Abstract
Röd / nära infraröda ljusterapi (R / NIR-LT), som levereras med laser eller lysdiod (LED), förbättrar funktionella och morfologiska resultat i en rad centrala nervsystemet skador in vivo, möjligen genom att minska oxidativ stress. Dock har effekterna av R / NIR-LT på oxidativ stress visats variera beroende på våglängd eller Bestrålningsstyrkan. Studier som jämför behandlingsparametrar saknas på grund av avsaknaden av kommersiellt tillgängliga anordningar som levererar flera våglängder eller intensiteter, som är lämpliga för hög genom-sätta in vitro optimeringsstudier. Detta protokoll beskriver en teknik för tillförsel av ljus vid ett intervall av våglängder och intensiteter för att optimera terapeutiska doser som krävs för en given skada modell. Vi antog att en metod för att leverera ljus, där våglängd och intensitet parametrar lätt kunde ändras, skulle kunna underlätta bestämningen av en optimal dos av R / NIR-LT för att minska reaktiva syreradikaler(ROS) in vitro.
Icke-koherent Xenon ljus filtrerades genom smalbandsinterferensfilter för att leverera olika våglängder (mittvåglängderna 440, 550, 670 och 810nm) och fluenser (8,5 x 10 -3 till 3,8 x 10 -1 J / cm 2) av ljus till odlade celler. Ljusflöde från apparaten kalibrerades att avge terapeutiskt relevanta, lika quantal doser av ljus vid varje våglängd. Reaktiva arter detekterades i glutamat stressade celler behandlade med ljuset, med användning av DCFH-DA och H 2 O 2 känsliga fluorescerande färgämnen.
Vi levererade framgångsrikt ljus vid en rad fysiologiskt och terapeutiskt relevanta våglängder och intensiteter, till odlade celler som utsätts för glutamat som en modell för CNS skada. Medan fluenser för R / NIR-LT används i den aktuella studien inte utövar en effekt på ROS genereras av de odlade cellerna, är metoden för ljus leverans tillämpas på andra systems inklusive isolerade mitokondrier eller flera fysiologiskt relevanta organotypiska slice kultur modeller, och kan användas för att bedöma effekterna på en rad utfallsmått av oxidativ metabolism.
Introduction
Reaktiva syreradikaler (ROS) krävs för en rad signaltransduktionsvägar och normala reaktioner av cellulär metabolism, däribland neuroprotektion 1. Men när endogena antioxidant mekanism inte kan kontrollera produktionen av ROS, kan celler falla för oxidativ stress 2,3. Efter skada på CNS, är de associerade ökar i närvaro av ROS och oxidativ stress tros spela en viktig roll i utvecklingen av skador 4,5. Trots den omfattande antal strategier för att dämpa oxidativ stress som har bedömts, finns det för närvarande inga helt effektiva, kliniskt relevanta antioxidant strategier för att dämpa ROS produktion och tillhörande oxidativ stress i klinisk användning efter neurotrauma 6. Dämpningen av oxidativ stress förblir därför ett viktigt mål för terapeutisk intervention 7.
Förbättringar följering R / NIR-LT har rapporterats i ett brett spektrum av skador och sjukdomar, inklusive minskningar av kardiell infarktstorlek, njur- och lever komplikationer under diabetes, retinal degeneration, CNS skada och stroke 8, kanske genom att minska oxidativ stress. Särskilt när det gäller CNS skada, har prekliniska studier av effekten av 670nm ljus visat goda effekter i modeller för retinal degeneration 9-11, ryggmärgsskada 12, neuronal död 13. Kliniska studier har utförts för torr åldersrelaterad makuladegeneration och pågår för närvarande för stroke 14, men resultaten av dessa studier inte verkar lovande, kanske på grund av underlåtenhet att anställa effektiv behandling Parametrar 15. Som sådan, R / NIR-LT har inte fått stor spridning som en del av normal klinisk praxis i neurotrauma, trots att en enkel att administrera, icke-invasiv och relativt billig behandling. Hinder för klinisk översättning inkluderar brist på en cltidigt förstod verkningsmekanism och frånvaro av ett standardiserat effektiv behandlingsprotokoll 16,17. Aktuell litteratur rörande ljusterapi avslöjar en uppsjö av variation i behandlingsparametrar avseende bestrålningstider källor (LED eller laser), våglängd (t.ex. 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), total dos (joule bestrålning / ytenhet), längd (exponeringstid), timing (före eller efter förolämpning), behandlingsfrekvens och leveranssätt (puls eller kontinuerlig) 8. Variationen i behandlingsparametrar mellan studier gör jämförelsen svår och har bidragit till skepsis effekt 16.
Därför är tydligt krävs optimering av R / NIR-LT, med cellodlingssystem kan ge kontrollmekanismen nödvändigt att jämföra flera variabler hög genomströmning. Men det finns få kommersiellt tillgängliga belysningssystem som kan ge tillräcklig flexibilitet och kontroll över wavelength och intensitet för att utföra sådana optimeringsexperiment. Kommersiellt tillgängliga LED-enheter är i allmänhet inte kan leverera flera våglängder eller intensiteter, vilket resulterar i utredarna använder flera LED enheter från olika tillverkare, som kan variera inte bara i intensitet, men också det spektrum av våglängd av ljus som avges. Vi har tagit upp denna fråga genom att använda en bredbands Xenon ljuskälla filtreras genom smalbandiga interferensfilter och därigenom generera en rad våglängder och fluenser av ljus, vilket gör att nära, noggrann kontroll av parametrarna R / NIR-LT.
Det är viktigt att notera att den terapeutiska dosen av behandling definieras av antalet fotoner växelverkar med photoacceptor (kromofor), vilken, i fallet med R / NIR-LT postuleras vara cytokrom c oxidas (COX) 18. Photon levererad energi varierar med våglängden; vilket innebär lika stora doser av energi vid olika våglängder blir comuppskattad av olika antal fotoner. Därför var det ljus som emitteras från anordningen kalibreras för att avge ett lika stort antal fotoner för var och en av de valda våglängderna som skall testas. Vi har utvecklat ett system som kan användas för att leverera R / NIR-LT vid ett våglängdsområde och intensiteter till celler in vitro och visat förmåga att mäta effekterna av den levererade R / NIR-LT på ROS produktion i celler som utsätts för glutamat stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optisk Kalibrering: Mätning Light Output
- För att förbereda ljusleveransapparaten, anslut en bredbands ljuskälla (t.ex. Xenon eller volframlampa) till en lämplig strömkälla. Placera en kollimerande lins framför ljuskällan för att producera en kollimerad ljusstråle. Passera ljus genom en flytande värmefilter för att avlägsna det mesta av värmen från ljusstrålen. Beroende på tillämpningen, fokusera den kollimerade strålen på att ingångsöppningen hos en vätskeljusledare, som föreskriver ett mer flexibel leverans av ljuset (t ex., I en inkubator).
- Vid den andra änden av den flytande ljusledaren, positionera en andra kollimerande lins och sedan en hållare till interferens och neutrala täthetsfilter. Kontrollera att detta arrangemang ger en jämnt belyst ljuspunkt i önskad våglängd och intensitet.
Anm: Avståndet mellan änden av ljusledaren och preparatplanet kan behöva variera beroende pådet område som ska belysas, men kom ihåg att då avståndet från änden av ljusledaren ökar kommer ljusintensiteten att minska. I den aktuella studien, är detta avstånd 14cm och producerar ett avsnitt stråle kors som jämnt belyser ett 3x3 väl område på en 96-brunnar. - Se till att ströljus från lampan och tillhörande optiska komponenter inte kan nå den förlaga.
- Slå på vattenkylare för flytande värmefiltret och se till att det finns vattenutbytet genom filter jackan. Slå på lampan strömkällan och vänta minst 5 minuter för bredbands ljuskälla för att stabilisera. Anmärkning: Användning av vattenkylaren krävs för att förhindra överhettning av anordningen.
- Välj en smalbandig interferensfilter (vanligen beskrivs av deras center våglängd, topptransmittans och full bredd vid halva maximum (FWHM) bandbredd) för att generera önskat våglängdsband av belysning. OBS: De smalinterferensfilter som används i den aktuella studien var 442 nm, 550 nm, 671 nm och 810 nm.
- Mät ljuset produceras av lampan vid planet där exemplaret skall placeras under behandlingen. Mäta ljuset med hjälp av en kalibrerad irradians sond (cosinus kollektor) ansluten till en lämplig spektroradiometer, med användning av särskild programvara i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Använd neutrala täthetsfilter för att justera ljusintensiteten tills önskad effekt uppnås. Anm: I den aktuella studien, är ljusintensiteten passerade varje interferensfilter justeras för att ge en lika quantal utgång på varje av de fyra behandlingsvåglängds. Det är viktigt att kontrollera kalibreringen regelbundet, eftersom lampans kan ändras.
Anmärkning: Efter inrättandet av anordningen, cellerna är redo att belysas Figur 1 är en representation av ljusleveransapparaten som används i den aktuella studien..
Figur 1. Bild av ljuset leveransapparaten. Illustrerad är ljus strömkälla, xenonlampa med bostäder, kollimeringslinsen, vattenfilter, ingångsöppningen, flytande ljusledare, andra kollimeringslinsen, filterhållare, behandling ram och matt svart kort. Notera att de smalbandiga våglängd och intensitet filter ej är visade.
2. Cellberedning
- Den beskrivna R / NIR-LT leveransmetod kan tillämpas på vilken celltyp eller modell vitro-system; som sådan följande beskrivningar av cellodling är generella, med hjälp av väletablerade tekniker till kultur feokromocytom (PC12), Müller (rMC1) och primära blandade retinala celler.
- Före cellsådd för ljusbehandling och oxidativ stress analys, förevigade kultur celler i sina respektive tillväxtmedier som innehåller lämpliga kosttillskott (t.ex.., FBS, antibiotika) i T75 blinkaks tills 70-80% sammanflytande.
- Lossa odödliggjorda celler från T75-kolvar, med hjälp av metoden är lämplig för den celltyp som ska testas, t.ex.., Trypsin. Om det behövs, innan du fortsätter med sådd av celler i 96-väl analysplattor, päls analysplattbrunnar med 10 mikrogram / ml poly-L-lysin för 1h (t.ex.., För PC12-celler) eller 10 mikrogram / ml poly-L-lysin för 1h följt av en O / N inkubation med 10 mikrogram / ml laminin (t.ex.., för blandade retinala celler).
- Centrifugera cellerna att samla in så är lämpligt (t.ex.., 3 min vid 405 xg under PC12-celler eller 10 min vid 218 xg under rMC1 celler), avlägsna supernatanten och återsuspendera i 8 ml lämpligt cellodlingsmedia.
- Om blandade retinala celler ska användas, förbereda från P0-5 neonatal råttungar genom enzymatisk nedbrytning (papain) enligt fastställda rutiner 19
- Räkna antalet viabla celler exklusive 0,4% (vikt / volym) trypanblått färgämne, med hjälp av en hemocytometer.
- Justera celltäthet such att celler blir ca 70-80% sammanflytande efter 24 eller 48 timmar i kultur. (Till PC12-celler i såddtäthet är 4,0 x 10 5 viabla celler / ml, för rMC1 celler är det 2,5 x 10 5 viabla celler / ml och för blandade retinala celler är det 8 x 10 5 viabla celler / ml). Efter tillsats av celler till antingen klara eller svarta 96-brunnsplattor (som används för H 2 O 2 eller DCFH-DA-analys respektive), i 100 | il lämpligt tillväxtmedium, så att plattan sitta på en plan yta vid 37 ° C, 5 % CO2 (eller vad förhållandena är lämpliga för den specifika celltyp) i minst 24 timmar för att möjliggöra cell följsamhet.
- Kultur celler i tillväxtmedier i lämpliga 96 brunnar brickor tills de är 70-80% sammanflytande (24h för PC12 och rMC1 celler, 48h för blandade retinala celler).
3. Lägga Glutamat stressfaktor till celler
- Förbered L-glutaminsyra mononatrium- salthydrat stresskoncentrationer av 0-10mM i lämplig fullständig växath odlingsmedier.
- Ta ut mediet från cellerna och försiktigt tvätta cellerna 3 gånger med PBS (PC12) eller HBSS (rMC1 och blandade retinala celler). Efter tvättningar, tillglutamatinnehållande medium till en total volym av 100 | il / brunn.
4. Första Doser av ljusbehandling
- Omedelbart efter tillsats av glutamat eller stress val, exponera celler till ljusbehandling vid önskade våglängder och intensiteter genom att placera under förberedda ljusleveransapparat. Var noga med att ändra quantal utsignalen från den ljusstråle som med hjälp av de fastställda kombinationer av neutrala täthetsfilter beroende på våglängden som administreras.
Notera: I de aktuella försöken, utsätta celler för ljusbehandling i 3 min hålla temperaturen genom att vila de 96 brunnar på en 37 ° C värmedyna. Behandlingstid kan varieras efter behov.- Placera en matt svart kort under cellerna för att förhindra ljusreflekterande till intilliggande brunnar i 96-well fack avsedda för andra behandlingsparametrar.
- Om behandling önskas för längre tidsperioder, lägga 25 mM Hepesbuffert att upprätthålla pH i cellodlingsmedier eller helst, placera apparater och behandlingsplattor inom en inkubator med CO2 koncentration regleras till 5% CO2, eller villkor som är optimala för den specifika celltypen.
- Efter slutförandet av ljusbehandling, placera cellerna på en plan yta och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 (eller vad förutsättningarna är optimala för den celltyp) för 24h.
Obs: Ytterligare doser av R / NIR-LT kan administreras såsom beskrivits ovan, om så önskas.
5. Final Dosering av ljusbehandling och detektion av ROS
- Innan du utför den sista omgången av ljusbehandling, förbereda reagenser som ska användas för ROS upptäckt. Förbered 50 mM citratbuffert (pH 6,0), Triton X100, och H 2 O 2 detektionsreagens som arbetarlösning (1: 2: 97-förhållande av 10 mM H 2 O 2 detektionsreagens stamlösning; 10 U / ml pepparrotsperoxidas, 50 mM natriumcitrat (pH 6,0)). Förbered DCFH-DA vid en slutlig koncentration av 100 ^ M i lämpliga miljöer.
Anm: DCFH-DA reagens för PC12-celler är i RPMI-medium, DCFH-DA reagens för rMC1 celler är i DMEM-medium. Observera att kommersiellt tillgängliga reagenser detekterings har differential känslighet för specifika ROS och reagenser bör väljas med omsorg för att tillhandahålla den information som önskas för en enskild applikation. - Administrera ljusbehandling till cellerna, såsom beskrivs i steg 4.1-4.1.2. Se till att cellerna behandlas med de önskade fluenser / ljusvåglängder.
- Omedelbart efter ljusbehandling, ta bort glutamatinnehållande medier och tvätta två gånger med lämplig buffertlösning (för PC12-celler, är PBS används och för rMC1 celler, är HBSS används). Utför ROS-analyser på cellerna som följer:
- H 2 O 2 CO2 under 15 min. Lägg 50 ^ il H2O 2 detektion arbetslösning och inkubera under 30 min vid RT. Mät fluorescens med användning av en plattläsare med en excitationsvåglängd av 530 nm och en emissionsvåglängd av 480 nm.
- DCF-analysen: lägg 100 pl av 100 pM lösning av DCFH-DA för att var och en av brunnarna och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C och 5% CO2. Avlägsna media innehållande 100 pM DCFH-DA och tvätta med lämplig buffertlösning (såsom beskrivits ovan) två gånger. Lägg 90 | il buffertlösning och 10 | il Triton X100 till var och en av brunnarna och försiktigt skaka på en orbital shaker i 30 sek före 15 min inkubation vid 37 ° C. Mät DCF härledd fluorescens med användning av en plattläsare med en excitationsvåglängd av 480 nm och en emissions Wavelength av 530 nm.
- Express ROS värden i förhållande till proteinkoncentrationen av celler som finns kvar i brunnarna, genom att använda en kolorimetrisk kit för att kvantifiera proteinkoncentration i enlighet med tillverkarens instruktioner, med referens till en standardkurva för att beräkna mg protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utsignalen från ljus avges vid en våglängd av 670nm kalibrerades med användning av neutrala densitetsfilter för att bestråla cellerna med ett område av fluenser omfattar en dos av 670 nm ljus som tidigare visat sig vara fördelaktigt in vivo (0,3 J / cm 2) 20. Eftersom antalet neutrala täthetsfilter framför ljuskällan ökas, intensiteten (W / m 2) minskade, så att mindre ljus att passera till målområdet. Tabell 1 visar kalibreringsdata för 670nm ljus som genereras från ljuskällan försedd med ett våglängdsfilter och omfattar antalet ND-filter som används och intensiteten av ljus som genereras som ett resultat, vid beskrivna avstånd från ljusflöde. Fluence, eller dos av 670nm ljus (J / cm2), beräknades från ekvationen: [Dos (J / cm2) = (Ljusstyrka (W / m 2) / 10,000) x (s)], där behandlingstillfället var 180s.
| Antal ND-filter | Avstånd från ljusflöde (cm) | Intensitet (W / m ^ 2) | Dos (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10,5 | 20,11 | 0,38 |
| 0 | 14 | 10,55 | 0,19 |
| 1 | 14 | 4,91 | 0,075 |
| 2 | 14 | 2,28 | 0,041 |
| 3 | 14 | 1,03 | 0,018 |
| 4 | 14 | 0,47 | 0,0085 |
| 5 | 14 | 0,21 | 0,0038 |
| 6 | 14 | 0,094 | 0,00169 |
| 7 | 14 | 0,045 | 0,00081 |
| 8 | 14 | 0,021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0,013 | 0.000234 |
Tabell 1: Utmatning av ljusleveransapparat försedd med 670nm våglängdsfilter .Nummer av ND-filter hänvisar till antalet av neutrala täthetsfilter monterade på framsidan av ljuskällans utgång. Intensitet (W / m 2) hänför sig till intensiteten hos det ljus som rapporterats av the särskild programvara. Fluence, eller dos beräknades genom ekvationen [Dos (J / cm2) = (Ljusstyrka (W / m 2) / 10,000) x (s)], där exponeringstiden var 180s och avståndet från ljusflöde var 10,5 eller 14 cm.
Två kliniskt relevanta quantal fluenser av ljus valdes för att undersöka differentialeffekter R / NIR-LT våglängd på produktion av ROS. En dos som kan nå CNS skrifter följande transmission genom liggande vävnaden använda LED enheter (dvs. 1,78 W / m 2 vid 670nm) 20 motsvarade 0,03 J / cm 2 för en 3 min behandling, eller 4,9 x 10 14 fotoner / cm 2 / s. Ljuskällan utrustad med ett filter för att resultera i utsläpp av 442, 550, 670 eller 830nm ades sedan kalibrerades med användning av kombinationer av neutrala densitetsfilter för att avge lika quantal utgångar (fotoner) för varje våglängd i motsats till energiutgångar (J / cm 2), och de doser (J / cm 2) och integrensities i W / m 2 beräknat (tabell 2a). En ytterligare högre dos som var inom de rekommenderade riktlinjerna för att stimulera cellaktiviteten 21 användes också (1.29 x 10 15 fotoner / cm2 / s), och kalibrering utföras för varje våglängd (tabell 2b).
| Våglängd (λ) | Dos (J / cm ^ 2) | Intensitet (W / m ^ 2) | Emission (Fotoner / cm ^ 2 / s) |
| 442 | 0,057 | 3,21 | 4,8 X 10 ^ 14 |
| 550 | 0,051 | 2,87 | 5,0 x 10 ^ 14 |
| 670 | 0,032 | 1,78 | 4,9 x 10 ^ 14 |
| 830 | 0,018 | 1,01 | 4,9 x10 ^ 14 |
Tabell 2:. Kalibrering av intensitet av dosen som levereras genom lika antal fotoner av ljus vid olika våglängder Intensitet (W / m 2), dos för en 3 min behandling (J / cm 2) och emission (fotoner / cm 2 / s) När produktionen av xenon ljusavgivande 442, 550, 670 och 830nm är kalibrerade för att släppa ut A) 4.9 x 10 14 fotoner / cm 2 / s eller B) 1.3 x 10 15 fotoner / cm 2 / s på ett avstånd av 14 cm från ljusflöde.
För att bedöma huruvida lampan som levereras av apparaten var toxiska för celler vid de doseringar som används, bedömde vi den proteinhalt som återstår i PC12-cell odlingsbrunnar efter de ROS-analyser, med användning av en kolorimetrisk proteinanalys. Det fanns ingen signifikant förlust av protein vid någon av de högre utgångs doseringar av ljuset (P> 0,05), vilket tyder på att doseringen av ljus som levereras inte orsakade celldöd (Figure 2) och är lämpligt att använda för bedömningar av oxidativ metabolism.
Figur 2: Effekt av varierande doser av ljus på den totala proteinkoncentrationen kvar i odlingsbrunnar efter R / NIR-LT och ROS-analys. Histogram barer är medelvärdet ± SEM proteinkoncentrationer i PC12-cellodlingsbrunnar, 6 replikat / koncentration, experiment upprepades tre gånger. Det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader mellan kontroll och någon av de behandlade grupperna såsom bestämdes genom variansanalys (ANOVA), p> 0,05.
Vi bedömde inledningsvis effekterna av 670nm ljus, levereras vid fluenser sträcker ,0085-0,38 J / cm2, som ett exempel våglängd för att bedöma lämpligheten av ljuset leveransapparaten. Ingen signifikant effect av 670nm ljus observerades vid någon av de testade fluenser vid bedömningen antingen H2O 2 eller DCF fluorescens i PC12, rMC1 eller blandade retinala celler stressad med glutamat (Figur 3, P> 0,05). Likaså fanns det inga signifikanta effekter av varierande våglängder av R / NIR-LT levereras vid 4,9 x 10 14 fotoner / cm 2 / s eller 1,3 x 10 15 fotoner / cm 2 / s på ROS produktion, vid bedömningen H2O 2 eller DCF fluorescens (P> 0,05, data visas ej). Vår förmåga att upptäcka förändringar i reaktiva ämnen bekräftas av en ökning av fluorescens av DCFH-DA reaktiv färg på 13.44 ± 0,67 mM glutamat till 22,10 ± 2,10 vid 10 mM glutamat. Medan våra data inte avslöjar positiva effekterna av R / NIR-LT levereras med hjälp av vårt ljus leveransapparat på ROS produktion i den valda modellen systemet, inte heller var det negativa effekter som celler inte äventyras, indikeras av ihållande proteinhalt i kulturbrunnar efter ljusterapi (Figur 2). Som sådan ger den beskrivna metoden ett protokoll för att behandla celler eller mitokondrier med en definierad dos av fotoner vid ett våglängdsområde och kan användas för att bedöma högre doser och alternativa utfallsmått, vilket kan möjliggöra optimering av R / NIR-LT parametrar.
Figur 3: Kvantifiering av H 2 O 2 (AC) och DCF (DF) fluorescens i PC12 (A, D), rMC1 (B, E) eller blandad retinalcell (C, F) kulturer i närvaro av 10 mM glutamat stressfaktor, Följande 670nm strålbehandling vid Fluence doser 0-0,38 J / cm2. Histogram stapel avser medelvärdet godtyckliga fluorescensenheter / ^ g protein ± SEM. Det fanns ingen statistiskt signifikantskillnader mellan kontroll och någon av behandlingsgrupperna som bestäms genom ANOVA, p> 0,05, 6 replikat per grupp, experiment upprepades tre gånger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har framgångsrikt anpassat en exakt och kalibrerat ljusleveranssystem för att tillhandahålla en mekanism för studie av optimering av R / NIR-LT in vitro. Våglängd och intensitet parametrar R / NIR-LT kan manipuleras korrekt och effektivt med hjälp av detta system. Vi etablerade att ljusbehandling av cellerna ledde inte till celldöd, även om ROS inte reducerades vid våglängder och doser levererats, i celltyper testade. De maximala stödnivåer som uppnåtts genom det nuvarande systemet vid 670nm (20.11W / m 2) är högre än tidigare publicerade åtgärder av penetrans av strålning in i råtthjärna, där 1,17 W / m 2 nådde den ventrala ytan av synnerven och 0,3 W / m 2 nådde den ventrala ytan av hjärnan fallet. Vid leverans under 30 minuter, den dos som cellerna i synnerven in vivo är därför 0,054-0,31 J / cm2. Doserna av 670nm ljus levereras i den aktuella studien (upp till 0.38J / cm 2) därför omfattar de som lämnats av celler i våra tidigare in vivo studier.
Den mest accepterade teorin om R / NIR-LT effekten är att en photoacceptor baserat system 18, därför är det viktigt att se till att celler som behandlats med olika våglängder får lika quantal fluenser av ljus (fotoner / cm2 / s) 8. Dessutom måste exponeringstiden används för att leverera en viss inflytande av ljus hållas konsekvent mellan behandlingarna, med bara intensiteten av ljuset förändras för att öka och minska den totala inflytande över tiden. Tidigare studier har visat att ändra exponeringstiden för att leverera lika fluenser resulterar i skillnader i effektmått och kan fungera som en confounding faktor, och hindra att identifiera de optimala våglängd / Fluence parametrar som krävs för en viss skada modell 22,23. Som sådan, rekommenderar vi en noggrann kalibrering av dosenvid varje testad våglängd, för att säkerställa användbar optimering av R / NIR-LT.
Den beskrivna tekniken möjliggör leverans av ljus till en rad in vitro modellsystem inklusive organotypiska slice kulturer, vilket kan resultera i mer meningsfulla resultat på grund av att bevara cellulär arkitektur och komplexa inter cellulära interaktioner. Variationer på skadan modellen kan kräva skillnader i behandlingsparametrar för R / NIR-LT. Denna teknik begränsas av den maximala uteffekten som kan uppnås med den beskrivna instrumentering. Högre uteffekter kan krävas för vissa in vitro och de flesta in vivo-applikationer. Om högre utsignalerna från ljus erfordras, kan anordningen förändras för att öka intensiteten av ljus som når proverna. Förkortning av avståndet mellan ljus terminerings- och målceller kommer att öka intensiteten hos ljus som når plattan. Alternativt, kan ljuset reflekteras från en spegel och på cellerna som OPPOsed att filtreras genom ett flytande ljusledare, men alternativa våglängd och neutrala täthetsfilter kommer att krävas för att uppnå detta. Högre utgångar med en mer kraftfull ljuskälla skulle också krävas om metoden skulle vara anpassad för leverans av R / NIR-LT i in vivo-modeller av CNS-skada, på grund av de ökade doser som krävs för att säkerställa en effektiv penetrans av bestrålning 8,20 .
Sammanfattningsvis beskriver den aktuella studien en ny metod av ljus leverans som ger en möjlighet att på ett effektivt sätt förändra intensitet och våglängds parametrar för ljus i R / NIR-LT studier. Denna metod kommer att vara användbart i optimering av R / NIR-LT anställa en rad utfallsmått och in vitro skademodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
