Automatisert Måling av lungeemfysem og Small Airway Ombygging i sigarettrøyk utsatte Mus
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
Bruk av dyremodeller for å studere KOLS er utfordrende fordi ingen modell kan perfekt replikere alle funksjonene i menneskelig sykdom (2). De fleste etterforskere bruke mus for å modellere kols på grunn av likhetene mellom mus og mennesker i deres lungefysiologi, patologi, genetikk og metabolitter. Også, mus er relativt billig å studere, og både emfysem og liten luftveis ombygging utvikle innen 6 måneder CS eksponering (5,7-9).
Sigarettrøyk utløst KOLS: Flere metoder kan indusere KOLS hos mus. De fleste forskere utsette mus til CS, som er den viktigste etiologiske faktor for menneskelig KOLS. CS eksponering i 6 måneder forårsaker utvikling av emfysem og små luftveier remodellering (SAR) i mus, men alvorlighetsgraden av sykdommen som blir indusert, varierer avhengig av den murine stamme undersøkt. For eksempel NZWLacZ mus er resistente mot utvikling av CS-indusert emfysem mens AKR / J-mus er extremely sensitive (10). De fleste etterforskere studere C57BL / 6 belastningsskader mus i CS eksponeringsmodell som mange gen-målrettet mus er tilgjengelige i denne belastningen. Etter seks måneder med CS eksponering, emfysem og liten luftveis fibrose utvikle seg i villtype (WT) C57BL / 6 mus, og begge lesjoner er relativt mild alvorlighetsgrad (5,10). Forskere bruker to typer CS eksponering: nese-bare og hele kroppen eksponeringer. De største ulempene med nesen-bare eksponeringsteknikken er at: 1) det er en mer arbeidskrevende metode; og 2) mus har til å holdes igjen i små kamre som kan indusere en stressrespons og hypertermi hos dyr (11). Den store ulempen med hele kroppen eksponering (beskrevet her) er at dyrene kan innta (samt innhalere) nikotin og tjære produkter når de rengjør pelsen. Mus eksponert for helkropps CS har også lavere karboksyhemoglobinnivået og redusert tap av kroppsvekt sammenlignet med dyr eksponert for nese-bare CS (12).
<p class = "jove_content"> lungefunksjonstest (PFTs): Målinger av lunge compliance og elastance er vanligvis lik i C57BL / 6 villtype (WT) mus eksponert for luft eller CS for seks måneder på grunn av den relativt mild emfysem som oppstår når dette stammen er eksponert for CS (10). Imidlertid, når emphysematous ødeleggelse er mer alvorlig, økning i lungesamsvar og venstre skift i trykk-volum (PV) strømningssløyfer kan detekteres. Sistnevnte kan observeres, for eksempel i murine stammer som er mer utsatt for virkningene av CS (10), i CS-eksponerte C57BL / 6 strekk gen-rettet mus som har en mer alvorlig emfysem type enn C57BL / 6 WT mus (13), eller i CS-eksponerte mus utsatt for miljømessige endringer som gjør dem mer utsatt for virkningene av CS (14). Denne protokollen bruker et lite dyr ventilator å måle reduksjoner i elastisk rekyl av lunge (økninger i kvasistatisk lunge compliance [Cst] og reduksjoner i vevelastance [H]), PV flyt looper, og endringer i luftveiene og vev motstand i bedøvede mus (15,16).Tiltak av lungeemfysem: Analyse av emfysem utvikling i CS-eksponert C56BL / 6 belastning mus er utfordrende fordi fordelingen er romlig heterogene. Flere ulike metoder kvantifisere luftrom forstørrelse hos mus. Den første metode som ble brukt var den midlere lineære skjæringspunktet (L m) (17). Imidlertid er L-m-metoden en langsom, manuell prosess som ikke kan fange heterogenitet av sykdommen (hvis ikke alle deler av lungen er tilfeldig samplet) og dens bruk kan derfor innføre observatør skjevhet i analysen. Den destruktive indeksen [DI, (18)] kvantifiserer også luftrom utvidelse ved hjelp av et gjennomsiktig ark med 50 likt fordelte punkter plassert over en trykt digitalisert bilde av en hematoxylin og eosin-farget lungeseksjonen. De PI-metoden score Området rundt hvert punkt achold til i hvilken grad de alveolære kanaler og alveolære vegger innenfor dette området er ødelagt. Den største ulempen med DI-metoden er at den er tidkrevende og ikke mer nøyaktig enn andre metoder (19,20).
Denne protokollen tiltak medfører alveolar akkord lengde og alveolene på parafininnstøpte lunge seksjoner farget med Gills flekken. Morfometri programvare konverterer bilder av lunge deler til binære bilder (der vev er hvit og luftrom er svart), og deretter superimposes en ensartet rutenett av horisontale og vertikale linjer (akkorder) og programvaren deretter kvantifiserer lengden på hver akkord innenfor områder identifisert av programvare som luftrom. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, er det mulig å måle størrelsen av alveolene i alle deler av lungen i et standardisert og relativt automatisert måte (21).
Liten luftveis ombygging (SAR): Økt deponering av ECM proteiner (spesielt interstitial kollagen) rundt små luftveiene oppstår i CS-eksponerte dyr og bidrar til luftveisobstruksjon. Forskere ikke studere SAR i dyremodeller av KOLS så ofte som emfysem utvikling (22). For å kvantifisere SAR i CS-eksponerte mus, bruker denne protokoll programvare for bildeanalyse for å måle tykkelsen av laget av ECM-proteiner som er deponert rundt de små luftveier (luftveier med en midlere diameter mellom 300 og 899 m) i parafininnstøpte lungeseksjoner farget med Masson er Trichrome flekken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Francesca Polverino MD, stipendiat ved Brigham and Women Hospital for hennes bidrag til denne artikkelen, og også Monica Yao, BS, og Kate Rydell, BS for deres hjelp med murine dyrehold og utsette musene for sigarettrøyk.
Dette arbeidet ble støttet av Public Health Service, National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL111835, HL105339, HL114501, Flight Attendants Medical Research Institute Grant # CIA123046, Brigham and Women Hospital-Lovelace Respiratory Research Institute Consortium, og Cambridge NIHR Biomedical Research Centre.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
- Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
- Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
- Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
- Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
- Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
- van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
- Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
- Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
- Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
- Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The ‘destructive index’ in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
- Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
- Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
- McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
- Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).
