Introduction
השימוש במודלים של בעלי חיים כדי ללמוד COPD הוא מאתגר, כי אין מודל מושלם יכול לשכפל את כל התכונות של המחלה האנושית (2). רוב החוקרים משתמשים בעכברי מודל COPD בגלל הדמיון בין עכברים ובני האדם בפיסיולוגיה, פתולוגיה, הגנטיקה, ומטבוליטים הריאות שלהם. כמו כן, עכברים זולים יחסית ללמוד, ושניהם אמפיזמה ושיפוץ של דרכי הנשימה קטנה לפתח בתוך 6 חודשים מהחשיפה CS (5,7-9).
COPD מושרה עשן סיגריות: מספר שיטות יכולות לגרום ל- COPD בעכברים. רוב החוקרים לחשוף עכברים לCS, המהווה את הגורם האטיולוגי העיקרי לCOPD האנושי. חשיפת CS במשך 6 חודשים גורמת להתפתחות של אמפיזמה ושיפוץ בדרכי נשימה קטנה (SAR) בעכברים, אך חומרת המחלה הנגרמת משתנה בהתאם לזן העכברי למד. לדוגמא, עכברי NZWLacZ עמידים להתפתחות של אמפיזמה הנוצרת על-CS ואילו עכברי AKR / J הם extremel y רגיש (10). רוב החוקרים ללמוד C57BL / 6 עכברי זן במודל חשיפת CS עכברים-ממוקד גן רבים זמינים בזן זה. לאחר 6 חודשים של חשיפת CS, אמפיזמה וסיסטיק דרכי הנשימה הקטן לפתח בסוג בר C57BL (WT) / 6 עכברים, והן הנגעים מתונים יחסית בחומרה (5,10). חוקרים משתמשים בשני סוגים של חשיפת CS: חשיפות האף בלבד וכל גוף. החסרונות העיקריים של האף-רק טכניקת החשיפה הם כי: 1) הוא שיטה עתירת עבודה יותר; ו 2) עכברים צריכים להיות מרוסנים בתאים קטנים שיכול לגרום לתגובת לחץ והיפרתרמיה בבעלי החיים (11). החסרון העיקרי של חשיפת כל הגוף (שתתואר בהמשך) הוא שבעלי החיים יכולים לבלוע (כמו גם שאיפה) מוצרי ניקוטין וזפת כאשר הם לנקות את פרוותם. עכברים שנחשפו לכל הגוף CS יש גם רמות נמוכות carboxyhemoglobin ומופחתים אובדן משקל גוף בהשוואה לבעלי החיים שנחשפו לאף-רק CS (12).
ss = "jove_content"> בדיקת תפקוד ריאתי (PFTS): צעדים של עמידת ריאות וelastance הם בדרך כלל דומים ב/ 6 סוג בר C57BL (WT) עכברים שנחשפו לאוויר או CS במשך 6 חודשים עקב נפחת קל יחסית שמתפתח כאשר זה זן חשוף לCS (10). עם זאת, כאשר הרס emphysematous הוא חמור יותר, עולה בקנה אחד ריאות ומשמרות שמאל בלחץ-הנפח (PV) לזרום ניתן לאתרם לולאות. האחרונים יכול להיות שנצפה, למשל, בזנים עכבריים שרגישים יותר להשפעות של CS (10), בעכברים שנחשפו-CS C57BL / 6 זן-ממוקד גן שיש לי סוג אמפיזמה חמור יותר מ/ 6 עכברי WT C57BL (13), או בעכברים שנחשפו-CS נתון לשינויים סביבתיים ההופכים אותם רגישות יותר להשפעות של CS (14). פרוטוקול זה משתמש הנשמה חיה קטנה למדידת ירידה ברתיעה אלסטית של הריאה (עליות בעמידת ריאות quasistatic [CST] וירידה ברקמהelastance [ח]), זרימת לולאות PV, ושינויים בהתנגדות בדרכי נשימה ורקמות בעכברים מורדמים (15,16).
מדדים של אמפיזמה ריאתית: ניתוח של התפתחות נפחת בעכברי זן C56BL / 6 חשופים-CS הוא מאתגרים בגלל ההפצה שלה היא במרחב הטרוגנית. כמה שיטות שונות לכמת הגדלת מרחב אווירי בעכברים. השיטה הראשונה בה השתמשה הייתה ליירט ליניארי (מ 'L) הממוצע (17). עם זאת, השיטה מ 'L היא תהליך איטי, הוראות אשר לא יכול ללכוד את ההטרוגניות של המחלה (אלא אם כן את כל החלקים של ריאות נדגמים באופן אקראי) והשימוש בו עשוי אפוא להציג את ההטיה משקיף לניתוח. המדד ההרסני [DI, (18)] גם מכמת הגדלת מרחב אווירי באמצעות גיליון שקוף עם 50 נקודות תחולקנה בצורה שווה ממוקמות מעל תמונת דיגיטציה מודפסת של hematoxylin וסעיף ריאות מוכתמת eosin. ציוני שיטת PI הסביבה כל ac נקודהcording למידה שבה צינורות alveolar וקירות מכתשי באזור זה נהרסו. החסרון העיקרי של שיטת DI הוא שזה גוזל זמן ולא מדויק יותר מאשר בשיטות אחרות (19,20).
צעדי פרוטוקול זה אומר אורך alveolar אקורד ואזור מכתשי בחלקי ריאה-מוטבע פרפין מוכתמים בכתם של גיל. תוכנת Morphometry ממירה תמונות של חלקי ריאה לתמונות בינארי (שברקמה לבנה ובמרחב אווירי הוא שחור), ולאחר מכן כופה את רשת אחידה של קווים אופקיים ואנכיים (אקורדים) והתוכנה אז מכמתת את אורכו של כל אקורד בתוך האזורים שזוהו על ידי תוכנה כמרחב אווירי. באמצעות שיטה זו, ניתן למדוד את גודלו של alveoli בכל חלקי הריאה באופן סטנדרטי ויחסית אוטומטי (21).
שיפוץ קטן בדרכי נשימה (SAR): בתצהיר המוגבר של חלבוני ECM (במיוחד interstitiacollagens l) סביב דרכי הנשימה קטנות מתרחש בבעלי חיים שנחשפו-CS ותורם לזרימת אוויר חסימה. חוקרים לא לומדים SAR במודלים של בעלי חיים של COPD באותה תדירות כמו פיתוח אמפיזמה (22). כדי לכמת SAR בעכברים שנחשפו-CS, פרוטוקול זה משתמש בתוכנת ניתוח תמונה למדוד את עובי השכבה של חלבוני ECM שהופקדה סביב דרכי הנשימה הקטנות (דרכי הנשימה שקוטר ממוצע בין 300 ל 899 מ ') בסעיפי ריאה-מוטבע פרפין מוכתם בכתם Trichrome של האסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול לוקח ~ 25 שבועות כדי להשלים. הפרוטוקול נחשף עכברים לאוויר או עשן במשך 24 שבועות. בסופו של חשיפות העשן, אמצעי פרוטוקול תפקוד הריאתי בעכברים, וריאות מנופחים ללחץ קבוע, קבוע, והוסרו באותו היום. זמן נוסף שנדרש לחוקר להטביע, לחתוך, ולהכתים את חלקי הריאה (2-3 ימים), וללכוד ולנתח את התמונות (2-4 ימים בהתאם למספר בעלי החיים למדו). גם פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למדוד הגדלת מרחב אווירי הקשורות לגיל בעכברים.
כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש בריגהם ובית החולים לנשים / בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד.
חשיפה לעשן סיגריות 1. כל הגוף
- לחשוף עכברים לעשן במכשיר חשיפה לעישון של כל גוף (ראה איור 1) מותקן במנדף.
הערה: המכשיר טוען אוטומטית סיגריות מחקר לגלגל, lights הסיגריות, ואוסף עשן צד זרם בחדר אוסף עשן הצד-זרם, ופולט את הסיגריות. המכונה משלבת עשן זרם צד עם עשן הזרם המרכזי שחולץ מהסיגריה על ידי משאבה כדי ליצור תערובת של עשן הזרם המרכזי וצד-זרם. אוהד בתא הערבוב ודילול מערבב את העשן עם אוויר הסביבה ומניע את העשן לתוך תאי חשיפה. - כלובי מקום המכילים את העכברים ללא מכסי הכלוב הוסרו (איור 1) בתא החשיפה. לאפשר לעכברים לנוע בחופשיות בכלובים שלהם ויש להם גישה למזון ולמים למשך החשיפה לעישון (~ 1.75 שעות).
- מניחים דלי מלא במים מתחת לתא הסיגריה לכבות סיגריות נפלטו. הפעל אתנול (100%) באמצעות המשאבה ולחבר אותו למכשיר. הפעל את אלמנט המיקרו של המכשיר, אשר יוזם טעינה אוטומטית של הסיגריות, שקשוקה של המשאבה, וחימום של ניהול תאורת הסיגריהחוט טינג.
- עומסי המכשיר, אורות, ומעשנים 10 סיגריות בכל פעם ולאחר מכן פולט את הסיגריות משמשות ומחליפים אותם בקבוצה חדשה של 10 סיגריות ויחזרו על תהליך זה. כל מחזור לוקח 9 דקות.
- להתאקלם עכברים לעשן על ידי חשיפתם לעשן מסיגריות 20 ביום הראשון, 40 סיגריות ביום השני, 60 סיגריות ביום השלישי, 80 סיגריות ביום הרביעי, וביום החמישי 100 סיגריות. במהלך תקופת ההסתגלות, להתבונן העכברים בזהירות לסימני מצוקה.
- לאחר 5 ימים של הסתגלות, לחשוף את העכברים ליום 100 סיגריות, 5 או 6 ימים לכל שבוע במשך 6 חודשים. יש צורך ברמה זו של חשיפה לעישון כדי לגרום להגדלה צנועה יחסית במרחב אווירי ב/ 6 עכברי wild-type C57BL (23,24). לחשוף את עכברי שליטה לאוויר חדר סביבה למשך 6 חודשים. לשקול עכברים לפני הסתגלות עשן ולאחר מכן שבועי להעריך את ההשפעה של חשיפה לעישון על משקל גוף.
- צג הכולל הישעה את החלקיקיםעניין (TSPM) בתאי החשיפה לאחר 60 הסיגריות הראשונות כבר עישן:
- לשקול נייר סינון ולמקם אותו לתוך מחזיק מסנן בקו שמחובר לסמפלר מסנן מתוזמן ומד דלק יבש. סמפלר מסנן מתוזמן מושך אוויר מתא החשיפה דרך נייר הסינון והאמצעים מד דלק זרימת האוויר בדגימה.
הערה: חומר חלקיקי מלכודות מסנן 20 מ '3 של אוויר חדר חשיפה עוברת דרך המסנן (נמדד במד הדלק היבש). - לחשב את ספירת TPM כשינוי במשקל מסנן לפני ואחרי הדגימה (במ"ג) למ '3 אוויר. ספירת TPM אידיאלית היא בין 150 ל 200 מ"ג / מ '3.
- לשקול נייר סינון ולמקם אותו לתוך מחזיק מסנן בקו שמחובר לסמפלר מסנן מתוזמן ומד דלק יבש. סמפלר מסנן מתוזמן מושך אוויר מתא החשיפה דרך נייר הסינון והאמצעים מד דלק זרימת האוויר בדגימה.
- אחרי הכל של הסיגריות כבר עישן, להסיר את הכלובים מתא החשיפה ולבחון את העכברים לסימני מצוקה במשך 20 דקות.
- נקה את המשאבה עם 100% אתנול לאחר כל שימוש, ולנקות את כל יציאות ומוטות בדו-שבועי מכונה כדי לקדםזרימת אוויר ולמנוע הצטברות של זפת.
מבחן תפקוד ריאתי 2. (PFTS) ואינפלציה ריאות
- בסופו של החשיפות, להרדים כל עכבר על ידי מתן קוקטייל של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם), xylazine (10 מ"ג / קילוגרם), וacepromazine (3 מ"ג / קילוגרם) על ידי תוואי intraperitoneal ב200 μl של תמיסת מלח (USP כיתה) ולהשתמש במשחת טרינריים המשפיעה על העיניים כדי למנוע מהם מהתייבשות. חכה עד שהחיה היא במטוס של הרדמה כירורגית, מעריכה בשיטת הבוהן הקמצוץ.
- לגלח את העור הקדמי לקנה הנשימה, ולחטא את האזור עם פתרון המכיל יוד ואחריו אתנול. לעשות חתך קו אמצע דרך העור ורקמה התת עורית הקדמית לקנה הנשימה באמצעות מספריים autoclaved, ולהפריד את שרירי sternothyroid עם מלקחיים כדי לחשוף את קנה הנשימה.
- עובר אורך 2 אינץ 'של אחורי תפר משי לקנה הנשימה, להפוך את קנה בהיבט הקדמי של קנה הנשימה עם t autoclavedהמספריים racheal, להכניס צינורית לקנה הנשימה (18 G) לקנה, ולאבטח אותו במקום עם התפר.
- חבר את העכבר לY-צינורות של המתאם של המאוורר המכני באמצעות הצינורית לקנה הנשימה, וליזום אוורור מכאני באמצעות נפח של גאות ושפל של 10 מיליליטר / קילוגרם וקצב נשימה של 150 נשימות / דקה.
הערה: חשוב בשלב זה על מנת להבטיח כי העכבר הוא מורדם כראוי להשיג מדידות מדויקות PFT. Re-מינון העכבר עם הרדמה אם בעל החיים הוא לא במטוס של הרדמה כירורגית. המשך השלם של כל תמרוני PFT הוא כ -7.5 דקות, כך שבדרך כלל אין צורך redose העכברים עם הרדמה פעם במטוס של הרדמה כירורגית הושג. הזמן הכולל מאינדוקציה של הרדמה להמתת החסד הוא ~ 20 דקות. - לנפח את הריאות לקיבולת כוללת ריאות (TLC) 3 פעמים במשך היסטורית נפח למדוד את קיבולת השאיפה (IC) ולהפחית תמט ריאות של הריאות. בשלב הבא, perforמ 'התמרון היחיד התדירות נאלץ תנודה (ההפרעות בעין מצלמה-150) ולהעריך את ההתנגדות הדינמית (R), elastance (ERS) ותאימות (CRS) של מערכת הנשימה, ואחריו את תמרון התנודה נאלץ תדר הפס הרחב (מהיר ראש-3 ההפרעות ) והתנגדות מרכזית בדרכי נשימה (n R), התנגדות רקמות (G), elastance רקמה (H) וG היחס למדוד / N (). לבסוף, תאימות שיא quasic סטטי (C st) במהלך זרימת תמרוני נפח בלחץ.
- חזור על כל אחד מחמשת תמרונים אלה פעמים (או לבצע צעדים נוספים עד קריאה עקבית מתקבלות) ולנפח לTLC שלוש פעמים בין כל סט חוזר ונשנה של מדידות. רשום את ממוצע הערך עבור כל פרמטר לכל עכבר.
- הסר את העכבר ממכונת ההנשמה המכנית, ולהרדים אותו עם CO 2 הרדמה ואחריו נקע בצוואר הרחם [שיטת המתת חסד זה מאושר על ידי המוסדי הטיפול בבעלי חיים שלנו והשתמשנו בועדה]. חותך את הסרעפת, open בית החזה בקו האמצע, ולהסיר את הצלעות קדמי לחשוף את הריאות. לנתח את העור ורקמה התת עורית סביב קנה הנשימה ולעבור אורך 2 אינץ 'שני של אחורי תפר משי לקנה הנשימה.
- הכן את הציוד לאינפלציה ריאה (איור 2):
- מלא 500 מיליליטר ארלנמייר חרוטי ¾ מלא עם PBS סטרילי, לאטום אותו עם פקק גומי, להפוך אותו, ולהשעות אותו על דוכן טבעת (כגון שהמניסקוס של pH7.4 נאגר מלוח פוספט (PBS) הוא 25 סנטימטרים מעל הלב של העכבר).
- הכנס קצה אחד של נתינה תוך ורידי נקבעה לPBS בבקבוק דרך פקק הגומי. הכנס אורך 6 סנטימטר של פיפטה סרולוגית פלסטיק באמצעות פקק הגומי, כך שהפתיחה שלה נמצאת מעל המניסקוס של PBS כדי לאפשר לאוויר להחליף PBS עוזב את הבקבוק.
- פתח את השסתום של הקבוצה נותנת ולהפעיל PBS אם כי המערכת כדי לשטוף את אוויר מהמערך הנתינה.
- חבר את מילת הקריאהסט נתינת avenous לצינורית לקנה הנשימה, פתח את השסתום, ולאפשר PBS לזרום לריאות על ידי כוח הכבידה עד הריאות מתנפחות באופן מלא. סגור את השסתום, לקשור את קנה הנשימה באמצעות דיסטלי תפר כירורגים לצינורית לקנה הנשימה, ולהסיר את הצינורית.
- הרם את קנה הנשימה עם מלקחיים, וחתך את קנה הנשימה הפרוקסימלי לקשר, ולנתח את רקמת חיבור האחורית לקנה הנשימה והריאות. מוציאים בזהירות את הריאות (ללא שסחב אותם), ולמקם את הריאות בצינור המכיל 10% פורמלין שנאגרו מלוח. תקן O הריאות / N ב RT, ולמחרת, לשטוף אותם עם PBS פעמיים.
- להטביע את הריאות בפרפין, לחתוך 5 מיקרומטר חלקים עבים, ולאחר מכן להכתים את החלקים עם הכתם של גיל כמפורט להלן.
3. נפחת
- הצביעה של גיל סעיפים ריאה-מוטבע פרפין
- מניחים את השקופיות במעמד פלסטיק ודגירה אותם 70ºC במשך 20-30 דקות בתנור.
- De-pariffinize השקופיותעל ידי דוגריהם למשך 2 דקות בכל אחד מארבעה שינויים של קסילן.
- רעננותם השקופיות על ידי דוגריהם במשך 2-3 דקות בכל אחד משני שינויים של 100% אתנול, ואחרי 2-3 דקות בכל אחד משני שינויים של 95% אתנול, ולאחר מכן לשטוף את השקופיות פעמים PBS במשך 2-3 דקות לכל שינוי של פתרון.
- דגירה השקופיות ל18-48 שעות ב1: 1 תערובת של Hematoxylin של גיל והאריס Hematoxylin שונה.
- שטוף את השקופיות עבור 2 דקות בכל אחד מחמישה שינויים של מים מזוקקים, ומייבש את השקופיות על ידי דוגרים אז במשך 2-3 דקות בכל אחד משני שינויים של 95% אתנול, ואחרי 2-3 דקות בכל אחד מ2 שינויים של 100% אתנול.
- נקה את השקופיות על ידי דוגריהם למשך 2 דקות בכל אחד מארבעה שינויים של קסילן.
- הר השקופיות עם תקשורת הרכבה ברורה ולהוסיף coverslip ללא בועות החדרת, אשר תפריע ניתוח שלאחר מכן.
- רכישת תמונה אקראית:
- לרכוש תמונות בשחור לבן כקובץ TIFFs באמצעות מיקרוסקופ, אובייקטיבי 20 X, ומצלמה ותוכנה שיכולה לרכוש תמונות דיגיטליות באיכות גבוהה.
- לכידה ~ 20-30 תמונות (X 200 הגדלה) לכל עכבר באופן אקראי, עם הצופה העיוור לתנאי הניסוי, הימנעות אזורים תחת מנופח-הריאה.
- קלטת שדה-finder מיקרו-שקופית לשקופית. יש מוצא שדה רשת המכילה סדרה של ריבועים שכותרתו עם מכתב (בכיוון האנכי) ומספר (בכיוון האופקי) ויש לו כל ריבוע צלב (+) במרכז ומזוהה על ידי אות אחת ומספר (למשל, A1, A2, ...... Z25).
- השתמש בגיליון אלקטרוני Excel Generator אקראי שדה כדי לבחור מרובע עבור לכידת תמונה באופן אקראי. כדי ליצור מכתב אקראי, להיכנס EFGHJKLMNPQRSTU לתא B1 בגיליון האלקטרוני (החוקר יכול להתאים מגוון מכתב זה כדי לכסות את הטווח של ריבועים זוהו על ידי מכתב שלשכב ריאות). [= MID (INT הבא, להוסיף את נוסחת $ B 1,1 $ +(RAND () * LEN (1 B $)] ועד לתא C1 באופן אקראי כדי לבחור במכתב C1. העתק ודבק C1 לC2, C3, C4 וכולי כדי ליצור עמודה של אותיות אקראיות.
- כדי ליצור מספר אקראי בעמודה הסמוכה, הקלד את הנוסחה = RANDBETWEEN (5,25) לD1 (שבו 5-25 הוא מגוון הטיפוסי של רקמה בשקופית). לחלופין, לשנות טווח זה כדי לכסות את הטווח של ריבועים זוהו על ידי מספר שלשכב ריאות.
- העתק והדבק D1 לD2, D3, D4 וכולי כדי ליצור עמודה של מספרים אקראיים ליד שאותיות אקראיות המכילות. לפיכך, כל שורה מכילה זוג האותיות באופן אקראי ומספרים המתאימים לתוויות על הריבועים בתחום-finder (למשל, E17, H24 ....).
- מניחים את השקף על המיקרוסקופ. השימוש במיקרוסקופ מטרת 4X למצוא את הריבוע המקביל בשקופית מאתר השדה (לדוגמא, E17, H24 ...) ולמקם את הכיכר הזאת במרכז שדה מיקרוסקופ.
- יישר את המרכז המיקרוסקופישדה עם "+" במרכז הכיכר שנבחרה. הסר את מאתר השדה, להתמקד בריאות באמצעות מטרת מיקרוסקופ 20X ולרכוש את התמונה כקובץ TIF אפורה בקנה מידה. אם מכסה רקמת ריאה <50% מהשדה המיקרוסקופי, בחר בכיכר נוצרה באופן אקראי הבאה. חזור על פעולה עד ~ 20-30 תמונות שנתפסו לכל חיה. לשמור את כל תמונות לכל חיה בתיקייה אחת שכותרתו עם מספר התג של בעלי החיים על מנת שדווחתי Excel מאקרו להכיר את הקבצים.
4. Morphometry למדוד נפחת
הפרוטוקול משתמש בתמונת Scion ופקודות מאקרו המותאם אישית כדי לנתח הגדלת מרחב אווירי. תמונת Scion היא גרסה תואמת ל- Windows של יישום תמונת NIH המקורי אשר פועל תחת מערכת ההפעלה של מקינטוש. תמונת Scion פועלת תחת Windows XP ועדיין זמין באופן מקוון דרך Wikiversity.org, שבו חיפוש עבור 'תמונת Scion "ינחה את משתמש קישורים לשחרור ידני ובטא 4.0.2 של תמונת Scion. פעולת התקנה ותוכנה מפורטת במדריך לתוספת המקוונת ומסוכמת להלן. מאקרו אורך אקורד alveolar הותאם ממאקרו זמין בתמונת NIH.
- הכן את תמונת TIFF סעיף הריאות לניתוח תמונת Scion המוכתם של גיל:
- התחל תמונת Scion ולטעון את פקודות מאקרו כפי שצוין במוסף המקוון. בחר את התמונה להרחיב Brightfield [1] מאקרו כדי לבחור ולפתוח את קובץ TIFF התמונה. בשלב הבא, להשתמש בכלי עריכת התמונה להכין את התמונה לניתוח.
- השתמש בכלי מכחולים לכפות אזורים של תמונה שאינם במרחב אווירי או קירות מכתשי להיות מטופלים או כמרחב אווירי או כרקמה. לדוגמא, לצבוע הסמפונות וכלי שחורים, כך שהם מנותחים כרקמה. צבע תאים דלקתיים (או אבק) המאכלסים את החלל הלבן alveoli שלהם ניתחו כמרחב אווירי.
- בחר את צבע מברשת צבע על ידי לחיצה על סמן העכבר למילות שחורות או לבן בחלק התחתון של חלון LUT. לאחר מכן, לחץ כלי המברשת. כדי לשנות את גודל המברשת, לחץ לחיצה כפולה על כלי המברשת והזן גודל מברשת מתאים. לחץ וגרור את העכבר מעל התמונה לצייר מבני הצבע שנבחר (ראה # 1 לעיל).
- מדידת אורך אקורד ממוצע של המרחב האווירי
- בחר את אורך אקורד מאקרו האוויר [2] כדי למדוד את אורכי אקורד המרחב האווירי.
- סף את התמונה על ידי ראשון, לחיצה על העכבר בסמוך למרכז התמונה ולאחר מכן גרור את העכבר למעלה או למטה כדי להתאים את ערך הסף (מספר בין 0 ל 255, אשר מוצג בחלון מידע). לחץ על העכבר בפעם שנייה כדי לקבל את ערך הסף. התאם את הסף כדי להפוך את קירות מכתשי באותו העובי כמו בתמונות המקוריות.
הערה: זה חיוני כי החוקר לא תחת-סף ובכך ליצור הפסקות בקירות מכתשי שלא קיימת בתמונה המקורית שתפיקבאופן מלאכותי ערכי אורך גבוה אקורד. - התכנית באופן אוטומטי מסירה פיקסלים בודדים (פיקסלים שחורים יחידים מוקפים 8 פיקסלים לבנים).
- em> 4.2.4. שים לב שחלון מנחה את המשתמש מחדש סף את התמונה בינארי, תמשיך מאקרו, או לבטל את המאקרו. לסף שוב, לענות Y לפקודה ובחר את לחצן אישור.
- em> 4.2.5. דמיין חלון רשת אופקי ואנכי עם קווים 5 פיקסלים שנוצרו לגזרים על ידי פקודות מאקרו. התכנית מודדת את האורכים של קווים אופקיים ואנכיים החופפים מרחב אווירי.
- שמור את הקובץ בתיקייה כלשהי, אך לא לשנות את שם ברירת המחדל אחר פקודות מאקרו Excel דווח לא ימצאו את הקובץ (הפורמט הוא שם התמונה המצורפת עם "CLa.txt" לאורך אקורד מרחב אווירי.
הערה: אם התכנית לא עושה מדידות, ערך הסף עשוי להיות נמוך מדי (חייב להיות> 1). במקרה זה, מחדש ספי חוקר התמונה באמצעות ערך גבוה יותר. - שלהם> 4.2.7. למדידות alveolar אזור (בנוסף לאקורד אורכים), להפעיל את נוסף [4] ו [5] פקודות מאקרו, כמו גם.
- em> 4.2.8. המשך עד שכל התמונות כבר ניתח.
- ניתוח התוצאות באמצעות Excel דווח מאקרו
- פתוח Excel דווח 20x.xls. ידני מאפשר מאקרו במידת הצורך, בהתאם להגדרת ברירת המחדל של האבטחה בגרסת Excel בשימוש.
- שים לב רשימה של פקודות מאקרו בחלון מאקרו (ראה טבלה 1).
הערה: CL_Air_1 מדווחת אורך אקורד של airspaces לחיה אחת (תיקייה). CL_Air_Multi מדווח אורך אקורד של airspaces לבעלי חיים רבים (תיקיות). AP_No_Edge_1 מדווח על השטח של alveoli בלי קשר לקצה אחד של בעלי חיים (תיקייה) .AP_No_Edge_Multi מדווח על שטח של alveoli ללא קשר קצה לבעלי חיים רבים (תיקיות). AP_With_Edge_1 מדווח על שטח של alveoli עם אנשי קשר קצה לחיה אחת (תיקייה). AP_With_Edge_Multi מדווח על שטח של alveoli עם הקצה גontacts למספר תיקיות. - בחר מאקרו CL_Air_Multi לדווח מדידות אורך אקורד alveolar למספר התיקיות המתאימות לתמונות מעכברים מרובים. התכנית מדווחת את כל קבצי _CLa.txt בתיקיות שנבחרו. להשמיט קובץ _CLa.txt (בהתאם לצורך) על ידי העברתו למשנה של התיקייה הנוכחית או שינוי שם חלק _CLa.
- מחלון הקובץ, בחר בתיקייה אחת בכל פעם על ידי הדגשת התיקייה ולאחר מכן בחירת OK (התכנית אינה תומכת בבחירה מרובה בבת אחת). כמו כל תיקייה נבחרה, להתבונן בו בגיליון העבודה. בחר באפשרות "ביטול" או לסגור את חלון הקובץ על מנת להמשיך.
הערה: בהתאם לגרסת Excel, החוקר יכול להיות כדי לנווט חזרה לרמת תיקייה אחת לאחר כל תיקייה שנבחרה. - שים לב גיליון עבודה נפרדת לכל תיקייה, מציג נתונים סטטיסטיים עבור כל קובץ _CLa.txt אחרי סטטיסטיקה לנתוני אורך אקורד משולב מכל קבצי _CLa.txt.
- שינוי שם ולשמור את הגיליון האלקטרוני. שם הקובץ ברירת המחדל הוא שם תיקיית האב צורפה _CLa.xls. סגור את גיליון העבודה לפני בחירת מאקרו אחר.
Remodeling 5. Airway הקטן
- מכתים ורכישת תמונה
- כתם חלקי ריאות עם כתם Trichrome של האסון באמצעות ערכה מסחרית ולעקוב אחר ההוראות של היצרן.
- צלם תמונות של כל דרכי הנשימה בשתי הריאות שניתן לאכלס לחלוטין (כולל השכבה הכחולה מחוץ לדרך הנשימה המהווה את השכבה של חלבוני ECM המופקדים) בתוך שטח תמונה באמצעות מטרת 20X על המיקרוסקופ.
הערה: דרכי הנשימה גדולה יותר אינן משויכת לתצהיר מוגבר של חלבוני ECM בעכברים שנחשפו-CS. - שמור את תמונות צבע כקבצי JPEG.
- ניתוח תמונה: פתח את קובץ התמונהבתוכנת ניתוח תמונת התכנית.
- פתח ושם לקובץ היומן כדי להקליט את המדידות.
- בחר כלי ציור קו. צייר 4 קווים החוצים את לומן של דרכי הנשימה (הקוטר הפנימי) כדי למדוד את הגודל של דרכי הנשימה ולכלול רק את דרכי הנשימה אלה שיש לגודל הרצוי בניתוח. בשלב הבא, לצייר קווים 12 ברווחים שווים (במיקום בדרכי הנשימה התואמות את המספרים של שעון) המשתרע מהקצה של שכבת adventitial גובל את דרכי הנשימה לקצה האזור מוכתם הכחול מוקפים בדרכי הנשימה כדי למדוד את העובי של השכבה של חלבוני ECM הופקדו מחוץ לדרכי הנשימה (איור 5). הימנע מדידת אזורים שבם דרכי הנשימה אינטראקציה עם דרכי הנשימה או כלים אחרים.
- רשומה הראשונה של כל קווי קוטר הפנימיים בקובץ היומן, ולאחר מכן לרשום את הקווים 12 המודדים את עובי שכבת ECM הכחולה סביב את דרכי הנשימה.
- סגור את התמונה ולאחר מכן פתח את התמונה הבאה. <li> חזור על שלבים אלה עד שכל התמונות לבעלי החיים כבר מחוברים לתיקייה אחת.
- התחל בצעד 5.2 לתיקייה הבאה המכילה את התמונות שנתפסו על חלקי ריאה מהחיה הבאה. לצאת מהתכנית לאחר שסיים את הניתוח של כל של דרכי הנשימה בסעיפי ריאות מכל בעלי החיים בניסוי.
- הזן את 4 מדידות קוטר פנימיות ומדידות עובי ECM 12 שכבת חלבון נרשמו עבור כל מסלול טיסה לכל עכבר בקבצי יומן הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני Excel. ממוצע מדידות עובי שכבת קוטר וחלבון ECM לכל חיה.
- המרת המידות מפיקסלים למיקרון.
- קבוצה את דרכי הנשימה על פי גודל הקוטר הפנימי שלהם (לדוגמא., 300-399 מיקרומטר, 400-499 מיקרומטר וכו ') מדידות עובי שכבת חלבון ולהשוות ECM סביב דרכי הנשימה שיש בגדלים דומים לאוויר לעומת עכברים שנחשפו לעשן (למשל., דרכי הנשימה שיש בקוטר של 300-899 מיקרומטר;
- במידת צורך הסעיפים, immunostain ריאות לחלבונים בודדים (כולל collagens ביניים וחלבון קרום במרתף) ולבצע ניתוח דומה לכמת בתצהיר של חלבוני עניין שימוש בשיטה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתחיל עם חשיפת כל הגוף של עכברים לCS. פיקוח ותחזוקה של המכשיר והניטור של TPM נאותים שחשוב להבטיח חשיפות עקביות עשן (איור 1). חשוב שהחוקר מתרגל את טכניקת האינפלציה ריאה באמצעות מכשיר האינפלציה
פרוטוקול זה מתחיל עם חשיפת כל הגוף של עכברים לCS. פיקוח ותחזוקה של המכשיר והניטור של TPM נאותים שחשוב להבטיח חשיפות עקביות עשן (איור 1). חשובה ששיטות חוקר טכניקת האינפלציה הריאה באמצעות מכשיר האינפלציה (איור 2) ובזהירות מסירה את הריאות לאחר שאינפלציה במטרה להשיג חלקי ריאות גם מנופחים לניתוח מדויק של הגדלת מרחב אווירי. איור 3 א מציג ריאות מנופחות היטב ואילו איור 3 ב מציג ריאות מנופחות בצורה גרועה. איור 3 ג מציג תמונה של סעיף ריאות מנופח מוכן לשל thresholdingTEP (מקרופאגים בחללי alveolar צבועים לבנים, וכלי שיט והסמפונות צבועים בשחור כדי ליצור. צעד thresholding יוצר תמונה בינארי שבו כל הפיקסלים במרחב alveolar לבנים וכל הפיקסלים באזורים של הריאה שאינו alveoli הם שחורים (איור 3D). איור 3E ו3F להראות אקורד alveolar האנכי ואופקי אורכי שפקודות מאקרו ליצור, בהתאמה.
בדיקות תפקוד ריאתי להראות משמרות צנועות (ולא משמעותיות מבחינה סטטיסטית) עזב בלחץ הנפח (PV) לולאות המשקפות אובדן צנוע של רתיעה אלסטית של הריאות עולה בקנה אחד עם אמפיזמה קלה שמתפתחת ב/ 6 עכברי WT C57BL נחשפו לCS במשך 6 חודשים ( איור 4 א). משמרות שמאל משמעותיות בלולאות PV הם נצפו רק בזנים עכבריים כי הם מאוד רגישים להשפעות של CS או בעכברים-ממוקד גן חשוף-CS יש פנוטיפ אמפיזמה חמור יותר מאשר C57BL / 6 עכברי WT חשופים-CS.
איוריור 5 מראה תמונות נציג חלקי הריאות מוכתמות Trichrome של האסון של / 6 עכברי WT C57BL חשופים לאוויר (איור 5 א) או CS (איור 5) במשך 6 חודשים ממחישים עליות בתצהיר חלבון ECM סביב דרכי הנשימה קטנות בחיים שנחשפו-CS. איור 5C מדגים כיצד תוכנת ניתוח תמונה מכמתת בתצהיר חלבון ECM סביב דרכי הנשימה שהקוטר הפנימי הרצוי. איור 5D מציג את ניתוח בתצהיר חלבון ECM סביב דרכי הנשימה בקוטר של 300-899 מיקרומטר בC57BL / 6 עכברי WT חשופים-CS.
איור 1. קריקטורה של מערכת חשיפת סיגריה כל הגוף. מכשיר חשיפה לעישון מחובר לתא חשיפה לעישון. עשן נמשך מחדר אוסף הצד-הנחל והעשן נמשך מהסיגריות על ידי המשאבה, והן דגימות העשן הן מעורבות ומדולל באוויר הסביבה בתא הערבוב ודילול (משמאל), ולאחר מכן העשן זורם לתוך תא החשיפה. החוקר מציב עכברים בכלובים שלהם בתא החשיפה (מימין); עכברים יכולים לנוע בחופשיות בכלובים שלהם, ויש להם גישה למזון ולמים למשך החשיפה לעישון.
אינפלציה איור 2. ריאות עכבריות. החוקר ממלא בקבוק עם PBS סטרילי, חותמות זה עם פקק גומי, וההיפוך ומאבטח אותו למרחק של 25 סנטימטרים מעל ללב של החיה באמצעות דוכן טבעת. סט מתן תוך ורידי מספק PBS לריאות דרך הצינורית לקנה הנשימה. פיפטה לחתוך את סרולוגית מוחדרת דרך פקק גומי וזה מאפשר לאוויר לתוך הבקבוק כדי להחליף את הנפח של PBS המתנקז לluNGS של העכברים על ידי כוח הכבידה.
ניתוח איור 3. נפחתו. (א) מראה תמונה מייצגת של Gill's-כתם מנופח חלקי ריאה מעכברים שנחשפו לאוויר או CS במשך 6 חודשים, בחצים השחורים מציינים כלי ומקרופאגים מכתשיים. (ב) מראה תמונה מייצגת של ריאות תחת המנופח שאינה מתאים לניתוח. (א) מראה "לפני" ו- (ג) מציג את "אחרי" דמותו של סעיף ריאות נציג שהחוקר מתכונן לדור של תמונה בינארי. החיצים השחורים ב() ו- (ג) מצביעים על שני כלי שיט (שהחוקר מצייר שחור ב( C)) או מקרופאגים alveolar (שהחוקר מצייר לבן ב( C)). (ד) < / Strong> מראה את התמונה בינארי לאחר החוקר מבצע את צעד הסף. (E) ו- (F) להראות את אקורד alveolar האופקי ואנכי באורכים שהחוקר יוצר, בהתאמה. הגדלה של כל התמונות היא בר 200. Scale x מייצג 400 מיקרומטר מוצג ב().
עקומות איור 4. אורך אקורד מכתשי ולחץ-נפח. (א) מראה ניתוח טיפוסי של אורכי אקורד alveolar בC57BL / 6 עכברי WT החשופים לאוויר (n = 13) או CS (n = 24) למשך 6 חודשים. הכוכבית מציינת p <0.001. (ב) מראה לולאות PV טיפוסיות שבוצעו על עכברי C57BL / 6 WT החשוף לאוויר (n = 13) או CS (n = 14) למשך 6 חודשים. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע + SEM.
highres.jpg "/>
איור 5. שיפוץ בדרכי נשימה קטן (SAR) הערכה. (א) ו- (ב) מראים תמונות נציג של חלקי הריאה מוכתם Trichrome של האסון מ/ 6 עכברי WT C57BL חשופים לאוויר (א) או CS (B) במשך 6 חודשים. (C) מראה כיצד תוכנת ניתוח תמונת ניתוח SAR בעכברים שנחשפו-CS. (D) מראה מדידות אופייניות לעובי שכבת חלבון החוץ-התאית שהופקד סביב דרכי הנשימה קטנות שיש בקוטר של 300-899 מ 'ב/ 6 עכברי WT C57BL החשופים לאוויר (n = 11) או CS (n = 16) למשך 6 חודשים. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע + SEM וכוכבית מציין p <0.05.
ברים סולם מוצגים בתמונות של כל חלק ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות פרנצ'סקה Polverino MD, עמית מחקר בריגהם ובית החולים לנשים על תרומתה למאמר זה, וגם מוניקה יאו, BS, וקייט Rydell, BS לסיוע שלהם עם בעלי עכבריים וחשיפת העכברים לעשן סיגריות.
עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות ציבור, לאומי ללב, ריאות ודם מכון המענקים HL111835, HL105339, HL114501, טיסת לויה מכון המחקר הרפואי גרנט # CIA123046, Brigham and נשים מחקר הנשימה החולים-לאבלייס מכון Consortium, וNIHR ביו-רפואי קיימברידג ' מרכז מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The 'destructive index' in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
