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Neuroscience

神経細胞型の表面のためのフローサイトメトリーのプロトコルおよび細胞内抗原解析

doi: 10.3791/52241 Published: December 18, 2014

Introduction

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フローサイトメトリーを広範囲に固有の散乱特性、細胞表面抗原の発現、および他の蛍光パラメーター1-3を介して細胞集団を定義するために、免疫学、血液学および腫瘍学に ​​おいて利用されてきた。血液系統の開発および疾患に私達の洞察は、その初期の実装4,5の後にこの方法論の連続洗練の有意な程度の結果である。フローサイトメトリーの定量的および全体的な分析的な潜在意識の高まりは、最近、幹細胞研究におけるそのより広範な使用を奨励している短い時間枠6と同様に深い進歩を可能にすることができる。しかし、特に神経集団を分析し、単離するためのフローサイトメトリーの適用は、長い挑戦として認識されている。当然、懸濁液中に存在する造血細胞とは対照的に、神経細胞型は、典型的には、グリアおよび様々Oを含んでいてもよい過度に複雑なソースから収穫するTHER周囲の細胞ならびにプロセス有利子ニューロンの複雑なネットワーク。したがって、神経生物学、毎日研究ルーチンでの完全な電位にフローサイトメトリーの多様性を実現するために至っていない。しかし、神経生物学における分析レパートリーの貴重な要素とみなすことができる限り、生存単一細胞懸濁液を生成することができる(およびプロトコルは、その目的の7のために考案し、最適化されている)として、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別(FACS) 8-11。

図1
流体工学、光学、エレクトロニクス: フローサイトメトリー分析フローサイトメーターの構成要素の、図1の原理フローサイトメーターは、3つの主要な系を含む。 (一次組織から、またはインビトロ培養中で調製)懸濁液中の細胞の層流をシースfluiによって達成される流体力学経由dは、その中心コアにサンプルを限定フォーカシング。光学部品は、適切な検出器に信号を導く細胞および光学フィルタのストリームを照らすレーザーで構成されている。検出された光信号は、電気信号に変換し、その後、コンピュータで処理し、データ分析とゲーティングのためのモニター上で可視化されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

サイトメーターのビルディングブロックを含む根本的なファンダメンタルズの少なくとも基本的な理解から、フローサイトメトリー法利益のユーザーは、(レビューのために12,13を参照してください。また、 図1を参照)。レーザビームは、次に、「単一のファイル」次々レーザビームを通過懸濁液中の細胞を含み、流体力学的に集束流体の流れと交差する。 interceptiこの呼掛け点からの光の散乱レーザ結果と細胞(またはそのことについては、他の粒子)の上。散乱光は、レーザー方向(粒の大きさに関連付けられた前方散乱)、ならびにその方向に垂直な(;粒子/細胞のgranulosityを反映する側方散乱)を連続して検出することができる。これらの前述の散乱特性は、(またまたは細胞破片、空気の泡、 など )、非標識試料は、一般的に最初のゲーティングのために使用される側方散乱プロット変量前方散乱の信号(イベント)が生成されますなぜ特異的標識を必要としない。適切なレーザ及び対応する励起および発光スペクトルのために特定のフィルタを使用することにより、細胞は、その陽性、強度のレベル、または蛍光マーカーの非存在について分析することができる。フローサイトメトリー用途の大部分は、細胞表面抗原を介して特性評価に焦点を当てている。造血lineagとは異なり、eは、神経系統は、表面エピトープの発現パターン5によれば以下広く定義されて残っている。表面抗原を利用することの利点の一つは、生きている細胞は、FACSなどのパラダイムを選別細胞を施すことができることである。これとは対照的に、細胞内抗原の染色は、生細胞を必要とする下流の適用を排除する、エピトープ - 抗体相互作用を媒介するために固定および透過手順が必要です。注目すべきは、このようなアプローチは、まだ数多くの定量的アッセイ14だけでなく、RNAとタンパク質発現の15のための下流の分析を可能にします。血液学、免疫学および腫瘍学は、多くの場合、特定の部分集団16を定義するために連携してダース以上のマーカーを使用してきた。さらに、質量フローサイトメトリーまたはCyTOFは現在30のパラメータを同時に17,18まで分析することができる。

神経幹細胞の用途、ならびに初代培養物における細胞の不均一性のために14,19,20体外は一般的な現象で21-23です。興味のある標的集団を代表していない細胞は、実験的な読み出し24,25のための潜在的交絡因子を具現化。好都合には、不均一な細胞懸濁液中に存在する異なる細胞のサブセットは、これらの様々な集団を定義するために利用することができる抗原の発現プロファイル、(既知の、またはまだ解読する)別個に耐える。したがって、細胞の不均一性を解決する際に重要な役割を果たし、それによって、(in vitroアッセイ 、細胞療法における )生物医学的適用を容易にし、最も関連性のサブセット24,26に着目して定量的な読み出しを最適化することができるフローサイトメトリー。種々の表面抗原の組み合わせは、特定の神経細胞型の定量および単離を可能にするために、過去数年にわたって確認されている。これは、神経幹細胞27、NSCの単離のためのCD15 / CD24 / CD29表面抗原の組み合わせの濃縮にCD133を含み、差異他の署名29,30の中で、神経およびグリアサブセット25を分離するためのテッドニューロンと神経堤細胞28またはCD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271。ニューロンを超えて、グリアマーカーは、A2B5 31、CD44 25、NG2 32とGLAST 33が含まれいます。最近の出版物は、パーキンソン細胞移植におけるドーパミン作動性前駆体を濃縮するために、中脳底板前駆体マーカーコリン34,35を36パラダイムに利用している。 CD分子は、マーカーが、細胞-細胞相互作用および細胞外マトリックス分子および成長因子37からの合図に応答する細胞の能力の機能的に関連するメディエーターだけではない。さらに、神経系統の発達を特徴づけるために、コンビナトリアルCD抗原の武器を強化する一つの戦略は、目的の特定の細胞型のためのCD抗原の組み合わせをスクリーニングし、定義することが知られている細胞内マーカーを使用することである。我々は最近、このようなアプローチを悪用し、CD4を特定した9F - / CD200神経に分化誘導された多能性幹細胞培養系38からのニューロンのサブセットを豊かにするための新しいアプローチとして高い組合せ発現パターン。ここでは、表面染色および細胞内染色は、フローサイトメトリーにより神経細胞の亜集団を定義するために同時に使用することができる後者のプロトコル(およびその任意の変形)を議論する。

図2
実験プロトコルオプションの図2のフロー図は図は、プロトコルに関与する主要な工程の概略図を示している。任意の工程(CFSE色素または細胞内抗原の標識は)ライトグレーのボックスで示されます。収穫後、細胞表面染色の前に、神経細胞懸濁液の生存度および細胞数を評価することが不可欠である。陽性と同様にネガティブコントロールは、対象のサンプルに加えて、含まれる必要がある。サンプルは、フローサイトメトリー分析によって分析および/ ​​または細胞ソーティングパラダイムで使用することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

我々は以前に細胞内染色38二次抗体と組み合わせて一次抗体を使用しているが、我々は今、それによって細胞操作39のステップを減らす、わずかな変化などの蛍光Fab断片(Zenon標識)を介して一次抗体の非共有結合標識を導入する。また、プロトコルの汎用性のさらなる例としては、抗原染色表面の前スクシンイミジルエステル(CFSE)のカルボキシフルオレセインずつの実験のサブセットの任意の標識を使用する。このようなCFSEプレ標識は(2つの細胞株または実験条件の即時の直接比較を可能にする CFSE標識。分散またはインキュベーション時間の微妙な違いを削減し、抗体を保存する、単一のサンプルチューブ内で)標識されていない。 CFSEは、一般的に増殖41,42及びバーコード実験43,44において、細胞追跡40のために使用される確立された蛍光色素である。最後に、ここで説明収穫とラベル付けの手順は実行し、実際のソート·ステップ(FACS、免疫磁気細胞分離またはイムノ)は原則的に、このプロトコルの一部ではありませんが、降伏抗原表面受けることができるサンプルまたは細胞内のラベルベースの​​並べ替えのアプリケーション15 25,28。

この記事では、我々はを目指し:として細胞内のCFSE色素標識工程41,45を提示 、細胞内の標的の検出のためのプロトコルとしてだけでなく、組み合わせた表面と細胞内の抗原解析38をまとめ、実行可能な表面抗原染色プロトコル25,28をまとめるcomのための実験的なオプションparativeは、神経細胞集団の解析、およびサイトメトリー分析を(適切なコントロール13,46、戦略およびデータプレゼンテーション47をゲート制御)流れるようにアプローチをまとめる。

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Protocol

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1.神経細胞の回収

  1. 顕微鏡による評価:
    1. 実験を開始する前に、明視野または位相差顕微鏡による培養物の状態を確認。
      注:解剖から得られた一次神経組織ではあるが、原則的に、均等に影響を受けやすいサイトメトリー分析14,28を流れるように、プロトコルの焦点はインビトロ神経細胞システムから得られた細胞であることに注意してください。
  2. 収穫細胞7:
    1. RT( 例えば 、T75フラスコに5 mlの6ウェルプレートにウェル当たり3ミリリットル、または10 mlの優しく/ Ca 2+のMgを有する接着細胞の皿/フラスコを洗浄2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS) 10cmディッシュ)。
      注:PBSをプロトコル全体で使用さは、Mg 2+ / Ca 2+の自由である。
      1. ビデオ例えば、80%のコンフルエンシーでSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞のT75フラスコを使用する。例ここで追加の洗浄工程を適用しますかなりの破片が皿の中の存在である。
      2. 血清アルブミンを含むPBS 48を 、パーコール、またはフィコール49遠心分離勾配および/ ​​または市販のビーズ50,51との洗浄を考慮してください。ミエリンおよび他の脂質または他の汚染物質の除去は、成人原発組織源が使用されている場合は特に重要である。
    2. 組織培養容器の表面全体を覆​​って適切な音量で予め温めておいた(37℃)トリプシン置換を加える。
      注:あるいは、のAccutaseまたは他の酵素消化のオプションを検討してください。この重要な工程は、負(7参照)表面エピトープの発現に影響を及ぼし得る。
    3. 細胞は切り離すことができるように(細胞型に応じて)を5分間2 - 37℃で皿/フラスコをインキュベートする。静かに細胞を取り除くために、血清学的ピペットで組織培養容器またはフラッシュをタップします。 (このように、後の工程での細胞の損失および凝固を引き起こす可能性があります)消化の上は避けてください。
    4. Q二回フローバッファー(PBS中の2%FBS)の体積を添加することによりトリプシン交換uenchし、15mlコニカルチューブ中で細胞を集める。
    5. 単一細胞懸濁液を調製するために - (1,000μlの100)または5ミリリットルの血清学的ピペットを穏やかにマイクロピペットを用いて細胞懸濁液を粉砕する。
    6. 25℃で5分間、220×gで細胞を集める。慎重に後ろにペレットを残して上清を吸引除去する。
    7. フローバッファの適切な体積でペレットを再懸濁ペレット( 例えば、サイズに応じて、SH-SY5Y細胞の一つコンフルエントT75フラスコのための典型的な収率は、少なくとも10×10 6個の細胞を、ケース内のセルであるフロー緩衝液5ml)中に再懸濁する。
      注: - 100μmのメッシュ大きなチャンクまたは凝固が認められた場合、30を介してフィルタリングする。
  3. 52を数えるセル:
    1. trは、体積で定義された比率で微量遠心管に細胞懸濁液の少量のアリコートを移し、希釈血球計または自動細胞計数システムへの転送前にypan青または代替可能性染料。
    2. (CFSE標識に進む場合)0.1%BSAでフローバッファーまたはPBSの適切な体積を添加することによって、1×10 6生細胞/ mlの濃度の細胞懸濁液を希釈する。
      NOTE:ヨウ化プロピジウム、7-アミノD、アネキシンV及び市販の固定可能な生存率アッセイキットは、細胞の生存率を評価するための代替オプションを表す。また、先に記載53のようにカスパーゼ3蛍光を用いてアポトーシスアッセイを使用することができる。蛍光チャネルは、すべてのサンプルに含まれている場合、後続のステップのためのオプションが制限される場合があり、これらの試薬により「占有」されます。

CFSEを使用して2細胞内の色素の標識(図3)

  1. 容易に使用することができ、所望のストック濃度にCFSE希釈する。
    注:これらの実験のためのストック濃度0.01ミリモルを用いた。経験的にCFSEの最適な使用濃度を決定します。
  2. 0.1μMの最終濃度のために細胞( セクション1.3.2、PBS + 0.1%BSA中1×10 6細胞/ mlの濃度)の1mlあたり0.01 mMのCFSE溶液10μlを追加します。簡単に言えば渦はよく混合する。
    注:ここで使用CFSE濃度は、一般的に増殖アッセイに適用されるものよりも約10倍低い、染料のため、細胞毒性は最小限に抑えられます。我々は、細胞の生存率にマイナスの効果を観察しないでください。
  3. 絶えず振盪(200rpm)しながら室温で5分間インキュベートする。光から保護します。
  4. チューブに流れバッファの5ボリュームを追加することで染料を消光。 RTで5分間94×gで遠心分離する。
  5. 背後にペレットを残して上澄みを捨てる。フロー·バッファの5ボリュームで細胞を再懸濁する。
  6. RTで5分間94×gで遠心分離する。 / 1×10 6細胞の濃度で上清を、フロー緩衝液中の再懸濁細胞を捨てるミリリットル。
  7. 染色された細胞懸濁液に興味のある非染色細胞の数と同じ数を追加します。抗原染色プロトコル( 第3節表面に進みます。

図3
CFSE色素標識を介して2つの細胞株の間の差動CD表面抗原発現の図3の検出。SH-SY5Y神経芽腫細胞を非標識BJ線維芽細胞と比較して、後続の識別のためCFSEで予め標識されている。表面マーカーCD24またはCD54(APCへの結合の両方)との混合試料(右パネル)の共染色は、細胞株によりCFSE染色(;矢頭= BJ線維芽細胞の矢印= SH-SY5Y)に容易に識別可能であることを示している。 SH-SY5Y細胞の大多数は、CD24ではないCD54(ICAM-1)を発現する。これとは対照的に、BJ線維芽細胞(CFSE陰性)は、CD54陽性であるが、CD24のための大部分はネガティブ。「https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

3.細胞表面染色

  1. サンプルおよびクリティカルコントロールを含むラベルチューブ( 表1参照)。
チューブなし。 サンプル名抗原フォア希釈
1 非染色細胞 -
2 シングルステンド CD24-APC 午前1時50分
3 シングルステンド TUJ1-アレクサフルオロ488 1:2000
4 ステンドダブル CD24-APC 午前1時50分
TUJ1-アレクサフルオロ488 1:2000
5 シングルステンドセカンダリのみ:アレクサフルオロ488 1:2000

典型的なフローサイトメトリー実験に含まれるチューブの表1. Lイスト。表には、このビデオの記事で説明した共染色実験に必要なサンプル管の最小セットを示しています。理想的な実験は、得られた結果の正確な解釈のために必要なすべての(正、負、ならびに補償制御)の制御を含む必要がある。

  1. セクション2.7または1.3.2からの)各1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに100μlの細胞懸濁液を追加します。
    注:必ず、0.1×10 6細胞の最小値は、細胞懸濁液100μlあたり存在していることを確認します。
  2. 適切な希釈でサンプルにフォアコンジュゲートした抗体を追加します。
    注:実験前に各抗体の作業希釈を決定します。リストOについては、表2を参照してくださいF神経表面抗原。
抗原細胞型リファレンス
CD15 神経幹細胞 [28、67]
CD24 神経細胞 [28、68]
CD29 神経幹細胞 [28、69、70]
CD44 グリア細胞 [25]
たCD49f 神経幹細胞 [38]
CD56(NCAM) 神経細胞 [71]
CD133 神経幹細胞 [27]
CD184 神経幹細胞およびグリア細胞 [25]
CD200 神経細胞 [38]
CD271 神経堤幹細胞
A2B5 グリア細胞 [31]
コリンドーパミン作動性前駆体 [35、36]
FORSE1 神経幹細胞(NSC) [72]
GLAST グリア細胞 [33]
NG2 グリア細胞 [32]

神経表面抗原の表2の選択。この表は、神経系統を特徴づけるために使用される表面抗原の増加パネルを例示するために、様々な神経細胞タイプによって発現されることが見出され、表面エピトープのリストを提供する。この選択が完了し、これらのマーカーのほとんどは、他の神経および非神経細胞の範囲で表現されていることをほど遠いであることに注意してください。したがって、いくつかのマーカーの組み合わせは、より良い示さ神経サブセットを定義し、単離するために必要とされる。

    暗闇の中でオービタルシェーカー(200 rpm)で30分間インキュベートする。
  1. フロー緩衝液洗浄
    1. チューブに流れ緩衝液1mlを追加します。 4℃で4分間380×gで遠心し。
    2. 背後にペレットを残して上澄みを捨てる。
  2. 再び洗浄ステップを繰り返します。
  3. 2回目の洗浄の後、上清をデカントし、100μlの最終容量に流れバッファー中で細胞を再懸濁する。
  4. フローサイトメトリー分析のためのサンプルを使用してください。また、 第4節5に進みます。
    注:細胞が選別し、培養後のFACSに戻されるべきである場合( つまり、固定または透過処理せずに実行可能な細胞懸濁液)は、収穫、染色および分析ステップの間に無菌技術を適用します。

4.固定および透過38

  1. パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して固定。
    1. PBS中の2%PFAを含む固定バッファを準備します。
    2. 細胞懸濁液100μlに固定緩衝液500μlを追加。
    3. 暗闇の中でオービタルシェーカー(100 rpm)の上で室温で15分間チューブをインキュベートします。
  2. PBS洗浄。
    1. チューブに1mlのPBSを追加します。 4℃で3分間380×gで遠心し。
    2. チューブに約100μlのを残して上清をデカント/捨てる。
  3. Tween-20を持つ透過化:
    1. PBS中の0.7%のTween-20を含む透過化バッファを準備します。
    2. 細胞懸濁液100μlに透過化緩衝液500μlを追加。
    3. 暗闇の中でオービタルシェーカー(100 rpm)の上で室温で15分間チューブをインキュベートします。
  4. (4.2節で説明したように)をPBSで細胞を1回洗浄し、チューブのcoから上清を除去mpletely、背後にある唯一のペレットを残す。

5.細胞内抗原染色38(図4)

  1. 一次抗体溶液の調製:
    1. 1%ウシ血清アルブミン、10%血清( 例えば、正常ロバ又はヤギ血清)および0.5%Tween-20をPBS中に含有する希釈緩衝液中の一次抗体を希釈する。
      注:二次抗体がで提起された種に応じて、使用する血清を選択してください。
    2. また、メーカーの指示に従って、一次抗体のゼノンフルオレセイン標識を使用しています。
      1. 適切な希釈(20μlの≤総量)でPBS中に一次抗体1μgのを準備します。
      2. 抗体溶液にゼノンフルオレセインのIgG標識試薬(成分A)の5μlを添加する。
      3. RTで5分間混合物をインキュベートする。
      4. 反応混合物にゼノンブロッキング試薬(成分B)の5μlを添加する。
      5. インキュベートRTで5分間混合。 30分以内にサンプルに抗体を適用します。
  2. 一次抗体染色:
    1. 細胞ペレットに一次抗体溶液100μlを加え、穏やかに混合するために粉砕する。
    2. また、適切な希釈で細胞懸濁液にゼノンのフルオレセイン標識抗体を追加。
    3. 光から保護し、オービタルシェーカー(200rpm)し、上で室温で30分間チューブをインキュベートします。 (セクション4.2で説明したように)、PBSで細胞を1回洗浄し背後にある唯一のペレットを残して、完全にチューブから上清を除去。
  3. (ゼノンフルオレセイン標識抗体には必要ありません)二次抗体染色:
    1. 適切な濃度でPBS中に二次抗体を希釈する。
    2. 細胞ペレットに二次抗体溶液100μlを加え、穏やかに混合するために粉砕する。暗闇の中でシェーカー(200 rpm)の上で、室温で30分間チューブをインキュベートします。
  4. (4.2節で説明したように)PBSでサンプルを2回洗浄します。
  5. フロー緩衝液で1回洗浄する(3.5節を参照)。
  6. フロー·バッファの約150μlの細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで分析する。

図4
表面および細胞内タンパク質の、図4の共染色。フローサイトメトリーのデータの一次+二次抗体ベースの表面染色と組み合わせたゼノンフルオレセインベースの細胞内染色の対の間の比較を例示する。 y軸(左上象限)及びx軸(右下象限)の排他的陽性はそれぞれ、MAP2およびCD24について染色した細胞を示す。共染色した後、共有MAP2及びCD24の発現は、右上象限(右パネル)に見ることができる。使用しての比較アレクサフルオロ488。MAP2標識利回り同様の結果のためのゼノンフルオレセイン(下)対(上AF488) この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

6.フローサイトメトリー分析

  1. 信号検出のための適切なフィルターを、フローサイトメーターを用いて染色プロトコルの完了直後にフローサイトメトリー分析を行う。 FL-1(30分の533)、FL-2(40分の585)、およびFL-4(25分の675)バンドパスフィルタと488nmの青と640nmの赤色レーザーを使用してください。
  2. 破片および死細胞を除く前方および側方散乱に基づいて主ゲートを設定します。
  3. 未染色標本とシングルステンドコントロールを使用して、スペクトルの重複のための補償に基づく≤0.5%に表面と細胞内抗原のための蛍光ゲートを設定します。

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Representative Results

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ここで紹介するプロトコルは、汎用性の実験的アプローチ( 図2)を可能にします。その短いバージョン(1、3、6ステップ )においては、表面抗原の単純な染色のためのガイドと考えることができる。そのより複雑な形態において、細胞内抗原の範囲で共標識パラダイムの数は(2および/ ​​または4〜5の任意の工程 )を追求することができる。また、CFSE標識工程は、細胞-細胞相互作用の研究またはフローサイトメトリーバーコード実験( ステップ2)における集団の細胞標識/追跡のための有用性を例示する。 ( ステップ2及び/又は3から得られた)、生存細胞集団は、細胞選別パラダイム(FACS)およびポストソート細胞培養を含む下流の分析に適している。一方、組み合わせた細胞表面抗原染色(3〜5ステップ )独自の権利で、分析読み出しの機会を提供します。例えば、( -ニューロンのFACS用/ CD200 高い署名のCD49fを識別するためにTuraç 38で私たちによって適用)の神経細胞集団の特定のサブセットに特定のCD抗原の共局在を特定する。これらおよび他の例は、神経マーカーは、CD15、CD29、のCD49fとFORSE1は、主に神経幹細胞と関連しているが、表2に設けられており、CD24及びCD56は、神経細胞に豊富に存在している。これらのマーカーのいくつかは、排他的であるが、異なる染色強度および多変量発現分析は、特定の神経集団の分析および単離のための特定のマーカーセットを識別するのを助けることができる。

図3は、細胞内の色素および表面染色の組み合わせの使用から得られた典型的な結果を例示している。データは、2つの異なる細胞集団が容易に私を区別することができる方法を示してNAが原因集団の1の標識前にサンプルを混合する。ここでは、SH-SY5Y神経芽腫細胞をCFSEで標識し、そして蛍光を示す緑のチャンネル(FL1; y軸)この場合BJ線維芽細胞において、染色されていない第二の集団から明確に分離されている。十分に確立された特性線維芽細胞(CD54)しながら、神経(CD24)マーカーは、(それらのそれぞれの標的集団上に存在する; FL2またはFL4蛍光は、それぞれ、x軸)に示されている類似のアプローチは、追加の未同定の抗原をスクリーニングするために利用することができる。さらに、従来共培養実験に標識された2つ(以上)の細胞 - 細胞相互作用の効果の亜集団は、この方法で研究することができる。

図4に、未染色SH-SY5Y細胞ならびに固定および透過後のCD24-APCおよび/ ​​または細胞内の神経MAP2抗原(FITCチャネル)について染色したサンプルを示しています。後者は、学士の散乱特性に影響を与えることができるようにckground蛍光および表面エピトープの染色は、プロットは、細胞内染色後の神経CD24の表面発現維持を文書化するのに役立つ。また、CD24陽性分画上の神経MAP2染色の共局在が示されている。これは、生細胞上のCD24表面発現と比較することにより表面抗原の忠実な検出を保証するために重要である。また、細胞内のバックグラウンドを超える検出、非特異的抗体結合および自己蛍光の特異性を確認する必要がある。ゼノンの蛍光ベースまたは二+一次抗体ベースの戦略を介した細胞内抗原の検出は、同等の結果が得られ、( ステップ5.3を飛ばし )このより時間効率的なアプローチを検討するための理論的根拠を提供する。プロトコルは堅牢で、表面と限定されたバックグラウンド蛍光を持つ細胞内マーカーの範囲の組み合わせを検出することができるが、それは密接にインキュベーション時間および洗浄ステップを遵守することをお勧めしますプロトコルで提供。また、少なくとも3つの独立した実験の反復を分析し、標識強度、表面エピトープの安定性はマーカー特異的であることができ、更なる最適化を必要とするかもしれないことに注意することが望ましい。一度特定の標的のために確立さ、形態学的特徴を分析する能力を欠いているにもかかわらず、単独のフローサイトメトリー表面の検出および細胞内抗原又は細胞内抗原は、従来の蛍光顕微鏡と互換性がある。

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Discussion

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ここに提示されたプロトコルがよくヒト幹細胞由来の神経細胞培養のために確立されているが、同様の一次組織または神経細胞株を含む他の神経細胞供給源に適用することができる。胚のソースに加えて、神経幹細胞または前駆細胞は、成人の脳27の神経原性領域から抽出することができる。また、フローサイトメトリーおよびFACSが成熟ニューロン54、アストロ33、ミクログリア55、オリゴデンドロサイト56、または出生後の脳組織からの内皮細胞57を含む様々な細胞集団を定量分析し、単離するために利用することができる。

手順のいずれかの過剰なフローサイトメトリーの読み出しに影響を与える散乱特性の大規模な変化につながる可能性に関係なく、ソースの、固定および透過化のための最適条件は、実験的に各細胞型について決定される必要がある。プロトコルの効率もSTABILに依存表面分子のityが透過処理を投稿。これは、異なる表面エピトープは、種々の程度の手順の一部として細胞操作によって影響され得ることに留意すべきである。またトリプシン置換またはリベラーゼ-1の酵素収穫は、例えば、細胞表面エピトープの範囲に影響を与えるかもしれないが、のAccutaseまたはパパイン7の使用に比べて程度は低い。

特定のエピトープは、様々な程度に同一の治療パラダイムによって影響を受ける可能性がある:VCAM-1(血管細胞接着タンパク質1; CD106)はながら非常に敏感な方法で収穫、解離、固定および透過の影響を受けることができ、ICAM-1(細胞間接着分子1; CD54)は、手順58を通じて保存、より堅牢な発現パターンを表示することがあります。

以前にいずれかの表面25,28または細胞内抗原のラベル14は、神経生物学のパラダイムで適用されているが、両方のMを組み合わせる近づい小説の神経表面抗原候補をもたらすと追加メトリー読み出しオプションを提供することができます38 ethods。

我々は、日常的に細胞内抗原の染色の前に表面染色工程を実施し、ヒト神経細胞株の範囲を使用してneuropoiesis 38表面マーカーの我々のセットを拡張するためにこの戦略を使用している。抗体およびインキュベーション時間の滴定は、各細胞型、標的エピトープと実験パラダイムのために最適化される必要がある。すべての細胞株は、CFSE濃度は、同量の同じ方法で染色と同様に、CFSE濃度および染色ごとに使用される細胞の量は、各細胞株について最適化されなければならない。

(; FL-1検出器緑チャネル)、したがって、他のチャネルへの蛍光スピルオーバーが特定の蛍光発光を測定するために補償する必要があるCFSEピーク494nmでの励起および521nmでの発光ピークを有している。 Ce等の代替染料トレースバイオレット(CTV)LL、細胞増殖染料eFluor 670(CPD)、ホライゾンV550、V450ホライゾンに成功しようとしたCFSE 59,60の代わりに使用することがテストされています。

フローサイトメトリーでは、バックグラウンドからの実際の具体的な蛍光シグナルを決定するために重要である。したがって、最も適切なコントロールは慎重に選択する必要があり、抗体の特異性を強調する非神経または他の陰性細胞株を使用することを含むことができる(いわゆる内部陰性対照38,46呼ばれる)。それぞれの細胞源の自己蛍光を考慮しなければならない。ほとんどの神経細胞の検出は、13,46のパラダイムでアイソタイプ対照は、主に不要と考えることができる。

細胞培養系で観察されたかなりの変化(幹細胞由来特に)与えられたと染色手順のため、生物学的複製を含めることを強くお勧めします。それは、遺伝子レポーターの使用があることに留意すべきである61,62サイトメトリ神経の流れを使用するための他の方法。最近、Maroof らは、ヒト胚性幹細胞63とは異なる皮質のような神経細胞の亜集団をソートするNkx2.1-GFPレポーターのアプローチを使用していました。

これからのアップ·アンド·フィールドは、腫瘍生物学と神経変性64など多様な生物医学分野での神経エキソソームの探査で表され、エキソソームのフローサイトメトリーまたはビーズベースアッセイによるそれらの単離は、このクエスト65のための重要なツールを提供している。関連ビデオプロトコルの場合は66を参照してください。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Life Technologies 11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+ Life Technologies 14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x) Life Technologies 11140035
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250061
Paraformaldehyde Carl Roth 335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V PAA Laboratories, Coelbe K41-001
Tween-20 Detergent Calbiochem 655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eBioscience 65-0850-84
DMSO AppliChem A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml Millipore SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25) NUNC 156367
Cell culture treated flasks (T 75) NUNC 156499
Conical tubes (15 ml) Greiner Bio-One 188271
Conical tubes (50 ml) Greiner Bio-One 227261
Pasteur pipet, glass (150 mm) STEIN Labortechnik, Remchingen S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl) Corning 4125
Pipet tips (1-200 µl) Corning 4126
Pipet tips (100-1000 µl) Corning 4129
Serological pipets, 5 ml Corning 4051
Serological pipets, 10 ml Corning 4101
Serological pipets, 25 ml Corning 4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) Sarstedt 72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Greiner Bio-One 616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) Sarstedt 72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody eBioscience 17-0247-42 Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody eBioscience 12-0549-42 Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody Covance PRB-435P Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit Life Technologies A21206 Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit Life Technologies Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber Marienfeld 0640010
Vortex Scientific Industries G560E
Thermomixer comfort Eppendorf 5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer Becton Dickinson (BD) 653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R Peqlab 91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC Hettich 4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 Thermo Scientific 51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i Thermo Scientific 51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort Integra Biosciences 158320
Microscope, Axiovert 40 CFL Zeiss 451212
Pipet controller, accu-jet pro Brand 26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) Gilson F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) Gilson F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) Gilson F144566

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神経細胞型の表面のためのフローサイトメトリーのプロトコルおよび細胞内抗原解析
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Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).More

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).

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