तरंगदैर्ध्य और oxidative तनाव पर लाल / अवरक्त के पास लाइट थेरेपी की तीव्रता का एक रेंज के प्रभाव का आकलन करने के लिए विधि<em> इन विट्रो</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
लेजर या प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) द्वारा वितरित लाल / लगभग अवरक्त प्रकाश चिकित्सा (आर / NIR के एलटी), संभवतः oxidative तनाव को कम करने से vivo में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र चोटों की एक श्रृंखला में कार्यात्मक और रूपात्मक परिणामों में सुधार। हालांकि, oxidative तनाव पर आर / NIR के लेफ्टिनेंट के प्रभाव तरंगदैर्ध्य या विकिरण की तीव्रता के आधार पर भिन्न करने के लिए दिखाया गया है। इलाज के मापदंडों की तुलना अध्ययन की वजह से इन विट्रो अनुकूलन अध्ययन में डाल के माध्यम से उच्च लिए उपयुक्त कई तरंग दैर्ध्य या तीव्रता, उद्धार कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों के अभाव में, कमी कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल एक दिया चोट मॉडल के लिए आवश्यक चिकित्सीय खुराक अनुकूलन करने के लिए तरंग दैर्ध्य और तीव्रता के एक रेंज में प्रकाश की डिलीवरी के लिए एक तकनीक का वर्णन है। हम तरंगदैर्ध्य और तीव्रता मापदंडों आसानी से बदला जा सकता है, जिसमें प्रकाश वितरित की एक विधि है, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को कम करने के लिए आर / NIR के एलटी की एक इष्टतम खुराक के निर्धारण की सुविधा सकता धारणा है किइन विट्रो में (आरओएस)।
गैर संसक्त क्सीनन प्रकाश बदलती तरंग दैर्ध्य (440, 550, 670 के केंद्र और तरंग दैर्ध्य 810nm) और fluences देने के लिए संकीर्ण बैंड हस्तक्षेप फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड किया गया था (8.5 एक्स 10 -3 3.8 एक्स 10 -1 जम्मू / 2 सेमी) प्रकाश की संवर्धित कोशिकाओं को। तंत्र से लाइट आउटपुट प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में प्रकाश की चिकित्सा के लिए प्रासंगिक, बराबर quantal खुराक फेंकना करने के लिए calibrated किया गया था। ग्लूटामेट DCFH-डीए और एच 2 ओ 2 संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग, प्रकाश के साथ इलाज किया कोशिकाओं पर बल दिया में प्रतिक्रियाशील प्रजातियों का पता लगाया गया।
हम सफलतापूर्वक सीएनएस चोट की एक मॉडल के रूप में ग्लूटामेट उजागर करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं को, प्रासंगिक और तरंग दैर्ध्य तीव्रता physiologically और उपचारात्मक की एक श्रृंखला पर प्रकाश दिया। संवर्धित कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न आरओएस पर असर डालती नहीं था वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल आर / NIR के एलटी की fluences, वहीं प्रकाश प्रसव की विधि अन्य syst के लिए लागू हैईएमएस अधिक physiologically माइटोकॉन्ड्रिया या प्रासंगिक organotypic टुकड़ा संस्कृति मॉडल पृथक सहित, और ऑक्सीडेटिव चयापचय के परिणाम के उपायों की एक श्रृंखला पर प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) संकेत पारगमन रास्ते और neuroprotection एक के उन सहित सेलुलर चयापचय के सामान्य प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के लिए आवश्यक हैं। अंतर्जात एंटीऑक्सीडेंट तंत्र आरओएस के उत्पादन को नियंत्रित करने में असमर्थ हैं, हालांकि, जब कोशिकाओं oxidative तनाव 2,3 का शिकार हो सकता है। सीएनएस को चोट के बाद, आरओएस और oxidative तनाव की उपस्थिति में जुड़े बढ़ जाती क्षति 4,5 की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका अदा करने के लिए लगा रहे हैं। मूल्यांकन किया गया है कि oxidative तनाव attenuating के लिए रणनीति की व्यापक संख्या के बावजूद, neurotrauma 6 निम्न नैदानिक प्रयोग में आरओएस उत्पादन और संबद्ध oxidative तनाव attenuating के लिए कोई पूरी तरह से प्रभावी, नैदानिक प्रासंगिक एंटी ऑक्सीडेंट रणनीतियों वर्तमान में कर रहे हैं। इसलिए oxidative तनाव की क्षीणन चिकित्सकीय हस्तक्षेप 7 के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य रहता है।
सुधार का पालन करेंआईएनजी आर / NIR के लेफ्टिनेंट चोटों और शायद oxidative तनाव को कम करने से cardial रोधगलितांश आकार, मधुमेह के दौरान गुर्दे और यकृत जटिलताओं, रेटिना अध: पतन, सीएनएस चोट और स्ट्रोक 8 में कटौती, सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में सूचना दी गई है। सीएनएस चोट करने के लिए विशेष रूप से संबंध के साथ, 670nm प्रकाश की प्रभावकारिता के preclinical अध्ययन रेटिना अध: पतन 9-11, रीढ़ की हड्डी में चोट के 12, neuronal मौत 13 साल की मॉडल में अच्छा प्रभाव दिखाया है। क्लिनिकल परीक्षण हालांकि इन परीक्षणों के परिणाम 15 पैरामीटर प्रभावी उपचार को रोजगार के लिए शायद कारण एक विफलता के लिए, होनहार दिखाई नहीं देते, धब्बेदार अध: पतन संबंधित सूखी उम्र के लिए आयोजित की जाती है और स्ट्रोक 14 के लिए वर्तमान में चल रही किया गया है। जैसे, आर / NIR के लेफ्टिनेंट व्यापक रूप से एक गैर इनवेसिव, प्रशासन के लिए आसान है और अपेक्षाकृत सस्ती इलाज होने के बावजूद, neurotrauma में सामान्य नैदानिक अभ्यास के हिस्से के रूप में अपनाया नहीं गया है। नैदानिक अनुवाद के लिए बाधाओं को एक सीएल की कमी शामिलजल्दी एक मानकीकृत प्रभावी उपचार प्रोटोकॉल 16,17 की कार्रवाई और अभाव के तंत्र को समझा। प्रकाश चिकित्सा के संबंध में वर्तमान साहित्य विकिरण स्रोतों के संबंध में (एलईडी या लेजर), तरंग दैर्ध्य (जैसे, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), विकिरण की कुल खुराक (जूल / के साथ इलाज के मापदंडों में बदलाव के ढेर सारे पता चलता है इकाई क्षेत्र), अवधि (जोखिम समय), समय (पूर्व या बाद के अपमान), उपचार आवृत्ति और प्रसव के मोड () पल्स या लगातार 8। पढ़ाई के बीच इलाज के मानकों में परिवर्तनशीलता तुलना कठिन बना देता है और प्रभावकारिता 16 के बारे में संदेह करने के लिए योगदान दिया है।
इसलिए, आर / NIR के लेफ्टिनेंट के अनुकूलन स्पष्ट रूप से कई चर तुलना करने के लिए आवश्यक उच्च throughput स्क्रीनिंग तंत्र प्रदान करने में सक्षम सेल संस्कृति प्रणालियों के साथ, आवश्यक है। हालांकि वा अधिक पर्याप्त लचीलापन और नियंत्रण प्रदान कर सकते हैं कि कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोशनी व्यवस्था कर रहे हैंvelength और तीव्रता ऐसे अनुकूलन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलईडी उपकरणों आम तौर पर तीव्रता में न केवल अलग-अलग हो सकता है, जो विभिन्न निर्माताओं से कई एलईडी उपकरणों को रोजगार जांचकर्ताओं में जिसके परिणामस्वरूप कई तरंग दैर्ध्य या तीव्रता, उद्धार करने में सक्षम है, लेकिन यह भी उत्सर्जित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के स्पेक्ट्रम नहीं हैं। हम जिससे आर / NIR के लेफ्टिनेंट के मापदंडों के करीब है, सटीक नियंत्रण की अनुमति, तरंग दैर्ध्य और प्रकाश की fluences की एक श्रृंखला पैदा करने, नैरोबैंड हस्तक्षेप फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड एक ब्रॉडबैंड क्सीनन प्रकाश स्रोत को रोजगार से इस मुद्दे को संबोधित किया।
यह उपचार के चिकित्सीय खुराक आर / NIR के लेफ्टिनेंट के मामले में साइटोक्रोम ग ओक्सीडेस (कॉक्स) 18 होने की माने है, जो photoacceptor (क्रोमोफोर), के साथ बातचीत फोटॉनों की संख्या से परिभाषित किया गया है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। वितरित फोटॉन ऊर्जा तरंग दैर्ध्य के साथ बदलता रहता है; विभिन्न तरंगदैर्य पर ऊर्जा के बराबर खुराक अर्थ कॉम हो जाएगाफोटॉनों की अलग नंबरों की बेशकीमती। इसलिए, युक्ति से उत्सर्जित प्रकाश का परीक्षण किया जा करने के लिए चुना तरंग दैर्ध्य में से प्रत्येक के लिए फोटॉनों की संख्या बराबर फेंकना करने के लिए calibrated किया गया था। हम इन विट्रो में कोशिकाओं को तरंग दैर्ध्य और तीव्रता की एक सीमा पर आर / NIR के लेफ्टिनेंट देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक ऐसी प्रणाली विकसित की है और के अधीन कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन पर दिया आर / NIR के लेफ्टिनेंट के प्रभाव को मापने की क्षमता का प्रदर्शन किया है ग्लूटामेट तनाव।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सफलतापूर्वक आर / NIR के एलटी में इन विट्रो के अनुकूलन के अध्ययन के लिए एक तंत्र प्रदान करने के लिए एक सटीक और calibrated प्रकाश वितरण प्रणाली अनुकूलित है। आर के तरंगदैर्ध्य और तीव्रता मापदंडों / NIR के लेफ्ट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
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