Automatiseret Måling af lungeemfysem og Small Airway Remodeling i cigaretrøg-eksponerede mus
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
Brugen af dyremodeller til at studere KOL er udfordrende, fordi ingen model perfekt kan replikere alle funktioner i den menneskelige sygdom (2). De fleste efterforskere bruge mus til at modellere KOL på grund af lighederne mellem mus og mennesker i deres pulmonale fysiologi, patologi, genetik og metabolitter. Også mus er relativt billige at studere, og begge emfysem og små luftveje remodellering udvikle sig inden for 6 måneder efter CS eksponering (5,7-9).
Cigaretrøg-induceret KOL: Flere metoder kan fremkalde KOL i mus. De fleste forskere udsætte mus for CS, som er det vigtigste ætiologiske faktor for human KOL. CS eksponering i 6 måneder forårsager udvikling af emfysem og små luftveje remodeling (SAR) i mus, men sværhedsgraden af den sygdom, der induceres varierer afhængigt af den murine stamme undersøgt. For eksempel NZWLacZ mus er resistente over for udviklingen af CS-induceret emfysem henviser AKR / J-mus er extremely følsomme (10). De fleste forskere studerer C57BL / 6-stammen mus i CS eksponering model så mange gen-målrettede mus er tilgængelige i denne stamme. Efter 6 måneders CS eksponering, emfysem og små luftveje fibrose udvikle sig i vildtype (WT) C57BL / 6-mus, og begge læsioner er relativt milde i sværhedsgrad (5,10). Forskere bruger to typer af CS eksponering: næse-only og hele kroppen engagementer. De største ulemper ved næsen kun eksponering teknik er, at: 1) det er en mere arbejdsintensiv metode; og 2) mus skal fastholdes i små kamre, der kan foranledige en stress respons og hypertermi i dyr (11). Den største ulempe ved hele kroppen eksponering (beskrevet her), at dyrene kan indtage (samt inhalerer) nikotin- og tjære produkter, når de rense deres pels. Mus udsat for hele kroppen CS også har lavere carboxyhæmoglobin niveauer og reduceret tab af kropsvægt sammenlignet med dyr udsat for næse kun CS (12).
<p class = "jove_content"> Lungefunktionen test (PFT): Foranstaltninger af lungefunktion og elastans er normalt ens i C57BL / 6 vildtype (WT) mus udsat for luft eller CS 6 måneder på grund af den relativt mild emfysem, der udvikler sig, når denne stamme udsættes for CS (10). Men når emphysematous ødelæggelse er mere alvorlig, stigninger i lunge overholdelse og venstre skift i tryk-volumen (PV) flow, sløjfer kan påvises. Sidstnævnte kan iagttages, for eksempel i murine stammer, som er mere modtagelige for virkningerne af CS (10), CS-eksponerede C57BL / 6 strain gen-målrettede mus, som er en mere alvorlig emfysem type end C57BL / 6 WT-mus (13), eller i CS-eksponerede mus udsat for miljømæssige ændringer, der gør dem mere modtagelige for virkningerne af CS (14). Denne protokol bruger en lille dyr ventilator til at måle reduktioner i den elastiske rekyl af lungen (stigninger i kvasistatiske lunge overensstemmelse [Cst] og reduktioner i vævelastans [H]), PV flow loops, og ændringer i luftveje og væv resistens i bedøvede mus (15,16).Mål for lungeemfysem: Analyse af emfysem udvikling i CS-eksponerede C56BL / 6 stamme mus er udfordrende, fordi dens fordeling er rumligt heterogen. Flere forskellige metoder kvantificere luftrum udvidelsen i mus. Den første metode var den gennemsnitlige lineære skæringspunkt (L m) (17). Men L m metode er en langsom, manuel proces, der kan ikke fange heterogenitet af sygdommen (medmindre alle dele af lungen tilfældigt udtages), og dets brug kan derfor indføre observatør skævhed i analysen. Den destruktive indeks [DI, (18)] også kvantificerer luftrummet udvidelsen ved hjælp af en gennemsigtig plade med 50 jævnt fordelt point placeret over en trykt digitaliseret billede af en hematoxylin og eosin-farvede lunge sektion. PI-metode scorer området omkring hvert punkt achold til det omfang, hvori de alveolære kanaler og alveolære vægge inden for dette område er ødelagt. Den største ulempe ved DI metode er, at det er tidskrævende og ikke mere nøjagtige end andre metoder (19,20).
Denne protokols betyder alveolær akkord længde og alveolære område på paraffinindstøbte lungesnit farvet med Gills plet. Morfometri software konverterer billeder af lungesnit til binære billeder (hvor væv er hvid og luftrummet er sort), og derefter lægger et ensartet net af vandrette og lodrette linjer (akkorder) og softwaren derefter kvantificerer længden af hver akkord indenfor områder, som software som luftrummet. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde er det muligt at måle størrelsen af alveolerne i alle dele af lungen på en standardiseret og relativt automatiseret måde (21).
Lille luftveje remodeling (SAR): Den øgede aflejring af ECM-proteiner (især interstitial collagener) omkring små luftveje sker i CS-eksponerede dyr og bidrager til luftvejsobstruktion. Forskere ikke studere SAR i dyremodeller af KOL så ofte som emfysem udvikling (22). For at kvantificere SAR i CS-eksponerede mus denne protokol anvender billedanalyse-software til at måle tykkelsen af laget af ECM-proteiner, der er deponeret omkring de små luftveje (luftvejene med en gennemsnitlig diameter på mellem 300 og 899 m) i paraffinindlejrede lungesnit farvet med Masson trichrom pletten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Francesca Polverino MD, en Research Fellow ved Brigham and Women 's Hospital for hendes bidrag til denne artikel, og også Monica Yao, BS, og Kate Rydell, BS for deres hjælp med murine dyrehold og udsætte musene for cigaretrøg.
Dette arbejde blev støttet af Public Health Service, National Heart, Lung, og Blood Institute Grants HL111835, HL105339, HL114501, stewardesser Medical Research Institute Grant # CIA123046, Brigham and Women 's Hospital-Lovelace Respiratory Research Institute Consortium, og Cambridge NIHR Biomedical Forskningscenter.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The ‘destructive index’ in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
