Metode for vurdering av effektene av en Range av bølgelengder og intensiteter av Red / nær-infrarødt Lysterapi på oksidativt stress<em> In Vitro</em

Summary

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Abstract

Rød / nær-infrarødt lys terapi (R / NIR-LT), levert av laser eller lysdiode (LED), forbedrer funksjonelle og morfologiske utfall i en rekke sentralnervesystemet skader i vivo, muligens ved å redusere oksidativt stress. Imidlertid har effekten av R / NIR-LT på oksidativt stress har vist seg å variere avhengig av bølgelengden eller intensiteten av bestrålingen. Studier som sammenligner behandlingsparametere mangler, på grunn av fravær av kommersielt tilgjengelige enheter som leverer flere bølgelengder eller intensitet, egnet for høy gjennomstrømning i vitro optimaliseringsstudier. Denne protokollen beskriver en teknikk for avgivelse av lys i et område av bølgelengder og intensiteter for å optimalisere terapeutiske doser som kreves for en gitt skademodell. Vi antok at en metode for å levere lys, i hvilken bølgelengde og intensitet parametrene kan lett bli endret, kan forenkle bestemmelse av en optimal dose av R / NIR-LT for reduksjon av reaktive oksygenarter(ROS) in vitro.

Ikke-koherent Xenon lys ble filtrert gjennom smalbåndsinterferensfiltre for å levere forskjellige bølgelengder (senterbølgelengder på 440, 550, 670 og 810nm) og fluences (8,5 x 10 ^-3 til 3,8 x 10 ^-1 J / cm ²⁾ i lyset til dyrkede celler. Lys sendes ut fra apparaturen var kalibrert til å avgi terapeutisk relevante, like quantal doser av lys ved hver bølgelengde. Reaktive arter ble påvist i glutamat streket celler behandlet med lys, ved hjelp av DCFH-DA og H ₂ O ₂ sensitive fluorescerende fargestoffer.

Vi levert lys på en rekke fysiologisk og terapeutisk relevante bølgelengder og intensiteter, til dyrkede celler eksponert for glutamat som en modell av CNS skade. Mens fluences av R / NIR-LT anvendt i denne studien ikke utøve en virkning på ROS generert av de dyrkede celler, er metoden for å lette levering gjelder for andre systEMS inkludert isolerte mitokondrier eller flere fysiologisk relevante organotypic skive kultur modeller, og kan brukes til å vurdere effekter på en rekke utfallsmål oksidativ metabolisme.

Introduction

Reaktive oksygenforbindelser (ROS) er nødvendig for en rekke signaltransduksjonsveiene og normale reaksjoner av cellenes stoffskifte, inkludert de av nevro ^en. Men når endogene antioksidant mekanismen er ikke i stand til å styre produksjonen av ROS, kan cellene bukke under for oksidativt stress ^2,3. Etter skade på sentralnervesystemet, er de tilhørende økning i nærvær av ROS og oksidativt stress antatt å spille en betydelig rolle i progresjonen av skaden ^4,5. Til tross for omfattende rekke strategier for å dempe oksidativt stress som er vurdert, er det i dag ingen fullstendig effektive, er klinisk relevante antioksidant strategier for å dempe ROS produksjon og tilhørende oksidativt stress i klinisk bruk følgende neurotrauma ^6. Derfor demping av oksidativt stress er fortsatt et viktig mål for terapeutisk intervensjon ^7.

Forbedringer følgering R / NIR-LT har blitt rapportert i et bredt spekter av skader og sykdommer, inkludert reduksjoner i cardial infarktstørrelsen, nyre- og lever komplikasjoner under diabetes, retinal degenerasjon, CNS skade og hjerneslag ^8, kanskje ved å redusere oksidativt stress. Med særlig hensyn til CNS skade, har prekliniske studier av effekten av 670nm lys vist gode effekter i modeller av retinal degenerasjon ^9-11, ryggmargsskade ^12, neuronal død ^13. Kliniske studier har blitt gjennomført for tørr aldersrelatert makuladegenerasjon, og er for tiden i gang for hjerneslag ^14, men resultatene av disse studiene ikke synes lovende, kanskje på grunn av en feil å ansette effektiv behandling Parametere ^15. Som sådan, R / NIR-LT har ikke vært i omfattende bruk som en del av vanlig klinisk praksis i neurotrauma, til tross for å være en enkel å administrere, non-invasiv og relativt billig behandling. Barrierer for klinisk oversettelse inkluderer mangel på en cltidlig forstått virkningsmekanisme og fravær av en standardisert effektiv behandlingsprotokoll ^16,17. Aktuell litteratur om lysterapi avslører en mengde variasjon i behandling parametere med hensyn til bestrålingskilder (LED eller laser), bølgelengde (f.eks, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), Total dose (joule av bestråling / arealenhet), varighet (eksponeringstiden), timing (før eller etter fornærmelse), behandling frekvens og modus for levering (puls eller kontinuerlig) ^8. Variasjonen i behandlingsparametere mellom studier gjør sammenligning vanskelig og har bidratt til skepsis til effekt ^16.

Derfor er optimalisering av R / NIR-LT klart nødvendig, med cellekultursystemer i stand til å tilveiebringe den high-throughput screening mekanisme nødvendig å sammenligne de flere variable. Men det er få kommersielt tilgjengelige belysningssystemer som kan gi tilstrekkelig fleksibilitet og kontroll over wavelength og intensitet for å utføre slike optimalisering eksperimenter. Kommersielt tilgjengelige LED-enheter er generelt ikke i stand til å levere flere bølgelengder eller intensitet, noe som resulterer i undersøkere som anvender flere LED-enheter fra forskjellige produsenter, som kan variere ikke bare i intensitet, men også spekteret for bølgelengden av lys emittert. Vi har løst dette problemet ved å anvende en bredbånds Xenon lyskilde filtrert gjennom smalbånds interferensfiltre, for derved å generere et område av bølgelengder og fluences av lys, slik at nær, nøyaktig styring av parameterne til R / NIR-LT.

Det er viktig å merke seg at den terapeutiske dosen av behandlingen er definert av antall fotoner som vekselvirker med photoacceptor (kromofor), som, i tilfelle av R / NIR-LT er postulert å være cytokrom c oksidase (COX) ^18. Foton energi levert varierer med bølgelengde; betyr like doser av energi ved forskjellige bølgelengder vil være comettertraktet av forskjellige antall fotoner. Derfor ble det lyset som sendes ut fra enheten kalibrert til å avgi et tilsvarende antall fotoner for hvert av de valgte bølgelengder for å bli testet. Vi har utviklet et system som kan brukes til å levere R / NIR-LT i et område av bølgelengder og intensiteter til celler in vitro og viste evnen til å måle virkningene av den leverte R / NIR-LT på ROS produksjonen i celler utsatt for glutamat stress.

Protocol

1. Optisk Kalibrering: Måling Light Output For å forberede lys leveranseapparat, kobler du en bredbånds lyskilde (f.eks Xenon eller wolframlampe) til en passende strømforsyning. Plasser en kollimeringslinse foran lyskilden for å produsere en kollimert lysstråle. Passerer lyset gjennom et flytende varme filter for å fjerne mesteparten av varmen fra lysstrålen. Avhengig av programmet, fokusere kollimert strålen på til inngangen blenderåpning på en flytende lys guide, som gir mer fleksibel l…

Representative Results

Utgangen av lys levert ved en bølgelengde på 670nm ble kalibrert ved bruk av nøytral tetthet filter for å bestråle celler med en rekke fluences som omfatter en dose av 670nm lys som tidligere vist seg å være fordelaktig in vivo (0,3 J / cm2) 20. Ettersom antallet nøytral tetthet filter foran lyskilden økt, intensiteten (W / m2) ble redusert, slik at mindre lys til å passere til målområdet. Tabell 1 presenterer data kalibrerings 670nm lyset generert fra lyskilden utstyrt med et …

Discussion

Vi har med hell tilpasset en presis og kalibrert lys leveringssystem for å tilveiebringe en mekanisme for studie av optimalisering av R / NIR-LT in vitro. Bølgelengde og intensitet parametere av R / NIR-LT er i stand til å manipuleres nøyaktig og effektivt ved hjelp av dette systemet. Vi har fastslått at lette behandlingen av cellene ikke føre til celledød, selv om ROS ble ikke redusert ved de bølgelengder og doser levert i de celletyper som ble testet. Maksimumsintensiteten oppnås ved dagens system ve…

Materials

OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics	–
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics	–
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics	–
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics	–
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer	–
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37°C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37°C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37°C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37°C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37°C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37°C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego	–
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37°C in water bath before use
75cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20°C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37°C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37°C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20°C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37°C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington	–
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment	–
Centrifuge	Standard lab epuipment	–
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS	–
442nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B