We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.
Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.
Cytometry זרימה נוצל בהרחבה באימונולוגיה, המטולוגיה ואונקולוגיה להגדיר אוכלוסיות תאים באמצעות מאפיינים פנימיים פיזור, ביטוי אנטיגן שטח פני תא, ופרמטרים אחרים הקרינה 1-3. תובנות שלנו לפיתוח שושלת דם ומחלות הן תוצאה למידה משמעותית של העידון המתמשך של מתודולוגיה זו לאחר 4,5 היישום לראשונה שלה. הגברת מודעות לפוטנציאל האנליטי כמותיים והכולל של זרימת cytometry לאחרונה עודדו את השימוש הנרחב יותר שלה במחקר בתאי גזע ועשויות לאפשר התקדמות דומה עמוקה במסגרת זמן קצרה יותר 6. עם זאת, היישום של הזרימה cytometry לנתח באופן ספציפי ולבודד אוכלוסיות עצביות נתפס עוד מאתגר. בניגוד לתאי hematopoietic שקיימים באופן טבעי בהשעיה, סוגים עצביים תא נקצרים בדרך כלל ממקורות מוגזמים מורכבים שעשויות לכלול גליה וo השונותיס תאים המקיפים כמו גם רשת סבוכה של תאי עצב נושאות תהליך. כתוצאה מכך, נוירוביולוגיה טרם ליישם את הרבגוניות של הזרימה cytometry לפוטנציאל המלא שלה בשגרת מחקר יומית. עם זאת, כל עוד השעיה תא בודדת קיימא יכולה להיות שנוצרה (ופרוטוקולים כבר המציא ומותאם במיוחד למטרה זו 7), cytometry זרימה ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) יכול להיחשב מרכיב חשוב ברפרטואר האנליטיות בנוירוביולוגיה 8-11.
. Cytometers עיקרון איור 1. ניתוח cytometric זרימה ורכיבים של cytometer זרימת זרימה יורכב משלוש מערכות עיקריות: fluidics, אופטיקה ואלקטרוניקה. זרימה יעילה של תאים בתרחיף (שהוכנה מרקמות ראשוניות או בתרבות חוץ גופית) מושגת על ידי flui הנדןד באמצעות הידרודינמית התמקדות, המגביל את המדגם למרכז הליבה שלה. החלקים האופטיים מורכבים מלייזרים שמאירים את הזרם של תאים ומסננים אופטיים המכוונים את האות לגלאים המתאימים. אותות האור זוהו מומרים לאותות אלקטרוניים, מעובד לאחר מכן על ידי מחשב ודמיינו על צג לניתוח נתונים וgating. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
משתמשים של רווח שיטות cytometric זרימה מלפחות הבנה בסיסית של היסודות הבסיסיים כוללים אבני הבניין של cytometer (לסקירה ראה 12,13; גם ראו איור 1). קרן לייזר מצטלבת עם זרם fluidic hydrodynamically ממוקד המכיל את התאים בתרחיף, אשר בתורו לעבור בקרן הלייזר ב'קובץ יחיד "בזה אחר זה. Interceptiבתא (או כל חלקיק אחר, לצורך העניין) עם תוצאות הלייזר בפיזור של אור מחקירת נקודה זו. אור מפוזר ניתן לאתרם בהמשך לכיוון הלייזר (הפיזור קדימה, הקשורים לגודל של החלקיקים), כמו גם בניצב לכיוון שלו (פיזור הצד; המשקף את granulosity של החלקיקים / התא). מאפייני הפיזור האמורים אלה אינם דורשים תיוג ספציפי, ולכן מדגם ללא תווית (או גם פסולת תאית, בועות אוויר, וכו ') יפיק אות (אירוע) על הפיזור קדימה bivariate לעומת פיזור עלילה בצד משמשת בדרך כלל לgating הראשוני. על ידי שימוש בלייזרים ומסננים ספציפיים לספקטרום עירור והפליטה המתאים המתאימים, תאים ניתן לנתח לחיוביות שלה, רמת האינטנסיביות, או היעדרם של סמני ניאון. רוב יישומי cytometric זרימה התמקדו באפיון באמצעות אנטיגנים פני תא. בניגוד לlineag hematopoieticדואר, השושלת העצבית נשארה מוגדרת פחות בהרחבה על פי דפוסי ביטוי epitope משטח 5. אחד יתרונות של ניצול אנטיגנים פני השטח הוא שיכולים להיות נתונה תאי חיים ועד לתא פרדיגמות מיון כגון FACS. בניגוד לכך, מכתים אנטיגן תאיים דורש צעדי קיבעון וpermeabilization לתווך את האינטראקציה epitope-נוגדן, המונע יישומים במורד הזרם שדורשים תאי קיימא. ראוי לציין, גישות כאלה עדיין לאפשר למבחנים כמותיים רבים 14 וכן ניתוחים במורד הזרם לRNA וחלבון ביטוי 15. המטולוגיה, אימונולוגיה ואונקולוגיה השתמשו לעתים קרובות יותר מתריסר סמנים בשיתוף להגדיר תת-אוכלוסיות מסוימות 16. בנוסף, cytometry ההמוני או CyTOF כעת ניתן להשתמש כדי לנתח עד 30 פרמטרים בו זמנית 17,18.
עבור יישומי תאי גזע עצביים, כמו גם תרבויות עיקריות 14,19,20 ההטרוגניות של תאים במבחנה היא תופעה נפוצה 21-23. התאים לא מייצגים את אוכלוסיית היעד של עניין מגלמים גורם שעלול להיות מבלבל עבור קריאה ניסיונית 24,25. נוח, תת הסלולרי השונים קיימים בתוך השעיה תא הטרוגנית לשאת פרופילי ביטוי אנטיגן שונים (ידועים או שעדיין לא פוענחו), אשר יכול להיות מנוצל כדי להגדיר אלה אוכלוסיות שונות. Cytometry זרימה ומכאן יכול לשחק תפקיד מכריע בפתרון ההטרוגניות סלולרית, ובכך, להקל על יישומים ביו-רפואיים (במבחנה מבחני, טיפול בתאים) ולייעל את הקריאה כמותית על ידי התמקדות בתת-קבוצה הרלוונטית ביותר 24,26. שילובי אנטיגן פני השטח שונים זוהו בשנים האחרונות, כדי לאפשר quantitation ובידוד של סוגי תאים עצביים ספציפיים. זה כולל CD133 להעשרה של תאי גזע עצביים 27, שילוב של CD15 / CD24 / אנטיגנים משטח CD29 לבידודה של המועצה לביטחון לאומי, דיפרנציאלינוירון טד ותאי רכס עצביים 28 או CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 לבודד עצבי ותת גליה 25, בין חתימות אחרות 29,30. מעבר לתאי עצב, סמני גליה כוללים A2B5 31, CD44 25, NG2 32 וGLAST 33. הפרסום האחרון ניצל את סמן המוח התיכון floorplate מבשר קורין 34,35 להעשיר למבשרי דופאמין בהשתלת תאי פרקינסון הפרדיגמות 36. מולקולות CD הן לא רק סמנים, אך מתווכים רלוונטיים מבחינה תפקודית של תאי תאי אינטראקציות ושל היכולת של תא להגיב לאותות ממולקולות חוץ-תאיות וצמיחת הגורמים 37. אסטרטגיה אחת של עוד שיפור הארסנל של אנטיגנים CD קומבינטורית לאפיין פיתוח שושלת עצבי היא להשתמש סמנים תאיים ידועים למסך וללהגדיר שילובי אנטיגן CD לסוג תא מסוים של עניין. יש לנו לאחרונה ניצלנו גישה כזו וזיהה CD49F – / CD200 דפוסי ביטוי קומבינטורית גבוהים כגישה חדשנית להעשרת תת נוירונים ממובחנים עצבי מערכות תרבות תאי גזע pluripotent המושרה 38. כאן, אנו כוללים ולדון בפרוטוקול האחרון (ווריאציות אופציונליות ממנו) שבמכתים פני השטח וצביעה תאית ניתן להשתמש בו זמנית להגדרה תת-אוכלוסיות של תאים עצביים על ידי cytometry זרימה.
איור 2. תרשים זרימה של אפשרויות פרוטוקול ניסוי. הדמות מתארת ייצוג סכמטי של המעורבים בפרוטוקול את השלבים העיקריים. צעדים אופציונליים (צבע CFSE או תיוג אנטיגן תאיים) מסומנים על ידי קופסות צבע אפור בהירות. לאחר קציר, זה חיוני כדי להעריך את מספר הכדאיות ותא של השעיות תא עצביות לפני מכתים שטח פני תא. חיובי כגם בקרות שליליות צריכה להיות כלולות בתוספת לדגימות של עניין. ניתן לנתח דגימות על ידי ניתוח התזרים cytometric ו / או שימוש בפרדיגמות מיון תא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אמנם יש לנו בעבר השתמשתי נוגדן ראשוני בשילוב עם נוגדנים משני עבור מכתים תאיים 38, אנחנו עכשיו להציג את התיוג שאינו קוולנטיים של הנוגדן הראשוני באמצעות שברי ניאון Fab (תיוג זנון) כוריאציה קלה, ובכך להפחית את הצעדים של תא מניפולציה 39. יתר על כן, כדוגמא נוספת לרבגוניות של הפרוטוקול, אנו מעסיקים תיוג אופציונאלי של תת-קבוצה אחת ניסיונית על ידי carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) לפני המשטח מכתים אנטיגן. לפני תיוג CFSE כזו מאפשר השוואה המיידית הישירה של שתי שורות תאים או תנאי ניסוי (CFSE שכותרתו vs. ללא תווית) בתוך צינור מדגם יחיד, הפחתת שונות או הבדלים דקים בזמן דגירה ושמירת נוגדן. CFSE הוא צבע פלואורסצנטי הוקם המשמש בדרך כלל לתא מעקב 40, בניסויי התפשטות 41,42 וbarcoding 43,44. לבסוף, בזמן שצעדים ממשיים מיון (FACS, הפרדת תאי immunomagnetic או immunopanning) אינם חלק מפרוטוקול זה, באופן עקרוני, נהלי הקצירה ותיוג המתוארים כאן לעשות דגימות תשואה שיכול להיות נתון למשטח יישומים מבוסס תיוג תאיים מיון antigen- או 15 25,28.
עם מאמר זה, אנו שואפים: לסכם פרוטוקול מכתים אנטיגן שטח קיימא 25,28, לסכם פרוטוקול לזיהוי של מטרות תאיות, כמו גם משטח משולב וניתוח אנטיגן תאיים 38, מציג צעד תיוג צבע תאיים CFSE 41,45 כ אפשרות ניסיונית לcomparative הניתוחים של אוכלוסיות תאים עצביות, ולסכם גישות לזרום ניתוח cytometric (שליטה ובקרה נאותה 13,46, gating אסטרטגיה ונתונים מצגת 47).
הפרוטוקול המובא כאן הוא מבוסס היטב לתרביות תאים עצביות שמקורם בתאי גזע אנושיים, אבל יכול להיות מיושם באופן שווה למקורות תא עצביים אחרים, כולל רקמה ראשונית או שורות תאים עצביות. בנוסף למקורות עובריים, ניתן לחלץ תאי גזע עצביים או מהאזורים העצביים של המוח בוגר 27. י…
The authors have nothing to disclose.
Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Life Technologies | 11330057 | www.lifetechnologies.com | |
DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14190169 | www.lifetechnologies.com | |
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies | 10270-106 | www.lifetechnologies.com | |
MEM Non-essential amino acids (100 x) | Life Technologies | 11140035 | www.lifetechnologies.com | |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | www.lifetechnologies.com | |
Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250061 | www.lifetechnologies.com | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.3 | www.carlroth.com | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe | K41-001 | www.gelifesciences.com | |
Tween-20 Detergent | Calbiochem | 655205 | www.merckmillipore.de | |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience | 65-0850-84 | www.ebioscience.com | |
DMSO | AppliChem | A1584 | www.applichem.com | |
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore | SCGPU02RE | www.millipore.com | |
Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC | 156367 | www.thermoscientific.com | |
Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC | 156499 | www.thermoscientific.com | |
Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One | 188271 | www.greinerbioone.com | |
Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One | 227261 | www.greinerbioone.com | |
Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen | S03710150 | www.stein-labortechnik.de | |
Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning | 4125 | www.corning.com | |
Pipet tips (1-200 µl) | Corning | 4126 | www.corning.com | |
Pipet tips (100-1000 µl) | Corning | 4129 | www.corning.com | |
Serological pipets, 5 ml | Corning | 4051 | www.corning.com | |
Serological pipets, 10 ml | Corning | 4101 | www.corning.com | |
Serological pipets, 25 ml | Corning | 4251 | www.corning.com | |
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt | 72,699 | www.sarstedt.com | |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One | 616201 | www.greinerbioone.com | |
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt | 72,695,500 | www.sarstedt.com | |
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience | 17-0247-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
|
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience | 12-0549-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
|
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance | PRB-435P | www.covance.com Working dilution 1:2000 |
|
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies | A21206 | www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000 |
|
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies | Z-25342 | www.lifetechnologies.com | |
Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld | 0640010 | www.marienfeld-superior.com | |
Vortex | Scientific Industries | G560E | www.scientificindustries.com | |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.001 | www.eppendorf.com | |
Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) | 653118 | www.bdbiosciences.com/instruments/accuri | |
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab | 91-PSPIN-24R | www.peqlab.de | |
Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | www.heidolph-instruments.de | |
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich | 4480-50 | www.hettichlab.com | |
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific | 51026640 | www.thermoscientific.com | |
CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific | 51026331 | www.thermoscientific.com | |
Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences | 158320 | www.integra-biosciences.de | |
Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss | 451212 | www.zeiss.de | |
Pipet controller, accu-jet pro | Brand | 26303 | www.brand.de | |
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson | F144563 | www.gilson.com | |
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson | F144565 | www.gilson.com | |
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson | F144566 | www.gilson.com |