Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

פיתוח doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אלרגיה ידועה כבר אלף שנים. טיפול באסתמה תואר בטקסט הרפואי המצרי העתיק המכונה פפירוס אברס (~ לפנה"ס 1550) ודן בתרופות צמחיות לטיפול בזה 7.

אלרגיה היום מסווגת כתגובה רגישות יתר מהסוג I, שבו סוג T התא עוזר 2 (TH 2) הזרוע של מערכת החיסון מנווטת את הייצור של נוגדני אימונוגלובולין E (IgE) בתגובה לאנטיגנים סביבתיים הנקראים אלרגנים. אלה הם חומרים מגוונים שאינטראקציה בדרך כלל עם תאים במערכת החיסונית ולהמריץ את הסינתזה והפרשה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל interleukin-4 וinterleukin-13 8, 9 כאל חלקיקים בחלקיקי עשן סיגריות או דיזל אשר משפרות סינתזת IgE 10.

העלייה בגילויים אלרגיים במדינות מתועשות ב -50 השנים האחרונות, שיוחסה לשילוב של ההשפעהמזהמים סביבתיים ומגמה לסביבה יותר מחוטא, המשלבים להעביר את התגובה החיסונית כלפי פרופיל שלט על ידי TH 2 ציטוקינים, כפי שהוצע על ידי "היגיינה השערה '11.

כפי שצוין לעיל, בני האדם אינם יונקים רק נגוע באלרגיה. יש לציין סוסים וכלבים גם יכולים לפתח תגובות אלרגיות קלאסיות ומחקר על ידי 12 הראה כי, כמו אצל בני אדם, אלרגיה לסוסים מיוחסת לגורמים גנטיים וסביבתיים. כתוצאה מכך, בעלי החיים הללו מהווים מודל טוב ללימוד יחסי הגומלין בין גורמים הגנטיים וסביבתיים של אלרגיה, ההתקדמות שלה מרגישות למחלה, ואסטרטגיות התערבות אפשריות פעם אחת ביטויים קליניים שהגדרתם ב

בשנת 1887, Stömmer היה האדם הראשון שתאר את הדמיון בין האדם ואסטמה סוסי 13, ההשפעה של היסטמין על מערכת לב וכלי דם הסוסים היאדומה מאוד לזו של בני אדם 14. סוסים הם גם אבן הפינה של התעשייה מרוצי הסוסים, שהוא בשווי $ 72000000000 עם מחזור הימורים של 115 מליארד דולרים בשנה 15.

רוב סוסי מרוץ העכשוויים הם צאצאים של המספר הקטן של סוסים ערביים הגזעיים על ידי ליידי אן בלאנט מהשינה 1878 ואילך. סוסי מרוץ מודרניים בדרך כלל ממולדים כדי לבחור ליכולות ביצועים. הם נוטים להפרעות גנטיות, שאחד מהם היא הרגישות שלהם להר תגובות אלרגיות. יש להם גם 1000 פעמים רמות גבוהות יותר IgE בסרום יותר אפילו בני האדם 16 ביותר אלרגי קשה. תגובות אלרגיות סוסים בדרך כלל באות לידי ביטוי כרגישות יתר עקיצת חרק (IBH) 17, 18. תוצאות IBH בדלקת עור כתוצאה מעקיצות חרקים מהוות בסוג Culicoides. צורה נוספת של מחלה אלרגית סוסים היא חסימות בדרכי נשימה חוזרות ונשנות (Rao), זה באו לידי ביטוי בבריאות ובדרכי הנשימה. הוא מאופיין על ידי צפצופים ומעבדהנשימה כבדה. לשכה לביקורת מתרחשת בדרך כלל בתגובה לעצב נבגים, ורמות IgE לאלרגן ספציפי גבוהות נרשמו בסוסים שסבלו מלשכה לביקורת במחקר אחד 19 למרות שחקירה עוד לא אישרה 20 זה.

מחקרים על אלרגיה לסוסים סובבים סביב הניסיון בניטור ונטרול IgE סוסים על ידי פיתוח נוגדנים נגד סוסים IgE חד שבטיים (מבז) 21, 22. יתר על כן המחקר של 23 דן בייצור של תחומים תאיים של α של גבוהה-זיקת קולט Fc הסוסים קולט שרשרת (FcεRIα) בניסיון לזהות ולכמת בסרום סוסי IgE. במחקר נלווה על ידי 24 Ledin דן בגישה חדשה שמטרתה לנטרל IgE בסרום על ידי תחול במערכת החיסון בimmunogen עצמי שאינם עצמי /. כל המחקרים הללו, עם זאת, היו חסרים assay יעיל על מנת לבחון את הבטיחות ויעילות של הפרוטוקולים שלהם. במאמר זה, אנחנו עכשיו נציג נתונים כאלה sys assayTEM החלים על המחקר של אסטרטגיות אבחון וטיפול רלוונטיות למערכת הסוסים, שבו שחרור β-hexosaminidase, כמדד לdegranulation מתווך תא, הוערך על תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים. פרוטוקול זה מבוסס על פרסומים קודמים 25, 4, 5, 2, 3 המתארים את ההנדסה של תאי RBL transfected עם הגן המקודד את תחום מחייב IgE של קולט גבוה הזיקה לIgE ממינים שונים. הפרוטוקול מסביר כיצד לבצע assay שחרור β-hexosaminidase, שתוצאותיה מוצגות כממוצע ± סטיית תקן של ניסויים בשלושה עותקים.

Assay השחרור היה ראשון שפותח על ידי Siraganian והוק 25 ללמוד אלרגיה אנושית. קבוצת המעבדה בראשותו של ד"ר ראובן Siraganian גם פיתחה את קו תא RBL. תאי RBL אלו פותחו להביע FcεRIα האדם והפרוטוקול פורסם על ידי 4. החלק האחרוןשל assay הגיע עם הפיתוח של פלסמיד PSV בנייר על ידי נויברגר 26 אשר תאר את הייצור של נוגדני IgE על ידי שיבוט גן השרשרת הכבד שלו במורד הזרם של גן עכברי לאזור משתנה IgE שמכוון את hapten 4-הידרוקסי-3 -nitro-phenacetyl (NP), הנוגדן כימרי וכתוצאה מכך היה פונקציונלי מלא. היכולת לפתח כל IgE מיקוד אותו hapten, גם בעת שיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL הביאו סטנדרטיזציה של assay שהופך אותו פרוטוקול שימושי כדי למדוד את degranulation של תאי זופילים.

Assay עושה יש יתרונות וחסרונות. היתרונות של assay הוא ההסתגלות שלה לשימוש בכל מערכת יונקים, המעבדה שלנו ובכך השתמשה בו כדי לבדוק את degranulation במערכות אנושיות, כלבים וסוסים, וזה הוא בר השגה רק על ידי סינתזת IgE של האורגניזם ושיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL.

מצד השני,החסרונות של assay הוא שתאי RBL רגישים מאוד לשינויים תרמיים, מכאניים וPH, מה שהופך אותם לתת וריאציה של רמות degranulation בתוך אותו assay. הוא כך מומלץ בחום שהמבחנים תמיד חוזרים על עצמם בtriplicates ולאחר מכן ממוצע שנלקח מהם. יתר על כן, תאי RBL נוטים להעביר לפנוטיפ שאינו משחרר אם הם נשארים בתרבית רקמה לזמנים ממושכים (> 10 שבועות) 27, מה שהופך את התחזוקה שלהם מסורבלת. הם גם נוטים לזיהומים על ידי חיידקי mycoplasma, שאינם גלויים לעין מיקרוסקופ אור ולא לשנות את המורפולוגיה של התא, אך בצורה קיצונית ישנו את רמות degranulation. כך בדיקות mycoplasma רגילות יש צורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1) הכנה של קו נייד:

  1. פיתוח קו תא RBL-2H3.1 להביע α FcεRI סוסים:
    1. באמצעות שימוש בטכניקות תרבית רקמה בסיסיות לשורות תאי monolayer, transfect תאי RBL-2H3.1 הורים באמצעות פלסמיד pEE6, נושא את גן סוס FcεRIα (GenBank: Y18204.1) 28. הוסף 2 מיקרוגרם μl -1 של פלסמיד דנ"א 0.8 מיליליטר של תאים בצפיפות של 1.2 x10 7 מיליליטר תאים -1. Electroporate התאים ב 250 V 960 μF באמצעות electrocuvette 0.4 סנטימטר ואז דגירה מייד על קרח למשך 10 דקות.
    2. בחר את התאים שהשתנו באמצעות מדיה המכילה 0.4 גרם של סולפט G418 geneticin, אז למיין תאי חיים שנותרו באמצעות FACS על ידי תיוגם עם נוגדני IgE ניאון. השתמש בRBL-2H3.1 וכתוצאה מכך להביע את שורת תאי FcεRIα סוסים לחקירה 2, 3.
  2. רגישות נוגדן פרה-assay:
      -1 מיליליטר 5x10 5 תא.
    1. הוסף את IgE המעניינים את התאים מושעים לריכוז סופי של 1 מיליליטר -1 ng, אז צלחת של תאים 100 μl לצלחת גם 96 בטורים 1-6 ו לדגור על 37 ° C + 5% CO 2 + 90% לחות היחסית במשך 16 שעות. לאחר זמן הדגירה, ולפני ביצוע assay השחרור, לבדוק את הבארות תחת מיקרוסקופ לconfluency היטב ודבקות תא.

2) השחרור Assay:

  1. שטיפת התאים:
    1. חיץ שחרור חם (25 צינורות מ"מ, 120 נתרן כלורי מ"מ, 5 מ"מ כלוריד האשלגן, 0.04 מגנזיום כלוריד מ"מ, וסידן כלורי 1 מ"מ) בשעה 37 ° C כדי לאפשר לשטיפת תאים עדינה.
    2. שטוף תאים על ידי מצליף את הצלחת להסיר תקשורת סלולארי והוספת 100 μl חם, 37 מעלות צלזיוס, חיץ שחרור. חזור פעמיים.
  2. אתגר אנטיגן:
    1. הכן דילול סדרתי של אנטיגן (ניפ-HSA או DNP-HSA) של 0 מיליליטר ng -1, 0.1 מיליליטר ng ml -1, 1 ננוגרם -1, 10 מיליליטר ng -1, 100 מיליליטר ng -1, 1,000 מיליליטר ng -1, 10,000 מיליליטר ng -1 במאגר שחרור וחם על 37 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר לשטוף התא השני, לבטל את התקשורת והוחלף בפתרוני אנטיגן 100 μl. ודא שיש לי בארות באותה השורה (A1-6 לדוגמא) את אותו ריכוז אנטיגן הוסיף להם.
    3. הגדר את בקרה שלילית בשורה על ידי הוספת 0 אנטיגן -1 מיליליטר ng. להוסיף ריכוז אנטיגן הגדלת את השורות (BG) ואחריו חיץ Triton-X (5% Triton X-100) בתאי H שורה לlyse התאים לשמש כביקורת חיובית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, כדי לאפשר לתאים לשחרר מתווכים שלה.
  3. הגדרת בקרות ופרט:
    1. לאחר הדגירה, להעביר 50 μl של supernatant תא למחצית השנייה של הצלחת (בארות A1-6 לבארות A7-12, וכו '). מחק את 50 μl הנותר של supernatant ולהחליף עם 50 μl של חיץ Triton-X כדי לאפשר המדידה של כמות מתווכים שפורסמו בכל טוב בטורים 7-12 כאחוז מהמתווכים הכולל בתוך התאים בעמודה 1-6 .
  4. סובסטרט:
  5. הוסף 50 μl של מצע β-hexosaminidase (50 4 nitrophenyl-N-אצטיל-β-D-glucosaminide הערוך DMSO המדולל עד 2 מ"מ-ידי הוספתו למאגר ציטראט 0.2 M חומצת לימון ו -0.2 M נתרן אצטט, pH מ"מ 4.5) לכל הבארות לאפשרה ההמרה של המצע עד 4 nitrophenol-ידי אנזים β-hexosaminidase. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.

איור 2.4.1

  1. הפסקת התגובה:
    1. לעצור את התגובה על ידי חיץ הוספת 150 μl טריס (1 M טריס- HCl, pH 9) לכל אחד גם pH הגבוה של החיץ מפסיק את התגובה והופך את 4 nitrophenol-לצבע צהוב.
  2. קריאה וניתוח התוצאות:
    1. קראו את הצלחת באמצעות ספקטרופוטומטר צלחת ב 405 ננומטר כדי למדוד את הספיגה של הצבע הצהוב. מחושב אחוז β-hexosaminidase שוחרר תוך שימוש בנוסחא הבאה:

איור 2.6.1

  1. ליישם את הנוסחה הזאת היטב כל אחד, לאחר שממוצע נלקח לכל שורה. A1 ו- A7 מייצגים את המיקום של הבארות בצלחת גם 96. לשרטט גרף של אחוז שחרור β-hexosaminidase (מתאים לסך שחרור מתווך) אגאיאנטיגן NST ריכוז 2, 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאי RBL-2H3.1 הורים ואלה transfected עם גן קולט FcεRIα הסוסים היו רגישים ראשון עם העכבר IgE אנטי DNP-HSA וקראו תיגר עם אנטיגן DNP-HSA. עכבר IgE נקשר לקולטן החולדה אנדוגני בשני שורות התאים ובכך פועל כשליטה על מנת לבחון את כדאיות השחרור של שני שורות התאים לשחרר מתווכים (איור 1). זוהי בדיקה חשובה וצריכה להתבצע באופן שגרתי מאז על מעבר מורחב (> 10 שבועות) בתרבית תאים, תאי RBL-2H3.1 להיסחף לכיוון פנוטיפ שאינו מפריש 27. התאים הוריים נתמכים שחרור מתווך שיא של 51.54% ± 4.79%, ואילו התאים המבטאים את הקולטן FcεRIα הסוסים היו שחרור מתווך שיא של 45.99% ± 5.76%. שלהם קווים אלה התא שבו אז רגיש עם IgE סוסים אנטי ניפ-HSA וקראו תיגר עם אנטיגן ניפ-HSA (איור 1 B). תאי הורים לא עברו שחרור מתווך, שכןסוסי IgE אינו מחייב לקולט עכברוש אנדוגני. מצד השני, כצפוי, תאי RBL-2H3.1 המבטאים את הקולטן FcεRIα סוסים עברו שחרור מתווך כאשר רגישים עם IgE סוסי ניפ-HSA אנטי וקראו תיגר עם אנטיגן ניפ-HSA, נותן שחרור שיא של 36.68% ± 4.88% .

תוצאות אלו מאשרות את היעילות של פרוטוקול assay מהדורה זו בחקירה של שחרור מתווך באמצעות קולטן IgE סוסים. זה מראה שאת שורות התאים הוא כלי אבחון שימושי במסע לתחת של אסטרטגיות התערבות טיפוליות חדשניות באלרגיה לסוסים במבחנה מפחית את הצורך בניסויים בבעלי חיים. אותו הפרוטוקול גם לגבי תאי RBL-2H3.1 transfected עם האדם וקולטנים FcεRIα כלבים.

פרוטוקול זה היה בשימוש גם על מנת לבחון את הבטיחות של אסטרטגית חיסון פוטנציאלית שמנסה לנטרל סרום כלבי IgE נוגדני 30. מהתוצאותב( איור 2) ניתן לקבוע כי אסטרטגית החיסון אינה בטוחה. הסרום אנטי-הכלבי-IgE קשור בהצלחה לIgE הכלבים כפי שנועד במקור על מנת לנטרל IgE בסרום ולמנוע אותו מלהתחבר אל הקולטן שלו. אבל זה הכריכה היה נוקב, ובכך חוצה הסרום אנטי-IgE קשור קולטנים על פני השטח של התאים, וכתוצאה מכך שחרור מתווך, שעלול לגרום לשוק אנפילקטי אם אסטרטגיה של חיסון זה שימשה כחיסון נגד אלרגיה.

RBL-2H3.1 הבעת הסוסים FcεRIα - - מיוצר במעבדה
אנטי הסוסים IgE ניפ-HSA - - מיוצר במעבדה
96 צלחת גם סיגמא CLS3595 -
Multi Channel פיפטה Anachem - -
חממה Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic חומצה ביוכימיה המחקר בקיימברידג ' N-1070-1 ניפ-OH היה מצומדת עם אדם הסרום אלבומין לעשות ניפ-HSA במעבדה
Dinitrophenyl Conjugated לאדם סרום אלבומין סיגמא A6661 המקוצר DNP-HSA
ספקטרופוטומטר צלחת Anthos Labtec HT2 - -
צינורות סיגמא P1851 -
כלוריד הנתרן סיגמא S7653 -
פוטסיום כלוריד סיגמא P9333 -
מגנזיום כלוריד סיגמא M2670 -
סידן כלוריד סיגמא C1016 -
x100 טריטון סיגמא X100 -
4 nitrophenyl-N-אצטיל-β-D-glucosaminide סיגמא N9376 המצע נקרא β-hexosaminidase פתרון המניות היה 50mm הערוך DMSO
דימתיל sulfoxide סיגמא D2650 -
חומצה ציטרית סיגמא 251,275 -
נתרן אצטט סיגמא S7670 -
טריס סיגמא T5941 -

טבלת 1: טבלה של חומרים וציוד:

איור 1
איור 1: 2, 3. הגרף ב 'מראה את assay השחרור הופיע על תאי הורים RBL-2H3.1 שלא להביע FcεRIα סוסים וFcεRIα להביע סוסים אלה, באמצעות IgE ניפ-HSA אנטי סוסים לרגישות תא. IgE הסוסים נקשר לקולטן הסוסים, אבל לא קולט עכברוש אנדוגני, לגרום לשחרור מתווך, זה אישר מאז תאי ההורים לא שחררו מתווכי מתווך, ואילו התאים המבטאים את תמיכת קולט סוסי סוסים בתיווך IgE, אנטיגן מושרה , מתווך לשחרר 2, 3.

איור 2
איור 2: תוצאות assay שחרור חיסון: הגרף מראה את assay השחרור מתבצע על תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα כלבים, באמצעות IgE ניפ-HSA אנטי כלבים לרגישות תא, ועכברוש מחוסן סרום אנטי-כלבי-IgE כאנטיגן. השליטה בשימוש שמראש מחוסן סרום, והביקורת החיובית הייתה אנטיגן ניפ-HSA. IgE הכלבים נקשר לקולטן של הכלבים. יתר על כן, אנטי-IgE בסרום נקשר לקולטן של הכלבים קשורים IgE והקישורים צולבים זה, והקולט, על פני השטח של התאים וכתוצאה מכך שחרור מתווך. זו, למעשה, מוכיחה כי אסטרטגית חיסון הספציפית הזה יש לו הפוטנציאל לגרום לתגובת שוק אנפילקטי, והוא נחשב כך לא בטוח 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לסיכום תוצאות מחקר זה הראו שכאשר תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים הם רגישים עם IgE סוסים ולערער על ידי אנטיגן, הם נותנים שחרור מתווך שיא של 36.68% ± 4.88% מהסכום הכולל של מתווך בתוך תאים, בהשוואה לRBL-2H3.1 תאי הורים לא מביעים FcεRIα סוסים.

כך assay זה מספק כלי שימושי לחקירה ולימוד תגובות אלרגיות סוסים במבחנה. שלו מאפשר קביעת כמות המתווך שפורסם על ידי תאים של תא פיטום / שושלת זופילים ובכך ניתן לצפות לקידום מחקר באלרגיה לסוסים, אם הערכת אלרגיה גורמת לסוכנים, או לחקור IgE / קולט חסימת סוכנים.

assay זה שונה כדי ללמוד אלרגיה סוסים מפרסומים קודמים שהשתמשו בו כדי ללמוד אלרגיות אדם וכלבי 4529 לאותן מטרות. קו התאים המהונדסs מביע אנושי וFcεRIα כלבים הועסקו ללמוד את היעילות ובטיחות של סוכני חסימת אלרגיה כגון חיסוני מיקוד העיכוב של האינטראקציה IgE / קולט 30. החקירה חשפה תופעת לוואי anaphylactogenic של immunogens המרכיב את תחום Cε3 כולו, שגם הוצע על ידי אחרים כחיסון להחלשת תגובה אלרגית בתיווך IgE בכלבי 24. בהתבסס על החקירה שלנו, את הבסיס המולקולרי לסיבוך רציני זה יכול להיות רציונליזציה על בסיס הכרה באפיטופים בנוגדן IgE על ידי סרום החיסון נגד IgE המכיל נוגדנים נגד IgE אשר יעד epitopes בCε3 ולא מוסתר על כאשר IgE הוא ומורכב לקולטן שלו. תצפית זו לא נעשתה בהיעדר מערכת assay זה והוא בניגוד בולט לחקירה על ידי 24, שחקרה גם את אסטרטגית התערבות אנטי-אלרגיה המבוססת על in vivo immunization עם תחומים Cε3, אך לא דן בבטיחות של האסטרטגיה נובע מהעדר assay כזה.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הוא להבטיח כי הרוב המכריע של תאי RBL-2H3.1 הוא של פנוטיפ הסתרתו; יש תאים בתרבית יותר מ -10 שבועות גורם להם להתחיל להיסחף לכיוון פנוטיפ שאינו מפריש 27 ללא קשר אם הם הביעו FcεRIα המשובט של עניין או לא. לכן זה תמיד חיוני כדי להפעיל פקדים חיוביים העכבר IgE לצד הניסוי (איור 1), ולהחזיק מלאי קפוא גדולים של מפריש תאים.

יתר על כן, את ה- pH של כל המאגרים חייב להיות מדויק או שהם מסתכנים במתן תוצאות שליליות כוזבות; הארכת חיי המדף של מאגרים משנה pH שלהם, ולכן כל חיץ מעל גיל 2 חודשים צריך להיות מושלך.

הטכניקה מראה את האינטראקציה של חומר כימי עם ce RBL-2H3.1LLS, וכיצד הוא מקדם, או מונע, שחרור המתווך שלהם במבחנה. זו אינדיקציה טובה למה שעלול לקרות בvivo, וכך בפרוטוקול זה הוא צעד חיוני, כאשר במחקר אסטרטגיות טיפוליות אנטי-אלרגיה פוטנציאליות. הטכניקה אינה, עם זאת, לציין באיזה חלק של הנוגדן / מורכב קולט המולקולה של עניין אינטראקציה עם.

עבודה אחר מחקר, כגון 20 הצביעה על כך שהלשכה לביקורת סוסים אינה קשורה לגישור IgE, ולכן חלק מהפער ניתן לראות עם מו"לים אחרים כמו et al. ביום 31 בעת שימוש בסרום סוסים כולל לבדוק לCa 2 + זרם מורן מ לשכה לביקורת סובלת סוסים באמצעות נוגדני reaginic נוקבים, שנוגדנים שונים יהיו אחראים לזרם הסלולרי Ca 2 +.

assay זה הוא ספציפי לרגישויות יתר IgE בתיווך, אשר יכול להיות מיושמים גם לאורגניזמים אחרים, כגון בני אדם וכלבי 29, ומשמש במיוחד כדי לבדוק את הבטיחות של אסטרטגיות התערבות אנטי-אלרגית, כגון סינטטיים נוגדנים / chimeric נגד אלרגיה 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100, (4), 344-350 (1993).
  2. Sabban, S. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. The University of Sheffield. Sheffield. (2011).
  3. Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153, (1-2), 6-10 (2013).
  4. Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
  5. Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45, (8), 2262-2268 (2008).
  6. Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52, (3-4), 224-228 (2012).
  7. Cohen, S. G. Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus. Allergy Proc. 13, (3), 147-154 (1992).
  8. Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
  9. Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26, (12), 2972-2980 (1996).
  10. Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34, (7), 1370-1374 (2000).
  11. Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The 'hygiene hypothesis' for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160, (1), 1-9 (2010).
  12. Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33, (7), 714-720 (2001).
  13. Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of 'Broken Wind' in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
  14. Eyre, P., Lewis, A. J. Acute systemic anaphylaxis in the horse. Br. J. Pharmacol. 48, (3), 426-437 (1973).
  15. Bruggink, M. Global betting stable, but some countries suffer recession. International Federation of Horseracing Authorities. Available from: http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664 (2009).
  16. Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132, (1), 21-23 (2009).
  17. Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113, (1-2), 99-112 (2006).
  18. Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147, (3-4), 113-126 (2012).
  19. Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54, (1), 40-47 (2007).
  20. Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
  21. Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92, (1-2), 45-60 (2003).
  22. Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112, (3-4), 156-170 (2006).
  23. McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110, (1-2), 187-191 (2006).
  24. Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24, (1), 66-74 (2006).
  25. Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. American Society for Microbiology. Washington, D. C. (1980).
  26. Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314, (6008), 268-270 (1985).
  27. Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269, (30), 19300-19306 (1994).
  28. McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1, (51), 878-881 (2000).
  29. Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. The University of Sheffield. (2010).
  30. Sabban, S., et al. Towards a pan-anti-allergy vaccine. JIBTVA. 2, (2), 15-27 (2013).
  31. Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
פיתוח<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת מודל לחקר האינטראקציה של<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter