Introduction
어떤 모델이 완벽하게 인간의 질병 (2)의 모든 기능을 복제 할 수 없기 때문 만성 폐쇄성 폐 질환을 연구하는 동물 모델의 사용은 도전이다. 대부분의 연구자들은 때문에 폐 생리학, 병리학, 유전학, 대사 산물의 생쥐와 인간 사이의 유사성 만성 폐쇄성 폐 질환을 모델링하기 위해 마우스를 사용합니다. 또한, 마우스는 공부를 상대적으로 저렴하고, 폐기종 및 작은기도 개형 모두 CS 노출 (5,7-9) 6 개월 이내에 개발할 수 있습니다.
담배 연기에 의한 COPD : 여러 가지 방법이 쥐에서 만성 폐쇄성 폐 질환을 유발 할 수 있습니다. 대부분의 연구자들은 인간의 만성 폐쇄성 폐 질환의 주요 병인 인자 CS에 쥐를 노출. 6 개월 CS 노출 폐기종 마우스에서 작은기도 개형 (SAR)의 발전을 초래하지만, 유도되는 질환의 중증도 공부 뮤린 균주에 따라 다양하다. AKR / J 생쥐 extremel 반면 예를 들어, 마우스는 NZWLacZ CS - 유도 기종의 개발에 강한민감한 Y (10). 대부분의 연구자들은 많은 유전자 타겟 마우스이 변형에서 사용할 수있는 CS 노출 모델의 C57BL / 6 변형 쥐를 연구한다. CS 노출, 폐기종 및 작은기도의 섬유화 6 개월 후 야생 타입 개발 (WT) C57BL / 6 마우스, 두 병변은 심각도 (5, 10)에서 상대적으로 온화한. 코 전용 및 전신 노출 : 연구자들은 CS 노출의 두 가지 유형을 사용합니다. 1)이 더 노동 집약적 인 방법이다 : 코 전용 노출 기법의 주요 단점은 있습니다 2) 마우스 동물 (11)의 스트레스 반응과 온열 수를 유도 소실 구속되어야한다. (본원에 기재 됨) 전신 노출의 주요 단점은 털을 청소할 때 동물 니코틴 및 타르 제품 (또한 흡입 등) 섭취 할 수 있다는 것이다. 전신 CS 노출 된 마우스는 또한 낮은 헤모글로빈 수치가 코 전용 CS (12)에 노출 된 동물에 비해 체중의 손실을 감소시켰다.
폐 기능 검사 (PFT를) : 폐 준수 및 elastance의 조치는 일반적으로 C57BL / 6 야생형 비슷 (WT) 때문에 때를 개발 비교적 가벼운 기종에 6 개월 공기 또는 CS에 노출 된 쥐 변형은 CS (10)에 노출된다. 기종 파괴가 더 심한 경우 그러나, 폐 준수 및 압력 볼륨 (PV)에서 왼쪽 이동의 증가는 루프가 검출 될 수있다 흐른다. 후자는 C57BL / 6 WT 마우스보다 더 심한 폐기종 유형이 CS 노출 된 C57BL / 6 변형 유전자 타겟팅 마우스에서, CS의 효과 (10)에 더 민감하다 뮤린 균주, 예를 들면, 관찰 할 수있다 또는 CS의 효과 (14)에 더 민감들을 렌더링 환경 변화 실시 CS 노출 마우스 (13). 이 프로토콜은 조직에서 폐의 탄성 반동 (quasistatic 폐 준수 증가 [CST]의 감소와 감소를 측정 할 수있는 작은 동물 인공 호흡기를 사용elastance [H]), PV 흐름 루프, 마취 마우스 (15, 16)의기도와 조직 저항의 변화.
폐기종의 측정 : 그 분포가 균질하지 않기 때문에 CS-노출 C56BL / 6 변형 생쥐에서 폐기종 개발의 분석은 도전이다. 몇 가지 다른 방법은 마우스의 영공 확대를 정량화. 사용 된 첫 번째 방법 (17)의 평균 선형 절편 (L의 m)이었다. 그러나, L의 m 방법은 (폐의 모든 부분이 무작위로 샘플링하지 않는 한) 질병 때문에 분석에 관찰자의 편견을 초래할 수있다 그것의 사용의 이질성을 캡처 할 수 있습니다 느린, 수동 프로세스입니다. 파괴 지수 [DI는, (18)]도 마톡 실린 및 에오신 염색 폐 부의 인쇄 수치화 된 영상 위에 균등하게 분산 배치 된 50 점의 투명 시트를 이용한 공역 확대 정량화. PI 방법 점수 각 지점 AC 주변 영역범위을 준수하여하는하는이 지역 내에서 폐포 덕트 및 폐포 벽은 파괴합니다. DI 방법의 주요 단점은 시간이 많이 소요되는 등의 방법 (19, 20)보다 더 정확하지 않다는 것이다.
이 프로토콜 조치 길의 얼룩 염색 파라핀 폐 섹션에 폐포 현의 길이와 폐포 영역을 의미한다. 형태 학적 소프트웨어 바이너리 이미지 폐 구간의 영상을 변환 (여기서 조직은 흰색과 공역 블랙)에 연결 한 다음, 수평 및 수직 라인 (코드)의 균일 한 그리드를 중첩 및 소프트웨어가 다음에 의해 식별 영역 내의 각 코드의 길이를 정량화 영공 같은 소프트웨어. 이 방법을 이용하면, 상대적으로 표준화되고 자동화 된 방법 (21)에 폐의 모든 부분에서 폐포의 크기를 측정 할 수있다.
작은기도 개형 (SAR) : ECM 단백질의 증가 증착 (특히 interstitia작은기도 주위 리터의 콜라겐)는 CS에 노출 된 동물에서 발생하고 방해 공기 흐름에 기여한다. 연구팀은 폐기종 개발 (22)로 자주 만성 폐쇄성 폐 질환의 동물 모델에서 SAR을 연구하지 않습니다. CS 노출 된 마우스의 SAR을 정량화하기 위해,이 프로토콜은 소기 파라핀 폐 섹션 (기도 300와 899m 사이의 평균 직경을 갖는) 주위에 증착된다 ECM 단백질의 층의 두께를 측정하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 메이슨의 트리 크롬으로 염색하고.
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Protocol
이 프로토콜은 완료 25주 ~합니다. 프로토콜 24 주 동안 공기 또는 연기에 쥐를 노출. 연기 노출이 끝나면, 프로토콜 대책 마우스에서 폐 기능 및 폐, 일정한 팽창 압력으로 고정하고, 같은 날에 제거된다. 추가의 시간 (2-4일 동물의 수에 따라 연구), 임베드 절단 및 폐 구간 (2-3 일간) 및 캡처 얼룩과 이미지를 분석하기위한 연구가 필요하다. 이 프로토콜은 또한 마우스에서 연령에 따른 공역 확대를 측정하는데 사용될 수있다.
이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 브리검에서위원회와 여성 병원 / 하버드 의과 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 전신 담배 연기 노출
- 흄 후드에 설치된 전신 흡연 노출 장치 (그림 1 참조)에서 담배를 쥐를 노출.
참고 :이 장치는 자동으로 바퀴, 난에 대한 연구 담배를로드담배 ights 및 사이드 스트림 연기 수집 챔버에서 사이드 스트림 연기를 수집하고, 담배를 토출. 기계는 메인 스트림 및 사이드 스트림 연기의 혼합물을 생성하기 위해 펌프에 의해 담배에서 추출 주류 연기와 사이드 스트림 연기를 결합합니다. 혼합 및 희석 챔버 내의 팬을 주위 공기와 혼합 연기 및 노출 챔버로 연기를 구동한다. - 노출 챔버에서 제거 케이지 뚜껑 (그림 1)없이 마우스를 포함하는 장소 케이지. 쥐들은 우리에서 약 자유롭게 이동 흡연 노출 (1.75 ~ H)에 해당하는 기간 동안 음식과 물에 접근하도록.
- 배출 된 담배를 소화 담배 실 아래에 물이 가득 양동이를 놓습니다. 펌프를 통해 에탄올 (100 %)를 실행 장치에 연결합니다. 담배 LIGH의 자동화 된 담배로드, 펌프의 피고, 난방을 시작하는 장치의 마이크로 프로세서 요소에 스위치팅 와이어.
- 로드 장치, 조명, 및 10 시간에 담배를 피우는 후 사용 담배를 토출 10 담배의 새로운 배치로 대체하고이 프로세스를 반복한다. 각각의 사이클은 9 분입니다.
- 첫 날 20 담배, 둘째 날 40 담배, 사흘 만에 60 담배, 넷째 날에 80 담배, 다섯 번째 날 (100) 담배에서 연기에 노출에 의해 흡연 마우스를 순응. 적응 기간 동안 고통의 징후를주의 깊게 쥐를 관찰합니다.
- 순응 5 일 후, 하루에 100 담배, 5 육일 주당 6 개월에 쥐를 노출합니다. 연기 노출이 레벨은 C57BL / 6 야생형 마우스에서 비교적 완만 공역 확대 (23, 24)를 유도하기 위해 필요하다. 6 개월 주변 실내 공기에 대조군 마우스를 노출. 체중에 흡연 노출의 효과를 평가하기 위해 매주 후 연기 순응 전에 마우스를 달아.
- 총 부유 입자 모니터링제 60 담배 후 노출 챔버에서 물질 (TSPM)는 훈제되었습니다
- 여과지를 달아 타임 드 필터 및 샘플러 건조 가스 미터에 접속되고 인라인 필터 홀더에 배치. 타임 드 필터 샘플러 여과지 가스 계량기 샘플링시 공기 유동을 통해 노광 챔버로부터 공기를 당긴다.
주 : 노광 챔버 공기 20m 3과 필터 트랩 입자상 물질 (건조 가스 미터로 측정) 필터를 통과한다. - 전 m 3 공기 당 (MG에서) 샘플링 후 필터 체중의 변화와 TPM 수를 계산합니다. 이상적인 TPM 수는 150 ~ 250 ㎎ / m 3이다.
- 여과지를 달아 타임 드 필터 및 샘플러 건조 가스 미터에 접속되고 인라인 필터 홀더에 배치. 타임 드 필터 샘플러 여과지 가스 계량기 샘플링시 공기 유동을 통해 노광 챔버로부터 공기를 당긴다.
- 담배가 모두 훈제 한 후, 노출 챔버에서 케이지를 제거하고 20 분 동안의 증세 쥐를 관찰합니다.
- 사용 후 100 % 에탄올로 펌프를 청소하고 홍보하기 위해 기계 격주에있는 모든 포트와로드를 청소공기 순환과 타르의 축적을 방지합니다.
2. 폐 기능 검사 (PFTS)과 폐 인플레이션
- 노출이 끝나면, 염수 200 μL에 복강 내 경로 (USP으로 케타민 (100 ㎎ / kg), 자일 라진 (10 ㎎ / kg), 및 아세 프로 마진 (3 ㎎ / kg)의 칵테일을 제공함으로써 각각의 마우스를 마취 등급) 및 건조되는 것을 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 사용합니다. 동물, 마취의 수술 비행기에 발가락 - 핀치 방법을 사용하여 평가 될 때까지 기다립니다.
- 기관에 피부 전방 면도, 에탄올 다음 요오드 함유 용액으로 영역을 소독. 멸균 가위를 사용하여 기관에 피부와 피하 조직을 통해 전방 중심선을 절개한다, 및 기관을 노출 포셉 sternothyroid 근육을 분리.
- , 기관에 실크 봉합 후방의 2 인치 길이에 합격 멸균 된 t과 기관의 전방 측면에서 기관 절개술을racheal 가위, 기관 절개술에 기관 캐뉼라 (18 G)를 삽입하고 봉합 제자리에 고정합니다.
- 기관 캐뉼라를 통해 인공 호흡기의 어댑터의 Y-튜브에 마우스를 연결, 10 ml / kg의 호흡량 / 분 150 호흡 호흡을 사용하여 기계 호흡을 시작합니다.
참고 : 마우스가 적절하게 정확한 PFT 측정을 얻기 위해 마취되어 있는지 확인하기 위해이 단계에서 중요하다. 동물은 수술 적 단계의 마취에없는 경우 마취제 마우스를 다시 투여. PFT 기동 모두의 전체 지속 시간은 약 7.5 분이므로, 수술 적 단계의 마취에 일단 다른 마취제 생쥐 redose하는 것이 필요하지 않다. 안락사에 마취 유도에서 총 시간 ~ 20 분입니다. - 총 폐 용량 (TLC) 흡기 용량 (IC)를 측정하고 폐의 무기폐를 줄이기 위해 볼륨 히스토리 3 회에 폐를 부풀려. 다음으로, perfor광대역 주파수 강제 진동 기동 (빠른 총리-3 섭동 다음에 호흡기의 elastance (ERS) 및 규정 준수 (CRS)을, 단일 주파수 강제 진동 기동 (스냅 샷-150 섭동을) m과 동적 저항 (R)을 평가 ) 및 중앙기도 저항 (R n)도, 조직 저항 (G), 조직 elastance (H)과 비 G를 측정 / N (). 마지막으로, 양 압력 유동 기동 중에 기록 quasic 정전기 컴플라이언스 (C 세인트).
- 이 연습의 각 다섯 번 반복 (또는 일관된 측정 값을 얻을 때까지 추가적인 조치를 수행) 측정의 반복되는 각 세트 사이에 세 번하고 TLC로 팽창. 각 마우스의 각 매개 변수의 평균값을 기록한다.
- 인공 호흡기에서 마우스를 제거하고 자궁 경부 전위 다음 CO 2 마취로 안락사 [이 안락사 방법은 우리의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인]. 다이어프램, 영업 이익 컷중간 선에서 흉부, 및 EN 폐를 노출 앞쪽 갈비뼈를 제거합니다. 기관 주변의 피부와 피하 조직을 해부 및 기관에 실크 봉합 후방의 제 2 인치 길이를 전달합니다.
- 폐 인플레이션 (그림 2)의 장비를 준비합니다 :
- 무균 PBS 전체 500㎖의 원뿔형 삼각 플라스크를 ¾ 채우기 고무 마개로 밀봉 그것을 반전 및 링 스탠드에 중단 (인산염 완충 염수 pH 7.4로 (PBS)의 메 니스 커스 위 25cm 같은 것을 마우스의 심장).
- 고무 마개를 통해 플라스크에 PBS로 설정 정맥 기부의 한쪽 끝을 삽입합니다. 그 개구는 공기 플라스크를 떠나 PBS로 교체 할 수 있도록 메 니스 커스의 PBS 위에 놓 이도록 고무 마개를 통해 혈청 플라스틱 피펫 6 인치의 길이를 삽입한다.
- 주는 세트의 밸브를 열고 시스템이주는 세트에서 공기를 세척 할 수 있지만 PBS를 실행합니다.
- INTR 연결기관 캐뉼라에 avenous주는 세트, 밸브를 열고, 폐가 완전히 팽창 될 때까지 PBS가 중력에 의해 폐에 유입 할 수 있습니다. 밸브를 닫습니다 기관 캐뉼라에 외과 용 봉합 원위부를 사용하여 기관을 묶어과 정맥을 제거합니다.
- 집게로기도를 들어 올리고 매듭 기관의 근위부를 절단하고, 기관 및 폐 결합 조직의 후방을 해부하다. 조심 (이들을 새김)없이 폐를 제거하고, 10 % 포르말린 - 완충 식염수를 함유하는 튜브에 폐를 배치했다. 폐의 O / RT에서 N, 다음 날 수정 PBS로 2 회 씻어.
- 파라핀에 폐를 포함, 5 μm의 두께 부분을 잘라 내고 아래에 설명 된대로 다음 길의 얼룩 부분을 얼룩.
3. 폐기종
- 파라핀 폐 부분의 길의 염색
- 플라스틱 랙에 슬라이드를 넣고 오븐에서 20 ~ 30 분 동안 70 ° C에서 그들을 품어.
- 슬라이드를 드 - pariffinize자일 렌의 네 가지 변화의 각 2 분을 배양하여.
- 95 %의 에탄올을 각각 두 변화 2-3 분 뒤에 100 % 에탄올 두 변화, 각각에서 2-3 분 동안 인큐베이션하여 그들을 슬라이드를 재수 후 2-3 분 동안 PBS로 두 번 씻어 슬라이드 솔루션의 각 변경합니다.
- 길의 헤 마톡 실린의 1 혼합물 및 수정 해리스 헤 마톡 실린 : 1에서 18-48 시간 동안 슬라이드를 품어.
- 증류수 다섯 각 변경에 2 분간 슬라이드를 세척하고 95 % 에탄올 두 각 변경에 2-3 분 동안 배양하여 다음 슬라이드를 탈수, 100 %의 변화 (2) 각각에서 2-3 분 뒤에 에탄올.
- 자일 렌의 네 가지 변화의 각 2 분을 배양하여 슬라이드를 취소합니다.
- 분명 설치 매체를 사용하여 슬라이드를 마운트하고 이후의 분석을 방해합니다 도입 거품없이 커버 슬립을 추가합니다.
- 무작위 이미지 수집 :
- TIFF 파일로 흑백 이미지 획득현미경, X (20)의 목적, 고품질 디지털 이미지를 획득 할 수있는 카메라와 소프트웨어를 사용이야.
- 폐의 아래에 펴 영역을 피하는 실험 조건에 눈을 멀게 관찰자와 무작위 방식으로 마우스 당 캡처 ~ 20-30 이미지 (X 200 배율).
- 슬라이드에 마이크로 슬라이드 필드 파인더를 테이프입니다. 필드 파인더 (수직 방향) 문자로 표시되어 사각형의 시리즈를 포함하는 그리드 (수평 방향)을 가지고, 각 스퀘어 센터에서 크로스 (+)를 가지며, 하나의 문자에 의해 식별된다 및 번호 (예를 들면, A1, A2, ... Z25).
- 무작위 이미지 캡처를위한 사각형을 선택 랜덤 필드 생성기 Excel 스프레드 시트를 사용합니다. 임의의 편지를 작성하려면, 스프레드 시트에서 셀 B1에 EFGHJKLMNPQRSTU를 입력 (연구원 폐 위에 놓여 편지에 의해 확인 된 사각형의 범위를 커버하기 위해이 편지의 범위를 조정할 수 있습니다.) 다음 수식을 추가 [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] 무작위 랜덤 한 문자의 열을 생성하는 C2, C3, C4 등등에 C1. 복사, 문자 및 붙여 넣기 C1을 선택 C1 셀합니다.
- (5-25 슬라이드에 조직의 전형적인 범위 임) 인접 열에서 난수를 생성하려면, D1에 수식 = RANDBETWEEN (5,25)을 입력합니다. 선택적으로, 폐 위에 놓일 번호로 식별 된 사각형의 범위를 커버하도록 범위를 조정한다.
- D2, D3, D4 등등에 복사 및 붙여 넣기 D1은 다음이 포함 된 랜덤 한 문자에 임의의 숫자의 열을 생성합니다. 따라서, 각 행은 필드 파인더 사각형에 라벨에 대응 임의로 생성 문자 및 숫자가 포함 된 한 쌍 (예를 들어, E17, H24을 ....).
- 현미경 슬라이드를 놓습니다. 4X 현미경 대물 렌즈를 사용하는 것은 전계 파인더 슬라이드에 대응하는 사각형을 찾아 (예 E17, H24 ...) 및 현미경 필드의 중앙에 사각형이 배치.
- 현미경의 중심을 맞 춥니 다선택한 광장의 중앙에있는 "+"필드. 필드 파인더 제거 20X 현미경 대물 렌즈를 이용하여 폐에 초점 계조 TIF 파일로 화상을 취득. 폐 조직 커버 <현미경 필드의 경우에는 50 %, 다음 임의로 생성 사각형을 선택. 20-30 이미지가 각 동물에 대해 캡처됩니다 ~까지 반복합니다. 파일을 인식 할 매크로 엑셀 보고서에 대한 위해 동물의 태그 번호가 표시 하나의 폴더에 각 동물에 대한 모든 이미지를 저장합니다.
4. 형태 학적이 폐기종을 측정하기 위해
이 프로토콜은 영공 확대를 분석하는 귀공자 이미지 및 사용자 지정 매크로를 사용합니다. 귀공자 이미지는 Macintosh 운영 체제에서 실행 원래 NIH 이미지 응용 프로그램의 Windows 호환 버전입니다. 귀공자 이미지는 윈도우 XP에서 실행되며 '귀공자 이미지'에 대한 검색 링크에 사용자를 직접 것 Wikiversity.org를 통해 온라인으로 계속 사용할 수 있습니다귀공자 이미지의 매뉴얼 및 베타 4.0.2 릴리스. 설치 및 소프트웨어 작업은 온라인 보충 설명서에 자세히 설명하고 다음과 같이 요약된다. 폐포 코드 길이 매크로는 NIH 이미지에서 사용할 수있는 매크로에서 적응했다.
- 귀공자 이미지 분석을위한 길의 스테인드 폐 부분의 TIFF 이미지를 준비합니다
- 귀공자 이미지를 시작하고 온라인 보충에 표시된대로 매크로를로드합니다. 선택하고 이미지 TIFF 파일을 열려면 열기 브라이트 이미지 [1] 매크로를 선택합니다. 다음, 분석을 위해 이미지를 준비 할 이미지 편집 도구를 사용합니다.
- 영공 또는 조직으로 하나를 처리하기 위해 영공 또는 폐포 벽되지 않은 이미지의 영역을 강제로 페인트 브러시 도구를 사용합니다. 그들이 조직으로 분석 될 수 있도록 예를 들어, 검은 기관지와 혈관을 칠합니다. 그들이 영공으로 분석됩니다에 폐포 흰색에 공간을 차지 염증 세포 (먼지)를 페인트합니다.
- 에 마우스 포인터를 클릭하여 페인트 브러시의 색상을 선택LUT 창 아래쪽에 단어 블랙 또는 화이트. 다음, 브러시 도구를 클릭합니다. 브러시 도구의 브러시 크기를 두 번 클릭을 변경하고 적절한 브러시 크기를 입력합니다. 클릭하고 구조를 선택한 색상 (위 # 1 참조) 페인트 이미지 위에 마우스를 드래그합니다.
- 영공의 평균 코드 길이를 측정
- [2] 영공 화음 길이를 측정하기 위해 매크로 코드 길이 공기를 선택합니다.
- 임계 값 다음 임계 값 (정보 창에 표시되는 0과 255 사이의 숫자를) 조정 위나 아래로 마우스를 드래그하여 이미지의 중앙 근처에 마우스를 클릭 처음으로 이미지. 마우스를 임계 값을 받아들이는 두 번 클릭합니다. 원본 이미지에서와 폐포의 벽 두께가 동일하도록 임계 값을 조정한다.
참고 :이 연구원은하지 임계 값 아래하여 생산합니다 원본 이미지에 존재하지 않는 폐포 벽에서 휴식을 만들 않는 것이 중요합니다인위적으로 높은 코드 길이 값. - 이 프로그램은 자동으로 하나의 픽셀 (8 흰색 픽셀들로 둘러싸인 하나의 검은 픽셀)를 제거합니다.
- > 4.2.4 그들. 사용자에게 다시 임계 값 이진 이미지를 묻는 창을 준수 매크로를 계속하거나 매크로를 취소 할 수 있습니다. 다시 임계하려면 프롬프트에 Y 응답하고 OK 버튼을 선택합니다.
- > 4.2.5 그들. 5 픽셀 떨어져 매크로에 의해 만들어진 라인 수평 및 수직 격자 창을 시각화. 프로그램은 공역 중첩 수평선과 수직선의 길이를 측정한다.
- 임의의 폴더에 파일을 저장하지만, 그 엑셀 보고서 매크로 형식이 영공 현의 길이에 대해 "CLa.txt"가 추가 된 이미지의 이름입니다 (파일을 찾을 수 없습니다 기본 이름을 변경하지 마십시오.
주 : 프로그램 측정을하지 않는 경우, 임계 값이 너무 낮을 수있다 (이어야> 1). 이것은 더 높은 값을 사용하여, 연구자 재 임계 이미지를 발생한 경우. - EM> 4.2.7. 폐포 면적 측정의 경우 (추가로 (chord) 길이)를 추가로 실행할 [4,5] 매크로도.
- > 4.2.8 그들. 모든 이미지 분석 될 때까지 계속합니다.
- 엑셀 리포트 매크로를 사용하여 결과를 분석
- Excel을 열고 보고서 20x.xls. 필요한 사용중인 Excel 버전의 기본 보안 설정에 따라 경우 수동으로 매크로 수 있습니다.
- 매크로 창 매크로 목록을 관찰 (표 1 참조).
참고 : CL_Air_1는 하나의 동물 (폴더)에 대한 airspaces의 현의 길이를보고합니다. CL_Air_Multi 여러 동물 (폴더)에 대한 airspaces의 현의 길이를보고합니다. AP_No_Edge_1는 .AP_No_Edge_Multi 여러 동물 (폴더)에 대한 가장자리에 접촉하지 않고 폐포의 영역을보고 하나의 동물 (폴더)에 대한 가장자리에 접촉하지 않고 폐포의 면적을보고합니다. AP_With_Edge_1는 하나의 동물 (폴더)에 대한 에지 연락처와 폐포의 영역을보고합니다. AP_With_Edge_Multi 에지 C와 폐포의 영역을보고여러 폴더에 대한 ontacts. - 여러 마우스의 이미지에 해당하는 여러 폴더에 대한 폐포 현의 길이 측정을보고 CL_Air_Multi 매크로를 선택합니다. 프로그램은 선택된 폴더에 파일 _CLa.txt 모든 보고서. 현재 폴더의 하위 폴더로 이동하거나 _CLa 부분을 이름을 변경하여 (필요에 따라) _CLa.txt 파일을 생략합니다.
- 파일 창에서 (프로그램이 한 번에 다중 선택을 지원하지 않습니다) OK를 선택하고 폴더를 강조 표시하여 한 번에 하나의 폴더를 선택합니다. 각 폴더가 선택 될 때, 시트 상으로 관찰한다. "취소"를 선택하거나 계속하기 위해 파일 창을 닫습니다.
참고 : Excel 버전에 따라, 연구자가 각 폴더를 선택하면 폴더의 한 수준 뒤로 돌아를 탐색 할 수 있습니다. - 모든 _CLa.txt 파일에서 결합 코드 길이 데이터에 대한 통계 다음 각 _CLa.txt 파일에 대한 통계를 보여주는, 각 폴더에 대해 별도의 워크 시트를 관찰합니다.
- 이름 바꾸기와 스프레드 시트를 저장합니다. 기본 파일 이름은 _CLa.xls가 추가 상위 폴더의 이름입니다. 다른 매크로를 선택하기 전에 워크 시트를 닫습니다.
5. 작은기도 개형
- 염색 화상 취득
- 상용 키트를 사용하여 메이슨의 트리 크롬 얼룩 폐 섹션을 얼룩과 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 20X 현미경 대물 렌즈를 이용하여 화상 영역 내 (퇴적 ECM 단백질 층인기도 외부 청색 층을 포함)을 완전히 수용 할 수있는 모든 양의 폐기도로의 이미지를 캡처.
참고 : 큰기도는 CS에 노출 된 쥐에서 ECM 단백질의 증가 증착과 연관되지 않습니다. - JPEG 파일로 컬러 이미지를 저장합니다.
- 이미지 분석 : 이미지 파일을 엽니 다이미지 분석 소프트웨어 프로그램.
- 열고 측정치를 기록하는 로그 파일 이름.
- 선 그리기 도구를 선택합니다. 기도의 크기를 측정하는기도의 루멘 (내경)을 횡단하는 4 라인을 그리고 그뿐만기도는 분석에서 원하는 크기를 갖는 포함한다. 이어서, 블루 - 염색 영역의 가장자리로기도를 접촉 외막 층의 에지로부터 연장되는 (시계의 번호에 대응하는기도에 위치)의 두께를 측정하는기도 12 등 간격 선을 둘러싸 그릴 기도 밖에서 증착 ECM 단백질의 층 (도 5). 기도는 다른 항공 또는 선박과 상호 작용 영역을 측정하지 마십시오.
- 먼저 로그 파일의 내경 라인의 모든 레코드, 및기도 주위 청색 ECM 층의 두께를 측정 라인 (12)을 기록한다.
- 이미지가 그 다음 이미지를 개폐. <동물에 대한 모든 이미지를 하나의 폴더에 로그인 할 때까지 리>이 단계를 반복합니다.
- 다음 동물에서 폐 섹션에서 캡처 한 이미지가 포함 된 다음 폴더에 대한 단계 5.2에서 시작합니다. 실험 동물의 폐에서 모든 섹션기도 모두의 분석을 완료 한 후 프로그램을 종료.
- 4 내경 측정 및 엑셀 스프레드 시트로 데이터 로그 파일의 각 마우스의 각기도 (12)에 대해 기록 ECM 단백질 층의 두께 측정을 입력한다. 각 동물에 대해 직경 ECM 단백질 층의 두께 측정에 대한 평균값.
- 마이크론 픽셀에서 측정 값을 변환합니다.
- 그룹 내부 직경의 크기에 따라기도 (예., 300-399 μm의, 400-499 μm의 등) 연기에 노출 된 쥐에 비해 공기 비슷한 크기를 갖는기도 주위와 비교 ECM 단백질 층 두께 측정 (예 :., 300-899 ㎛의 직경을 갖는 항공;
- (간질 콜라겐 및 기저막 단백질 포함) 개별 단백질, 발현 사이 폐 섹션 필요하고이 방법을 사용하여 관심의 단백질의 침착을 정량화 유사한 분석을 수행하는 경우.
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Representative Results
이 프로토콜은 CS에 대한 마우스의 전신 노출로 시작합니다. 적절한 감시 장치의 감시 및 TPM의 유지 일관된 연기 노출 (도 1)을 보장 센다. 연구자가 팽창 장치를 이용하여 폐 인플레이션 기술 관행한다는 것이 중요
이 프로토콜은 CS에 대한 마우스의 전신 노출로 시작합니다. 적절한 감시 장치의 감시 및 TPM의 유지 일관된 연기 노출 (도 1)을 보장 센다. 이는 연구자 관행 신중 팽창 장치 (도 2)를 이용하여 폐 인플레이션 기술 공역 확대의 정확한 분석을 위해 잘 팽창 폐 섹션을 획득하기 위해 팽창 후에 폐를 제거하는 것이 중요하다. 그림 3b는 제대로 팽창 폐를 보여줍니다 반면에 그림 3a는 잘 비정상적으로 폐를 보여줍니다. 도 3c는 이진화의 팽창에 대비 폐 구역의 이미지를 도시폐포 공간에서 TEP (대 식세포 흰색 페인트, 선박 및 기관지가 생성 검은 페인트. 임계 단계는 폐포 공간에서 모든 픽셀은 흰색으로되어있는 바이너리 이미지를 생성하고 폐포는 폐의 영역에서 모든 픽셀되지 않는 아르 블랙 (그림 3D). 그림 3E과 3 층은 수직 및 수평 폐포 코드는 매크로를 각각 생성하는 것을 길이를 보여줍니다.
폐 기능 테스트 (6 개월 CS에 노출 C57BL / 6 WT 마우스에서 발달 온화한 폐기종과 일치 폐 탄성 반동 적당한 손실을 반영 루프 압력 볼륨 (PV)의 좌측 적당한 (통계적으로 유의하지 않음) 변화를 보여준다 도 4A). PV 루프에 상당한 왼쪽 이동은 CS 또는 CS-노출 C57BL / 6 WT 마우스보다 더 심한 폐기종 표현형을 가진 CS-노출 유전자 표적으로 마우스의 효과에 매우 민감 쥐의 균주에서 관찰된다.
무화과URE 5는 CS에 노출 된 동물에서 소기 주위 ECM 단백질 침착의 증가를 나타내는 6 개월 공기 (도 5a) 또는 CS (도 5b)에 노출 된 C57BL / 6 WT 마우스의 메이슨의 트리 크롬 염색 폐 구간.도 대표 이미지를 도시 도 5c는 이미지 분석 소프트웨어 프로그램은 소정 내경을 갖는 항공 주위 ECM 단백질 침착을 정량화하는 방법을 도시한다.도 5d는 CS 노출 된 C57BL / 6 WT 마우스에서 300-899 ㎛의 직경을 갖는 항공 주위 ECM 단백질 침착 분석을 보여준다.
도 1 전신 담배의 노광 시스템은 만화. 흡연 노출 장치는 흡연 노출 챔버에 연결된다. 연기는 사이드 스트림 수집 챔버로부터 당겨질로부터 연기가 당겨질펌프에 의해 담배 연기 모두 샘플을 혼합하고, 혼합 및 희석 실 (왼쪽)으로 주위 공기로 희석 된 다음 연기 노출 챔버로 유입된다. 연구원은 노출 챔버 (오른쪽)에서 자신의 새장에 마우스를 배치; 쥐들은 우리에서 자유롭게 이동하고, 흡연 노출 기간 동안 음식과 물에 접근 할 수있다.
쥐의 폐 그림 2. 인플레이션은. 연구원은 고무 마개로 밀봉에게, 멸균 PBS로 술병을 채우고, 그것을 반전 링 스탠드를 사용하여 동물의 심장 위에 그것을 25cm의 거리를 보호합니다. 정맥 내 기부 세트 기관 캐 뉼러를 통해 폐로 PBS를 전달한다. 컷 다운 혈청 피펫 고무 마개를 통해 삽입되고,이 LU에 배수구 PBS의 부피를 대체하는 것을 플라스크에 공기를 허용중력에 의해 생쥐의 NGS.
그림 3. 폐기종 분석. (A)가 Gill's 얼룩의 대표 이미지가 6 개월 공기 또는 CS에 노출 된 쥐에서 폐 섹션을 팽창 보여, 검은 색 화살표는 혈관 및 폐포 대 식세포를 나타냅니다. (B)의 분석에 적합하지 않은 언더 팽창 폐의 대표 이미지를 보여줍니다. (A) "전에"(C)를 보여줍니다 보여줍니다 연구원은 바이너리 이미지의 생성을 위해 준비 대표적인 폐 부분의 이미지 "다음에". (A)와 (C)에서 검은 색 화살표는 선박 중 하나를 나타냅니다 (연구자가 검은 색 페인트 (C)) 또는 폐포 대 식세포 (연구자가 흰색 페인트 (C)). (D) < 연구자가 임계 공정을 실시한 뒤에 / 강해> 이진 화상을 도시한다. (E) 및 (F)은 수평 및 수직 폐포 화음 연구자가 각각 생성하는 길이를 나타낸다. 모든 이미지의 배율은 400 μm의은 (A)에 표시됩니다 나타내는 X 200 스케일 바있다.
도 4 치조골 현의 길이와 압력 - 부피 곡선. (A)를 6 개월간 대기 (N = 13) 또는 CS (N = 24)에 노출 된 C57BL / 6 WT 쥐 폐포 코드 길이의 전형적인 분석을 보여준다. 별표는 P <0.001을 나타냅니다. (B)는 6 개월 공기 (N = 13) 또는 CS (N = 14)에 노출 C57BL / 6 WT 생쥐에서 수행 일반적인 PV 루프를 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다.
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그림 5. 작은기도 개형 (SAR) 평가. (A) 및 (B)는 6 개월의 공기 (A) 또는 CS (B)에 노출 된 C57BL / 6 마우스에서 WT의 메이슨 트리 크롬 염색 폐 구간의 대표 이미지들을 보여준다. 이미지 분석 소프트웨어가 CS 노출 된 마우스에서 SAR 분석 방법 (C)를 나타낸다. (D)는 (N = 16) (6)를위한 (N = 11)을 공기에 노출 C57BL / 6 WT 마우스에서 300~899m의 직경을 갖는 작은기도 주위 증착 외 기질 단백질 층의 두께의 전형적인 측정을 도시 또는 CS 달. 데이터는 평균 ± SEM 및 별표로 표현하면 P <0.05를 나타냅니다.
스케일 바는 각각의 폐 부분의 이미지에 표시됩니다.
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Acknowledgments
우리는이 문서에 대한 공로 프란체스카 Polverino MD, 브리검에서 연구 위원과 여성 병원을 감사드립니다, 또한 모니카 야오, BS, 케이트 라이 델, 쥐의 사육 및 담배 연기에 쥐를 노출 그들의 도움 BS.
이 작품은 보건 서비스, 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 보조금 HL111835, HL105339, HL114501, 승무원 의학 연구소 그랜트 # CIA123046, 브리검 여성 병원 - 러브 레이스 호흡기 연구소 컨소시엄, 그리고 캠브리지 NIHR 바이오 메디컬에 의해 지원되었다 연구 센터.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The 'destructive index' in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
