The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
bir model mükemmel insan hastalığı (2) tüm özelliklerini taklit çünkü KOAH çalışma hayvan modellerinde kullanılması zordur. Çoğu araştırmacı nedeniyle pulmoner fizyoloji, patoloji, genetik ve metabolitleri fareler ve insanlar arasındaki benzerlikler KOAH model fareler kullanın. Ayrıca, fareler çalışma nispeten ucuzdur ve amfizem ve küçük hava yolu yeniden hem CS maruz (5,7-9) 6 ay içinde gelişir.
Sigara dumanı kaynaklı KOAH: Çeşitli yöntemler farelerde KOAH neden olabilir. Çoğu araştırmacı insan KOAH için önemli etyolojik faktör olan CS, fareler maruz kalmaktadır. 6 ay boyunca CS pozlama amfizem ve farelerde küçük hava yolu yeniden (SAR) gelişimine neden olur, ancak bağlı olan hastalığın şiddeti okudu kemirgen gerginlik bağlı olarak değişir. AKR / J fareleri extremel vardır, oysa Örneğin, NZWLacZ fareler CS kaynaklı anfizemin gelişimine karşı dirençli olanHassas y (10). Çoğu araştırmacı gibi birçok gen hedefli fareler bu gerginlik mevcuttur CS pozlama modelinde C57BL / 6 suşu fareler çalışma. Sürekli maruz, amfizem ve küçük hava yolu fibroz 6 ay sonra yabani tip geliştirmektedir (WT), C57BL / 6 fareleri, her iki lezyonlar şiddeti (5,10) içinde nispeten hafiftir. Burun-tek ve tüm vücut maruz: Araştırmacılar CS maruz kalma iki türlerini kullanabilirsiniz. 1) Bir daha emek-yoğun bir yöntemdir;: burun sadece pozlama tekniği önemli dezavantajları olduğunu vardır ve 2) fareler hayvanlar (11) bir stres tepkisi ve hipertermi neden küçük odacıklarda ölçülü gerekir. (bu tarifnamede anlatıldığı gibi) tam gövde maruz önemli dezavantajı, bunların kürk temizlerken hayvanlar nikotin ve katran ürünleri (aynı zamanda inhale gibi) yutar olmasıdır. Tüm vücut dumanına maruz bırakılan fareler aynı zamanda daha düşük carboxyhemoglobin seviyeleri ve burun sadece CS (12) maruz kalan hayvan ile karşılaştırıldığında, vücut ağırlığı kaybı azalır.
<p class = "jove_content"> Solunum fonksiyon testi (SFT): Akciğer uyum ve elastansı ölçüleri genellikle C57BL / 6 yabani tip benzer (WT) nedeniyle bu geliştirir nispeten hafif amfizem 6 ay boyunca hava veya dumanına maruz bırakılan farelerde suşu CS (10) maruz kalmaktadır. Amfizem yıkım daha şiddetli Ancak, akciğer uyum ve basınç-hacim (PV) sol vardiya artışlar döngüler tespit edilebilir akış. İkincisi, C57BL / 6 WT farelere göre daha ciddi bir amfizem tip CS maruz kalan, C57BL / 6 streyn gen hedefli farelerde, CS etkilerine (10) karşı daha duyarlı olan fare suşlarının, örneğin, görülebilir ya da CS etkilerine (14) karşı daha duyarlı hale getirmek çevre değişikliklerine maruz CS maruz bırakılan farelerde (13). Bu protokol dokusunda akciğer elastik recoil (Yan statik akciğer uygun artar [Cst] azalma ve azalmalar ölçmek için küçük bir hayvan vantilatör kullanırelastisite [H]), PV akış döngüler, ve anestezi farelerin (15,16) hava yolu ve doku direnci değişir.Pulmoner amfizem Ölçüleri: dağıtım mekansal heterojen çünkü CS-maruz C56BL / 6 suşu farelerde amfizem gelişimi analizi zordur. Çeşitli farklı yöntemler farelerde bir hava boşluğu büyümesi miktarı belirlenir. Kullanılan ilk yöntem, (17) ortalama lineer ara parçası (L m) idi. Ancak, L m yöntemi (akciğerin tüm bölümleri rastgele örnekleme sürece) hastalık ve dolayısıyla analiz içine gözlemci önyargı tanıtmak olabilir kullanımı heterojen yakalamak olmayabilir yavaş, manuel süreçtir. yıkıcı indeksi [DI, (18)] aynı zamanda bir hematoksilen ve eozin lekeli akciğer bölümünün basılı sayısallaştırılmış resmin üzerine yerleştirilen 50 eşit dağıtılmış noktaları ile şeffaf bir sayfasını kullanarak hava sahasını büyütme rakamlarla. PI yöntemi puanları her nokta ac çevresiölçüde Cording olan bu alanda alveol kanalları ve alveol duvarları tahrip edilir için. DI yöntemin temel dezavantajı, zaman alan ve diğer yöntemler (19,20) göre daha doğru olmadığıdır.
Bu protokol önlemler Gill'ın boyası ile boyanmış parafin gömülü akciğer bölümlerinde alveol kiriş uzunluğunu ve alveol alanı demek. Morfometri yazılımı ikili görüntüleri akciğer bölümlerinin görüntüleri dönüştürür (ki doku beyaz ve hava sahasını siyah), ve daha sonra yatay ve dikey çizgiler (akorları) muntazam bir ızgara üst üste bindirir ve yazılımı daha sonra tespit alanlarda her akor uzunluğunu quantifies hava sahasını gibi yazılım. Bu yöntem kullanılarak, bir standart ve nispeten otomatik bir şekilde (21) akciğer her yerinde alveol boyutunu ölçmek mümkündür.
Küçük hava yolu yeniden (SAR): ECM proteinleri artan birikim (özellikle çatlaklarküçük hava yollarının çevresindeki l kollajen) CS-maruz kalan hayvanlarda oluşur ve tıkanıklık hava akımını katkıda bulunur. Araştırmacılar, amfizem geliştirme (22) olduğu kadar sık KOAH hayvan modellerinde, SAR deneyi değildir. CS-maruz bırakılan farelerde SAR ölçmek için, bu protokol küçük hava yolları parafine gömülü akciğer bölümlerinde (üst solunum yolları 300 ve 899 m arasında bir ortalama çapa sahip olan) yaklaşık yatırılır ECM proteinlerinin tabakasının kalınlığının ölçülmesi için görüntü analizi yazılımını kullanır Masson trikrom boyası ile boyandı.
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
The authors have nothing to disclose.
Biz bu makalede yaptığı katkılardan dolayı Francesca Polverino MD, Brigham bir Araştırma Görevlisi ve Kadın Hastanesi teşekkür etmek istiyorum, ve aynı zamanda Monica Yao, BS, ve Kate Rydell, kemirgen hayvancılık ve sigara dumanına maruz fareler ile yardım için BS.
Bu çalışma Halk Sağlığı Servisi, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibeler HL111835, HL105339, HL114501, Uçuş Hazirun Tıbbi Araştırma Enstitüsü Grant # CIA123046, Brigham ve Kadın Hastanesi-Lovelace Solunum Araştırma Enstitüsü Konsorsiyumu, ve Cambridge NIHR Biyomedikal tarafından desteklenen Araştırma Merkezi.
Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
Scion Image Program | Scion Corporation | ||
Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |