We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.
Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.
Проточной цитометрии была широко использована в иммунологии, гематологии и онкологии для определения клеточных популяций с помощью внутренних свойств рассеяния, экспрессии антигенов на клеточной поверхности, и других параметров флуоресценции 1-3. Наши идеи в развитие родословия и болезни являются результатом в значительной степени непрерывного уточнения этой методологии после ее первоначального 4,5 реализации. Повышение осведомленности о количественном и в целом аналитический потенциал проточной цитометрии недавно призвал к его более широкое применение в исследованиях стволовых клеток и может позволить так же глубокое прогресса в более короткие сроки 6. Тем не менее, применение проточной цитометрии конкретно анализировать и изолировать нейронных популяций уже давно воспринимается как сложной. В отличие от гемопоэтических клеток, что, естественно, существует в виде суспензии, нейронные клеточные типы, как правило, собирают из чрезмерно сложных источников, которые могут включать в себя глии и различные OРОЧИЕ окружающие клетки, а также сложная сеть технологических несущих нейронов. Следовательно, нейробиологии еще реализовать универсальность проточной цитометрии до его полного потенциала в повседневной исследовательских процедур. Тем не менее, до тех пор, жизнеспособным суспензии отдельных клеток могут быть созданы (и протоколы были разработаны и оптимизированы для этой цели 7), проточной цитометрии и флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) можно считать ценным элементом аналитического репертуара в нейробиологии 8-11.
. Рисунок 1. Принцип анализа проточной цитометрии и компонентов проточной цитометрии потока цитометры включает в себя три основные системы: струйная, оптики и электроники. Упорядочить поток клеток в суспензии (полученного из первичной ткани или в пробирке культуры) осуществляется оболочки Флуиd помощью гидродинамической фокусировки, ограничивая образца к его центру ядра. Оптические части состоят из лазеров, которые освещают поток клеток и оптических фильтров, которые направляют сигнал на соответствующие детекторы. Световые сигналы, обнаруженные преобразуются в электрические сигналы, затем обрабатываются на компьютере и визуализированных на мониторе для анализа данных и стробирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Пользователи расхода методы цитометрические прибыли из, по меньшей мере, базовое понимание основных фундаментальных том числе строительных блоков цитометром (для обзора см 12,13; также рисунок 1). Лазерный луч пересекается с гидродинамически сосредоточены жидкостного потока, который содержит клетки в суспензии, которая, в свою очередь проходят через лазерный луч в «одном файле" один за другим. Interceptiна клетки (или любой другой частицы, если на то пошло) с лазерными результатов в рассеянии света с этой точки допроса. Рассеянный свет может быть обнаружен в продолжение лазерного направлении (вперед разброс, связанный с размером частиц), а также перпендикулярно к ее стороной (разброса; отражающий зернистости частицы / клетки). Эти вышеупомянутые свойства рассеяния не требует специального маркировки, поэтому немеченый образец (или также продукты распада клеток, пузырьки воздуха, и т.д.) будет генерировать сигнал (событие) на двумерной рассеяния вперед по сравнению с боковой разброс участка обычно используется для начальной селекции. С помощью соответствующих лазеров и фильтры, специфичных для соответствующего спектров возбуждения и испускания, клетки могут быть проанализированы для его положительности, уровень интенсивности, или отсутствие флуоресцентных маркеров. Большинство приложений цитометрии потока были сосредоточены на характеристики с помощью антигенов клеточной поверхности. В отличие от гемопоэтических lineagе, нейронная линия осталась менее широко определяется в соответствии с поверхности профилей экспрессии эпитоп 5. Одним из преимуществ использования поверхностных антигенов в том, что живые клетки могут быть подвергнуты сортировки клеток парадигмы, такие как FACS. В отличие от этого, внутриклеточное окрашивание антиген требуется фиксация и пермеабилизирующего шаги, чтобы посредничать эпитоп-антитело взаимодействия, исключающие вниз по течению приложений, которые требуют жизнеспособных клеток. Следует отметить, что такие подходы по-прежнему обеспечивают многочисленные количественных анализов 14, а также вниз по течению анализов РНК и белка выражение 15. Гематология, иммунология и онкология часто используется более чем десятка маркеры в сочетании, чтобы определить конкретные субпопуляции 16. Кроме того, масса цитометрии или CyTOF теперь могут быть использованы для анализа до 30 параметров одновременно 17,18.
Для применений нейронных стволовых клеток, а также в первичных культурах 14,19,20 гетерогенности клеток впробирке является распространенным явлением 21-23. Клетки не представляющие целевую популяцию интерес воплотить потенциально сбивающий фактор экспериментального считывания 24,25. Удобно, различные клеточные подмножества, присутствующие в гетерогенной суспензии клеток несут различные (известные или еще не расшифрованы) профили экспрессии антигена, которые могут быть использованы, чтобы определить эти различные группы населения. Проточной цитометрии, следовательно, могут сыграть решающую роль в урегулировании сотовой неоднородность и, следовательно, способствовать биомедицинских приложений (анализы в пробирке, клеточной терапии) и оптимизировать количественный отсчет, сосредоточив внимание на наиболее значимой подмножества 24,26. Различные комбинации поверхностного антигена были определены в течение последних нескольких лет, чтобы позволить количественное и выделение специфических нейронных типов клеток. Это включает в себя CD133 для обогащения нервных стволовых клеток 27, сочетание CD15 / CD24 / CD29 поверхностных антигенов для выделения НСК, отличительноеТед нейрон и клетки нервного гребня 28 или CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271, чтобы изолировать нервных и глиальных подмножества 25, среди других подписей 29,30. Помимо нейронов, глиальных маркеры включают A2B5 31, CD44 25, NG2 32 и Glast 33. Недавняя публикация эксплуатировал среднего мозга донной маркер предшественника Корин 34,35 обогащать дофаминергических прекурсоров в трансплантации Паркинсона клеток парадигм 36. Молекулы CD не только маркеры, но функционально соответствующие медиаторы межклеточных взаимодействий и способности клеток к реагируют на сигналы от молекул внеклеточного матрикса и факторов роста 37. Одна из стратегий дальнейшего повышения арсенал комбинаторных CD антигенов охарактеризовать развитие нейронального происхождения является использование известных внутриклеточных маркеров для скрининга и определить комбинации CD-антиген для конкретного типа клеток, представляющих интерес. Мы недавно эксплуатируются такой подход и определил CD49F – / CD200 высокие комбинаторные паттерны экспрессии в качестве нового подхода к обогащению нейронов подмножества из ЦНС дифференцированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток культуры систем 38. Здесь мы включаем и обсуждать последний протокол (и дополнительные варианты таковых), в котором поверхность окрашивание и внутриклеточное окрашивание может быть использован одновременно для определения нейронных субпопуляций клеток с помощью проточной цитометрии.
Рисунок 2. Блок-схема экспериментальной вариантов протокола. Рисунок изображает схематическое представление основных этапов в протоколе. Дополнительные шаги (CFSE краситель или внутриклеточная антиген маркировка) обозначены светло-серых коробок. После сбора важно, чтобы оценить жизнеспособность клеток и количество нейронных клеточных суспензий предшествующих окрашивания клеточной поверхности. Как положительные,также должны быть включены в дополнение к образцам, представляющим интерес отрицательные контроли. Образцы могут быть проанализированы с помощью анализа проточной цитометрии и / или используются в сотовых сортировки парадигм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
В то время как мы уже использовали первичное антитело в сочетании с вторичным антителом для внутриклеточного окрашивания 38, теперь ввести нековалентную маркировки первичного антитела с помощью флуоресцентных Fab фрагментов (Зенон маркировка), как небольшое изменение, тем самым уменьшая этапы клеток манипуляции 39. Кроме того, в качестве дополнительного примера универсальности этого протокола, мы используем дополнительный маркировки одной экспериментальной подгруппе по карбоксифлуоресцеина сукцинимидилпальмитата эфир (CFSE) до поверхности окрашивание антиген. Такое CFSE предварительно маркировка позволяет немедленно прямое сравнение двух клеточных линий или экспериментальных условиях (CFSE меченных против. немеченый) в пределах одного образца трубы, снижая дисперсию или тонкие различия во времени инкубации и экономии антитела. CFSE является признанным флуоресцентный краситель, который обычно используется для отслеживания 40 клеток, пролиферации в 41,42 и 43,44 штрих кода экспериментов. Наконец, в то время как реальные шаги для сортировки (FACS, разделение иммуномагнитный клетка или immunopanning) не являются частью данного протокола, в принципе, процедуры сбора урожая и маркировки описанные здесь образцы урожая, которые могут быть подвергнуты поверхностной антиген или внутриклеточные маркировки на основе сортировки приложений 15 25,28.
В этой статье мы стремимся: обобщить жизнеспособным поверхности окрашивания антигена протокол 25,28, обобщить протокол для обнаружения внутриклеточных мишеней, а также в сочетании поверхностных и внутриклеточных анализ антигена 38, представить внутриклеточный CFSE маркировки краситель шаг 41,45 в экспериментальная опция для COMсравнительный анализ нейронных популяций клеток, и обобщить подходы к анализ течения цитометрический (соответствующие элементы управления 13,46, воротные стратегии и представление данных 47).
Протокол, представленные здесь, хорошо известна в культурах нервных клеток, полученных из человеческих стволовых клеток, но может быть в равной степени применено к другим нейронных клеточных источников в том числе первичной ткани или нейронных клеточных линий. В дополнение к эмбриона…
The authors have nothing to disclose.
Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Life Technologies | 11330057 | www.lifetechnologies.com | |
DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14190169 | www.lifetechnologies.com | |
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies | 10270-106 | www.lifetechnologies.com | |
MEM Non-essential amino acids (100 x) | Life Technologies | 11140035 | www.lifetechnologies.com | |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | www.lifetechnologies.com | |
Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250061 | www.lifetechnologies.com | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.3 | www.carlroth.com | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe | K41-001 | www.gelifesciences.com | |
Tween-20 Detergent | Calbiochem | 655205 | www.merckmillipore.de | |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience | 65-0850-84 | www.ebioscience.com | |
DMSO | AppliChem | A1584 | www.applichem.com | |
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore | SCGPU02RE | www.millipore.com | |
Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC | 156367 | www.thermoscientific.com | |
Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC | 156499 | www.thermoscientific.com | |
Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One | 188271 | www.greinerbioone.com | |
Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One | 227261 | www.greinerbioone.com | |
Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen | S03710150 | www.stein-labortechnik.de | |
Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning | 4125 | www.corning.com | |
Pipet tips (1-200 µl) | Corning | 4126 | www.corning.com | |
Pipet tips (100-1000 µl) | Corning | 4129 | www.corning.com | |
Serological pipets, 5 ml | Corning | 4051 | www.corning.com | |
Serological pipets, 10 ml | Corning | 4101 | www.corning.com | |
Serological pipets, 25 ml | Corning | 4251 | www.corning.com | |
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt | 72,699 | www.sarstedt.com | |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One | 616201 | www.greinerbioone.com | |
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt | 72,695,500 | www.sarstedt.com | |
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience | 17-0247-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
|
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience | 12-0549-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
|
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance | PRB-435P | www.covance.com Working dilution 1:2000 |
|
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies | A21206 | www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000 |
|
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies | Z-25342 | www.lifetechnologies.com | |
Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld | 0640010 | www.marienfeld-superior.com | |
Vortex | Scientific Industries | G560E | www.scientificindustries.com | |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.001 | www.eppendorf.com | |
Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) | 653118 | www.bdbiosciences.com/instruments/accuri | |
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab | 91-PSPIN-24R | www.peqlab.de | |
Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | www.heidolph-instruments.de | |
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich | 4480-50 | www.hettichlab.com | |
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific | 51026640 | www.thermoscientific.com | |
CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific | 51026331 | www.thermoscientific.com | |
Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences | 158320 | www.integra-biosciences.de | |
Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss | 451212 | www.zeiss.de | |
Pipet controller, accu-jet pro | Brand | 26303 | www.brand.de | |
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson | F144563 | www.gilson.com | |
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson | F144565 | www.gilson.com | |
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson | F144566 | www.gilson.com |