम उपायों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्र तीन

चित्रा 3: PC12 (ए, डी) में एच 2 ओ 2 (एसी) और डीसीएफ (लोमो) प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव, rMC1 (बी, ई) या मिश्रित रेटिना सेल (सी, एफ) 10mM ग्लूटामेट तनाव की उपस्थिति में संस्कृतियों, 0.38 जम्मू / सेमी 2 - 0 से लेकर प्रभाव खुराक पर 670nm विकिरण उपचार के बाद। हिस्टोग्राम सलाखों SEM ± मतलब मनमाना प्रतिदीप्ति इकाइयों / माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण रहे थेसमूह प्रति replicates एनोवा, पी> 0.05, 6 द्वारा निर्धारित नियंत्रण और उपचार समूहों में से किसी के बीच मतभेद, प्रयोगों तीन बार दोहराया गया।

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Discussion

हम सफलतापूर्वक आर / NIR के एलटी में इन विट्रो के अनुकूलन के अध्ययन के लिए एक तंत्र प्रदान करने के लिए एक सटीक और calibrated प्रकाश वितरण प्रणाली अनुकूलित है। आर के तरंगदैर्ध्य और तीव्रता मापदंडों / NIR के लेफ्टिनेंट इस प्रणाली का उपयोग सही ढंग से और प्रभावी ढंग से चालाकी से किया जा करने में सक्षम हैं। आरओएस परीक्षण किया प्रकार की कोशिकाओं में, वितरित तरंग दैर्ध्य और खुराक की मात्रा कम नहीं थे, हालांकि हम सेल मौत का कारण नहीं था कोशिकाओं की है कि प्रकाश उपचार की स्थापना की। 670nm (20.11W / 2 मीटर) पर मौजूदा प्रणाली द्वारा हासिल की अधिकतम तीव्रता 1.17 डब्ल्यू / एम 2 ऑप्टिक तंत्रिका और 0.3W के उदर की सतह पर पहुंच गया, जहां चूहे के मस्तिष्क में विकिरण का अंतर्वेधन के पहले प्रकाशित उपायों से अधिक कर रहे हैं / 2 मीटर मस्तिष्क मामले के उदर की सतह पर पहुंच गया। 0.31 जम्मू / 2 सेमी - 30 मिनट के लिए वितरित करते हैं, विवो में ऑप्टिक तंत्रिका की कोशिकाओं द्वारा प्राप्त खुराक इसलिए 0.054 है। वर्तमान अध्ययन में दिया 670nm प्रकाश की खुराक (0.38J / 2 सेमी) तक इसलिए हमारे विवो में पिछले अध्ययनों में कोशिकाओं द्वारा प्राप्त उन धरना।

आर / NIR के लेफ्टिनेंट प्रभावकारिता के सबसे व्यापक रूप से स्वीकार सिद्धांत इसलिए यह अलग-अलग तरंग दैर्ध्य के साथ इलाज किया कोशिकाओं प्रकाश की (फोटॉनों / 2 सेमी / एस) बराबर quantal fluences प्राप्त सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है, एक photoacceptor आधारित प्रणाली 18 वर्ष की है कि 8। इसके अलावा, प्रकाश की एक विशेष प्रभाव देने के लिए इस्तेमाल जोखिम समय बढ़ाने के लिए और समय पर कुल प्रभाव को कम करने के बदलते प्रकाश की ही तीव्रता के साथ, उपचार के बीच लगातार रखा जाना चाहिए। पिछले अध्ययनों से लोगों तक पहुंचाने के समय बदल परिणाम उपायों में मतभेद में बराबर fluences परिणाम देने के लिए और एक confounding कारक के रूप में कार्य कर सकते हैं, और एक विशेष चोट मॉडल 22,23 के लिए आवश्यक इष्टतम तरंग दैर्ध्य / प्रभाव मापदंडों की पहचान में बाधा है कि प्रदर्शन किया है। जैसे, हम खुराक से सावधान अंशांकन की सिफारिशप्रत्येक परीक्षण तरंग दैर्ध्य में, आर / NIR के एलटी की उपयोगी अनुकूलन सुनिश्चित करने के लिए।

वर्णित तकनीक की वजह से सेलुलर वास्तुकला और जटिल अंतर-सेलुलर बातचीत के संरक्षण के लिए अधिक सार्थक परिणामों में हो सकता है, जो organotypic टुकड़ा संस्कृतियों, सहित इन विट्रो मॉडल प्रणालियों की एक श्रृंखला के लिए प्रकाश की डिलीवरी की अनुमति देता है। चोट मॉडल में बदलाव आर / NIR के लेफ्टिनेंट के उपचार के मापदंडों में मतभेद आवश्यकता हो सकती है। इस तकनीक को वर्णित इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ प्राप्त अधिकतम बिजली उत्पादन द्वारा सीमित है। उच्च शक्ति outputs विवो अनुप्रयोगों में इन विट्रो में कुछ और अधिकांश के लिए आवश्यक हो सकता है। प्रकाश की उच्च outputs के लिए आवश्यक हैं, तो तंत्र नमूने पहुँचने के प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। प्रकाश समाप्ति और लक्ष्य कोशिकाओं के बीच की दूरी को छोटा करने की थाली तक पहुँचने के प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि होगी। वैकल्पिक रूप से, प्रकाश एक दर्पण बंद और विपक्ष के रूप में कोशिकाओं पर परिलक्षित किया जा सकता हैएक तरल प्रकाश गाइड के माध्यम से फ़िल्टर्ड किया जा रहा है sed, हालांकि वैकल्पिक तरंगदैर्ध्य और तटस्थ घनत्व फिल्टर इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। विधि आर के वितरण के लिए अनुकूलित किया जा रहे थे, तो एक और अधिक शक्तिशाली प्रकाश स्रोत का उपयोग उच्च outputs भी आवश्यकता होगी / NIR के एलटी में में होने वाले विकिरण 8,20 के प्रभावी अंतर्वेधन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक वृद्धि की खुराकों को सीएनएस चोट के vivo मॉडल, ।

अंत में, वर्तमान अध्ययन को प्रभावी ढंग से आर / NIR के लेफ्टिनेंट पढ़ाई में प्रकाश की तीव्रता और तरंग दैर्ध्य मापदंडों में फेरबदल करने का एक साधन प्रदान करता है कि प्रकाश प्रसव के एक उपन्यास विधि का वर्णन है। इस पद्धति परिणाम उपायों की एक श्रृंखला को रोजगार आर / NIR के लेफ्टिनेंट के अनुकूलन में और इन विट्रो चोट मॉडल में उपयोगी हो जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) Cell Biolabs STA-342
Amplex UltraRed Reagent Molecular Probes A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp Newport Corporation 6258 Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich 142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells American Type Culture Collection CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media Gibco 11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Gibco 10082-147 Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin Gibco 16050-122 Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement Gibco 35050-061 Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140-050 Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-118 Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks BD Biosciences B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich 25988-63-0 Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14025-134 Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 10010-049 Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural Gibco 23017-015 Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium Gibco 21103-049 Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250-061
165U Papain Worthington
L-Cysteine Sigma-Aldrich W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black Corning CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. Costar 07-200-103
Seesaw Rocker Standard lab epuipment
Centrifuge Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3) THORLABS
442 nm Bandpass Filter THORLABS FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter THORLABS FB550-10
670 nm Bandpass Filter THORLABS FB670-10
810 nm Bandpass Filter THORLABS FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) THORLABS NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) THORLABS NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) THORLABS NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) THORLABS NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) THORLABS NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) THORLABS NE10B

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References

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इंजीनियरिंग अंक 97 रेड लाइट थेरेपी प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों oxidative तनाव photobiomodulation अनुकूलन विकिरण
तरंगदैर्ध्य और oxidative तनाव पर लाल / अवरक्त के पास लाइट थेरेपी की तीव्रता का एक रेंज के प्रभाव का आकलन करने के लिए विधि<em&gt; इन विट्रो</em
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Giacci, M. K., Hart, N. S., Hartz,… More

Giacci, M. K., Hart, N. S., Hartz, R. V., Harvey, A. R., Hodgetts, S. I., Fitzgerald, M. Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro. J. Vis. Exp. (97), e52221, doi:10.3791/52221 (2015).

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