Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Flowcytometrisystemer protokoller for Surface og Intracellulær Antigen Analyser av Neural celletyper

Published: December 18, 2014 doi: 10.3791/52241
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1, 1,4
1Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology, University of Freiburg, 3School of Life Sciences, Keele University, 4Center for Biological Signaling Studies (BIOSS), University of Freiburg

Introduction

Flowcytometri har blitt grundig utnyttet i immunologi, hematologi og onkologi å definere celle populasjoner via iboende scatter egenskaper, celleoverflateantigen uttrykk og andre fluorescens parametre 1-3. Våre innsikt i blod avstamning utvikling og sykdom er et resultat av en betydelig grad av den kontinuerlige forbedringer av denne metoden etter dens første 4,5 gjennomføringen. Økt bevissthet om kvantitative og generell analytisk potensial flowcytometri har nylig oppfordret sine mer utbredt bruk i stamcelleforskning, og kan gjøre det mulig tilsvar dyp fremgang i en kortere tidsramme 6. Imidlertid har anvendelsen av flowcytometri for spesifikt å analysere og isolere nervepopulasjoner lenge vært oppfattet som utfordrende. I motsetning til hematopoetiske celler som naturlig finnes i suspensjonen, er neurale celletyper vanligvis høstet fra overdrevent komplekse kilder som kan innbefatte gliaceller og diverse other omliggende celler samt et intrikat nettverk av prosessbærende nevroner. Derfor har nevrobiologi ennå å implementere allsidigheten flowcytometri til sin fullstendige potensialet i daglige forsknings rutiner. Imidlertid, så lenge som en levedyktig, enkel cellesuspensjon kan genereres (og protokoller er utviklet og optimalisert for det formålet 7), flowcytometri og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) kan betraktes som en verdifull del av analyse repertoar i neurobiology 8-11.

Figur 1
. Figur 1. Prinsipp for flowcytometrisk analyse og komponenter av et flowcytometer flowcytometere består av tre hovedsystemer: fluidics, optikk og elektronikk. En strømlinjeformet strøm av celler i suspensjon (fremstilt fra primært eller vev in vitro kultur) oppnås ved kappen fluid via hydrodynamisk fokusering, begrenser prøven til dets midtkjernen. De optiske deler er sammensatt av lasere som belyser strømmen av celler og optiske filtre som styrer signalet til de passende detektorer. Lyssignalene oppdaget konverteres til elektroniske signaler, deretter behandles av en datamaskin og visualisert på en monitor for dataanalyse og gating. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Brukere av strømningscytometriske metoder overskudd fra minst en grunnleggende forståelse av de underliggende fundamentale forhold, inkludert en cytometer byggesteiner (for oversikt se 12,13, se også figur 1). En laserstråle skjærer med en hydrodynamisk fokusert fluidstrømmen som inneholder de celler i suspensjonen, som i sin tur passerer gjennom laserstrålen i 'enkelt fil' etter hverandre. Den interceptipå i en celle (eller enhver annen partikkel, for den saks skyld) med laser resulterer i spredning av lyset fra denne utspørringspunktet. Spredt lys kan detekteres i fortsettelse av laserretningen (forover spredning, forbundet med størrelsen av partikkelen), samt vinkelrett på retningen (side scatter; reflekterer granulosity av partikkel / celle). Disse nevnte spredningsegenskaper ikke krever spesiell merking, noe som er grunnen til at en umerket prøve (eller også mobilnettet rusk, luftbobler, etc.) vil generere et signal (hendelse) på bivariate fremover scatter versus side spredningsdiagram som vanligvis brukes til innledende gating. Ved å bruke de passende lasere og filtre som er spesifikke for den tilhørende eksitasjon og emisjonsspektra, kan en celle bli analysert for sin positivitet, nivå av intensitet eller fravær av fluorescerende markører. Flertallet av strømningscytometriske applikasjoner har fokusert på karakterisering via celleoverflateantigener. I motsetning til blodkreft lineage har nevrale avstamning forble mindre omfattende definert i henhold til overflaten epitope uttrykk mønstre fem. En fordel med å utnytte overflateantigener er at levende celler kan utsettes for cellesortering paradigmer som FACS. I kontrast, krever intracellulær antigen flekker fiksering og permeabilization skritt for å mekle epitopet-antistoff samhandling, utelukker nedstrøms applikasjoner som krever levedyktige celler. Av notatet, slike tilnærminger fortsatt tillate for mange kvantitative analyser 14 samt nedstrøms analyser for RNA og protein uttrykk 15. Hematologi, immunologi og onkologi har ofte brukt mer enn et dusin markører i forbindelse å definere bestemte subpopulasjoner 16. Dessuten kan massen cytometri eller CyTOF nå bli brukt til å analysere opptil 30 parametere samtidig, 17,18.

For nevrale stamcelle applikasjoner samt primærkulturer 14,19,20 den heterogenitet av celler ivitro er et vanlig fenomen 21-23. Cellene ikke representerer målgruppen av interesse legemliggjøre et potensielt problemfaktor for eksperimentell avlesning 24,25. Hensiktsmessig de forskjellige cellulære undersett som er tilstede i en heterogen cellesuspensjon bærer distinkte (som er kjent eller som vil bli tydet) antigen ekspresjon profiler, som kan benyttes for å definere disse forskjellige populasjonene. Flowcytometri kan dermed spille en avgjørende rolle i å løse cellulære heterogenitet og dermed legge til rette for biomedisinske applikasjoner (in vitro, celleterapi) og optimalisere kvantitativ avlesning ved å fokusere på den mest relevante undergruppe 24,26. Forskjellige overflate antigen kombinasjoner er blitt identifisert i løpet av de siste årene for å tillate kvantitering og isolering av bestemte neurale celletyper. Dette omfatter CD133 for anriking av nevrale stamceller 27, slik at kombinasjonen av de CD15 / CD24 / CD29-overflateantigener for isolering av NSC, differentiated nevron og neural crest celler 28 eller CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 å isolere nevrale og gliaceller undergrupper 25, blant andre signaturer 29,30. Utover nevroner, gliaceller markører A2B5 31, CD44 25, NG2 32 og GLAST 33. En fersk publikasjon har utnyttet den midthjernen gulv forløper markør CORIN 34,35 å berike for dopaminerge forløpere i Parkinson celletransplantasjon paradigmer 36. CD-molekyler er ikke bare markører, men funksjonelt relevante mediatorer av celle-celle interaksjoner og i en celle evne til å svare på signaler fra ekstracellulære matrise molekyler og vekstfaktorer 37. En strategi for ytterligere styrking av arsenal av kombinatoriske CD antigener å karakter nevrale avstamning utvikling er å bruke kjente intracellulære markører for å screene for og definere CD antigen kombinasjoner for en bestemt celletype av interesse. Vi har nylig utnyttes slik tilnærming og identifisert CD49f - / CD200 høye kombinatoriske uttrykk mønstre som en ny tilnærming for berikende nevronale undergrupper fra nevralt differensierte indusert pluripotente stamceller kultursystemer 38. Her inkluderer vi diskutere og den sistnevnte protokoll (og eventuelle variasjoner derav), hvor overflatefarging og intracellulær farging kan brukes samtidig for å definere nervecellepopulasjoner ved strømningscytometri.

Figur 2
Figur 2 viser et flytdiagram av eksperimentelle protokoll alternativer. Figuren viser en skjematisk fremstilling av de viktigste trinnene involvert i protokollen. Valgfritt trinn (CFSE dye eller intracellulær antigen merking) er angitt med lys grå ruter. Etter høsting, er det viktig å vurdere levedyktigheten og celleantallet av nervecellesuspensjoner før celleoverflatefarging. Positiv somvel som negative kontroller trenger å være inkludert i tillegg til prøvene av interesse. Prøvene kan analyseres ved flowcytometrisk analyse og / eller brukes i celle sortering paradigmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mens vi tidligere har brukt primært antistoff i kombinasjon med sekundært antistoff for intracellulær farging 38, introduserer vi nå ikke-kovalent merking av det primære antistoff via fluorescerende Fab-fragmenter (Zenon merking) som en svak variant, for derved å redusere de trinn celle 39 manipulasjon. Videre, som et ytterligere eksempel på protokoll allsidighet, anvender vi en eventuell merking av en eksperimentell undergruppe av karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) før overflateantigen farging. Slike CFSE pre-merking muliggjør umiddelbar direkte sammenligning av to cellelinjer eller eksperimentelle betingelser (CFSE-merket vs. umerket) i et enkelt prøverør, redusere avviket eller små forskjeller i inkubasjonstid og lagring av antistoff. CFSE er en etablert fluorescerende fargestoff som vanligvis brukes for celle sporing 40, i sprednings 41,42 og strekkoding eksperimenter 43,44. Til slutt, mens selve sorterings trinn (FACS, immunomagnetisk Celleseparasjonsanordningene eller immunopanning) er ikke en del av denne protokollen, i prinsippet, slakteriene og merking prosedyrene som er beskrevet her gjør avkastning prøver som kan utsettes til overflaten antigen eller intracellulære merking basert sortering applikasjoner 15 25,28.

Med denne artikkelen, vi tar sikte på å: oppsummere en levedyktig overflateantigen farging protokollen 25,28, oppsummere en protokoll for påvisning av intracellulære mål samt kombinert overflate og intracellulær antigen analyse 38, presentere en intracellulær CFSE fargestoff merking steg 41,45 som en eksperimentell alternativ for comkomparative analyser av nervecellepopulasjoner, og oppsummere tilnærminger til flowcytometri analyse (hensiktsmessige kontroller 13,46, gating strategi og datapresentasjon 47).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Neural Cell Høsting

  1. Vurderingen av mikroskop:
    1. Før oppstart av et eksperiment, sjekke status på kulturen med lyse-feltet eller fasekontrastmikroskopi.
      MERK: Mens primære nevrale vev hentet fra disseksjoner er i prinsippet like mottagelig for flowcytometrisk analyse 14,28, vær oppmerksom på at protokollen fokus er på celler hentet fra in vitro nevrale cellesystemer.
  2. Høsting celler 7:
    1. Forsiktig vaske fatet / kolbe av adherente celler med Mg2 + / Ca2 + fri fosfat-bufret saltvann (PBS) ved romtemperatur (for eksempel, 5 ml for T75-kolbe, 3 ml per brønn på 6-brønners plate, eller 10 ml for 10 cm parabol).
      MERK: PBS brukes i hele protokollen er Mg 2+ / Ca 2+ gratis.
      1. For video eksempel bruke en T75 kolbe av SH-SY5Y neuroblastom celler på 80% confluency. Påfør flere vasketrinn i tilfeller derbetydelig rusk er til stede i retten.
      2. Vurdere vasker med serum albumin holdig PBS 48, Percoll®, eller Ficoll 49 sentrifuge gradienter og / eller kommersielt tilgjengelige perler 50,51. Fjerning av myelin og andre lipid eller andre forurensninger er kritisk, spesielt når voksen primære vevskilder blir brukt.
    2. Legg forvarmet (37 ° C) trypsin utskifting på et passende volum som dekker hele overflaten av vevskultur fartøyet.
      MERK: Du kan også vurdere Accutase eller andre enzymatiske fordøyelsen alternativer. Denne kritiske trinnet kan negativt påvirke overflate epitope uttrykk (se 7).
    3. Inkuber fatet / kolbe ved 37 ° C i 2 - 5 minutter (avhengig av celletype) for å tillate cellene å løsne. Banke forsiktig på vev kultur fartøy eller i flukt med en serologisk pipette for å løsne cellene. Unngå over fordøyelsen (da dette kan føre til celletapet og koagulasjon på senere trinn).
    4. Quench trypsin erstattet ved å tilsette det dobbelte volum av strømningsbuffer (2% FBS i PBS) og samle cellene i et 15 ml konisk rør.
    5. Forsiktig triturer cellesuspensjonen ved hjelp av en mikroliter pipette (100 - 1000 ul) eller en 5 ml serologisk pipette for å fremstille en enkel cellesuspensjon.
    6. Sentrifuger cellene ved 220 x g i 5 min ved 25 ° C. Aspirer supernatanten forsiktig forlater pellet bak.
    7. Re-suspendere pelleten i et passende volum av strømningsbuffer, avhengig av størrelsen av pelleten (dvs. for en konfluent T75 flaske av SH-SY5Y-celler typisk utbyttet er minst 10 x 10 6 celler, i hvilket tilfelle cellene blir resuspendert i 5 ml av strømningsbuffer).
      MERK: Dersom større biter eller blodpropp er observert, filtreres gjennom en 30-100 mikrometer mesh.
  3. Celle teller 52:
    1. Overføre en liten aliquot av cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerør og fortynnet til en definert ratio i et volum på trypan blå eller en alternativ levedyktighet fargestoff før overføring til et hemocytometer eller automatisert celletelling system.
    2. Fortynn cellesuspensjonen til en konsentrasjon på 1 x 10 6 levedyktige celler / ml ved å tilsette det passende volum av strømnings buffer eller PBS med 0,1% BSA (hvis forløp med CFSE merking).
      MERK: propidiumjodid, 7-Aminoactinomycin D, annexin V og kommersielt tilgjengelige låses levedyktighet analysesett representerer alternative muligheter for å vurdere levedyktigheten til cellene. Også, apoptose-analyser ved bruk av caspase-3 fluorescens som tidligere beskrevet 53 kan anvendes. Fluorescent kanaler vil bli "okkupert" av disse reagenser som kan begrense mulighetene for etterfølgende trinnene hvis inkludert i alle prøvene.

2. Intracellulær Dye Merking hjelp CFSE (figur 3)

  1. Fortynne CFSE til en ønsket lager konsentrasjon som lett kan brukes.
    MERK: For disse eksperimentene et lager konsentrasjon av0,01 mm ble benyttet. Bestemme optimal arbeidskonsentrasjon av CFSE empirisk.
  2. Tilsett 10 pl av 0,01 mM CFSE oppløsning per ml celler (avsnitt 1.3.2, konsentrasjon av 1 x 10 6 celler / ml i PBS + 0,1% BSA) i en sluttkonsentrasjon på 0,1 uM. Kort vortex å bland godt.
    MERK: CFSE konsentrasjoner som brukes her, er omtrent ti ganger lavere enn de som vanligvis anvendes i proliferasjonsanalyser, derav celletoksisitet av fargestoffet er minimal. Vi har ikke observere negative effekter på celle levedyktighet.
  3. Inkuber i 5 min ved RT med konstant risting (200 rpm). Beskytt mot lys.
  4. Slukke fargestoffet ved tilsetning av 5 volumdeler buffer strømnings til rørene. Sentrifuger ved 94 xg i 5 minutter ved RT.
  5. Kast supernatanten forlater pellet bak. Re-suspen cellene med 5 volumer av flyt buffer.
  6. Sentrifuger ved 94 xg i 5 minutter ved RT. Kast supernatanten og re-suspendere cellene i strømnings-buffer ved en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml.
  7. Legg et likt antall ufargede celler av interesse for farget cellesuspensjon. Fortsett til overflaten antigen flekker protokollen (§ 3).

Figur 3
Figur 3. Påvisning av differensial CD overflateantigen ekspresjon mellom to cellelinjer via CFSE fargestoffmerking. SH-SY5Y neuroblastom-celler er forhåndsmerket med CFSE for senere identifikasjon i sammenligning med umerkede BJ fibroblaster. Co-farging av blandet prøven (høyre panel) med overflatemarkører CD24 eller CD54 (både konjugert til APC) viser at cellelinjer er lett gjenkjennelig på grunn av den CFSE flekker (piler = SH-SY5Y, pilspisser = BJ fibroblaster). Flertallet av SH-SY5Y celler uttrykker CD24, men ikke CD54 (ICAM-1). I kontrast, BJ fibroblaster (CFSE-negative) er positive for CD54, men i stor grad negativ for CD24."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Cell Surface Farging

  1. Merk rør inkludert prøver og kritiske kontroller (se tabell 1).
Tube no. Prøvenavnet Antigen-fluorophore Fortynning
1 Ufargede celler -
2 Enkeltbeiset CD24-APC 01:50
3 Enkeltbeiset TUJ1-Alexa fluor 488nm 1: 2000
4 Double farget CD24-APC 01:50
TUJ1-Alexa fluor 488nm 1: 2000
5 Enkeltbeiset Sekundær bare: Alexa fluor 488nm 1: 2000

Tabell 1. L ist av rørene som skal inngå i et typisk flowcytometri eksperiment. Tabellen viser et minimalt sett med prøverør som kreves for en ko-farging eksperimentet beskrevet i dette video artikkelen. En ideell eksperiment må omfatte alle nødvendige kontroller (negative, positive så vel som kompensasjon kontroller) for nøyaktig tolkning av resultatene som oppnås.

  1. Tilsett 100 ul cellesuspensjon (fra avsnitt 2.7 og 1.3.2) til hver 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    MERK: Pass på at et minimum på 0,1 x 10 6 celler er til stede per 100 mL av cellesuspensjon.
  2. Legg fluoroforen konjugert antistoff i prøven ved en passende fortynning.
    MERK: Bestem arbeids fortynning for hver antistoff før eksperimentet. Se tabell 2 for en liste of nevrale overflateantigener.
Antigen Celletype Reference
CD15 Neuralstamceller [28, 67]
CD24 Nerveceller [28, 68]
CD29 Neuralstamceller [28, 69, 70]
CD44 Gliaceller [25]
CD49f Neuralstamceller [38]
CD56 (NCAM) Nerveceller [71]
CD133 Neuralstamceller [27]
CD184 Nevrale stamceller og gliaceller [25]
CD200 Nerveceller [38]
CD271 Neural crest stamceller
A2B5 Gliaceller [31]
CORIN Dopaminerge forløpere [35, 36]
FORSE1 Nevrale stamceller (NSC) [72]
GLAST Gliaceller [33]
NG2 Gliaceller [32]

. Tabell 2. Valg av nevrale overflateantigener Denne tabellen gir en liste av overflate epitoper funnet å være uttrykt ved ulike nevrale celletyper å eksemplifisere den økende panel av overflateantigener som brukes for å karakterisere den nevrale avstamning. Merk at dette valget er langt fra å være komplett, og at de fleste av disse markørene er også uttrykt av en rekke andre nevrale og ikke-nerveceller. Følgelig vil kombinasjoner av flere markører være nødvendig for å bedre definere og isolere de angitte nevrale undergrupper.

    Inkuber i 30 min på en orbital-rystemaskin (200 rpm) i mørket.
  1. Flow buffer vask
    1. Tilsett 1 ml av strømningsbuffer til rørene. Sentrifuger ved 380 x g i 4 minutter ved 4 ° C.
    2. Kast supernatanten forlater pellet bak.
  2. Gjenta vasketrinnet igjen.
  3. Etter den andre vask, dekanter supernatanten og re-suspendere cellene i strømnings buffer til et sluttvolum på 100 ul.
  4. Bruk prøven for flowcytometrisk analyse. Alternativt, fortsett med punkt 4 og 5.
    MERK: Hvis cellene er å bli sortert og satt tilbake i kultur post-FACS (dvs. levedyktig cellesuspensjon uten fiksering eller permeabilization), gjelder aseptiske teknikker under innhøstingen, farging og analytiske trinn.

4. Fiksering og Permeabilization 38

  1. Fiksering ved hjelp Paraformaldehyde (PFA):
    1. Forbered fiksering buffer inneholdende 2% PFA i PBS.
    2. Legg 500 ul av fikseringsbuffer til 100 ul av cellesuspensjonen.
    3. Inkuber rørene ved RT i 15 min på en orbital rister (100 rpm) i mørket.
  2. PBS vask:
    1. Tilsett 1 ml PBS til røret. Sentrifuger ved 380 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
    2. Kast / dekanter supernatanten forlater omtrent 100 ul i røret.
  3. Permeabilization med Tween-20:
    1. Forbered permeabilization buffer inneholdende 0,7% Tween-20 i PBS.
    2. Legg 500 ul permeabilization buffer til 100 ul av cellesuspensjonen.
    3. Inkuber rørene ved RT i 15 min på en orbital rister (100 rpm) i mørket.
  4. Vask cellene gang med PBS (som beskrevet i punkt 4.2) og fjern supernatanten fra rør completely, slik at bare pellet bak.

5. Intracellulær Antigen Farging 38 (figur 4)

  1. Utarbeidelse av primær antistoff løsninger:
    1. Fortynn de primære antistoffer i fortynningsbuffer inneholdende 1% bovint serumalbumin, 10% serum (f.eks, esel eller normal geiteserum) og 0,5% Tween-20 i PBS.
      MERK: Velg serum som skal brukes avhengig av art de sekundære antistoffer ble reist i.
    2. Alternativt kan du bruke Zenon fluorescein merking av det primære antistoffet i henhold til produsentens instruksjoner.
      1. Forbered 1 ug av primært antistoff i PBS ved en passende fortynning (totalt volum ≤ 20 ul).
      2. Tilsett 5 ul av Zenon fluorescein IgG merkingsreagens (komponent A) til antistoffløsningen.
      3. Inkuber blandingen i 5 min ved RT.
      4. Tilsett 5 ul av Zenon blokkerende reagens (komponent B) til reaksjonsblandingen.
      5. Inkuberav blandingen i 5 min ved RT. Anvende antistoffet til prøven i løpet av 30 min.
  2. Primær antistoffarging:
    1. Tilsett 100 ul av primær antistoffløsning til cellepelleten og triturer forsiktig for å blande.
    2. Alternativt kan legge Zenon fluorescein-merket antistoff til cellesuspensjonen ved passende fortynning.
    3. Inkuber rørene ved RT i 30 min på en orbital rister (200 rpm), beskyttet mot lys. Vask cellene gang med PBS (som beskriver i kapittel 4.2) og fjern supernatanten fra rørene helt, slik at bare pellet bak.
  3. Sekundært antistoffarging (ikke nødvendig for Zenon fluorescein merkede antistoffer):
    1. Fortynn de sekundære antistoffer i PBS i en passende konsentrasjon.
    2. Tilsett 100 ul av det sekundære antistoff løsning cellepelleten og triturer forsiktig for å blande. Inkuber rørene ved RT i 30 minutter på en ristemaskin (200 rpm) i mørket.
  4. Vask prøvene to ganger med PBS (som beskrevet i punkt 4.2).
  5. Vask en gang med flyt buffer (se avsnitt 3.5).
  6. Re-suspendere cellene i ca 150 mL av flyt buffer og analysere på flowcytometeret.

Figur 4
Figur 4. Co-farging av overflaten og intracellulære proteiner. Strømningscytometri data eksemplifiserer en sammenligning mellom primær + sekundært antistoff-baserte versus Zenon fluorescein-baserte intracellulær farging i kombinasjon med overflatefarging. Eksklusiv positivitet på y-aksen (øvre venstre kvadrant) og x-aksen (nedre høyre kvadrant) viser celler farget for MAP2 og CD24, respektivt. Etter co-flekker, kan deles MAP2 og CD24 uttrykk sees i øvre høyre kvadrant (høyre panel). Sammenligning av hjelpAlexa Fluor 488. (Toppen; AF488) versus Zenon fluorescein (nederst) for MAP2-merking Rentene lignende resultater Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

6. Flowcytometriske Analysis

  1. Flowcytometrisk analyse gjennomføre umiddelbart etter fullførelse av flekker protokollen ved hjelp av et flowcytometer med passende filtre for signaldeteksjon. Bruke 488 nm blå og 640 nm rød laser med FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), og FL-4 (675/25) båndpassfiltre.
  2. Sett opp primære porter basert på fremover og side scatter unntatt rusk og døde celler.
  3. Satt fluorescens porter for overflate- og intracellulær antigen til ≤0.5% basert på de ufargede prøver og kompensasjon for spektral overlapp ved hjelp av enkle farget kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen presenteres her gir mulighet for allsidig eksperimentelle tilnærminger (figur 2). I sin korteste versjonen (trinn 1, 3 og 6), kan det betraktes som en guide for enkel farging av overflateantigener. I sin mer kompleks form, kan en rekke co-merking paradigmer med en rekke intracellulære antigener bli forfulgt (valgfritt trinn 2 og / eller 4 til 5). Videre eksemplifiserer CFSE-merking trinn sin nytteverdi for celle merking / sporing av subpopulasjoner i celle-celle interaksjonsstudier eller flowcytometrisk strekkode eksperimenter (trinn 2). Levedyktige celle populasjoner (hentet fra trinn 2 og / eller 3) er mottagelig for celle sortering paradigmer (FACS) og genetisk analyse inkludert post-sort cellekultur. På den annen side, (trinn 3 til 5) den kombinerte intracellulære og overflateantigen farginggir analytiske avlesning muligheter i sin egen rett. For eksempel, identifisere samlokalisering av visse CD antigener på bestemte undergrupper av nevrale celle populasjoner (anvendt av oss i Turac et al 38 for å identifisere CD49f -. / CD200 høye signaturer for nevronale FACS). Disse og andre eksempler neurale markører er vist i tabell 2, hvor CD15, CD29, CD49f og FORSE1, er først og fremst forbundet med nevrale stamceller, og CD24 og CD56 er rikt på nevronale celler. Mens noen av disse markørene er eksklusiv, kan multivariate uttrykk analyse forskjellige fargeintensitet og bidra til å identifisere spesifikke markører sett for analyse og isolering av bestemte nevrale subpopulasjoner.

Figur 3 eksemplifiserer typiske resultater oppnådd fra kombinatoriske bruk av intracellulær fargestoff og overflatefarging. Dataene viser hvordan to forskjellige cellepopulasjoner lett kan identifiseres ina blandes prøven på grunn av den tidligere merking av en av populasjonene. Her ble SH-SY5Y neuroblastom-celler merket med CFSE og utstillings fluorescens i den grønne kanalen (FL1; y-akse) som er tydelig atskilt fra de ufargede andre populasjonen, i dette tilfellet BJ fibroblaster. Mens veletablert karakteristisk fibroblast (CD54), og neurale markører (CD24) er vist (tilstede på de respektive målpopulasjonene; FL2 eller FL4 fluorescens, henholdsvis x-aksen) er analoge metoder kan utnyttes til å screene for andre uidentifiserte antigener. Videre kan effekten av celle-celle interaksjoner av to (eller flere) subpopulasjoner som ble merket før ko-kultur-eksperimenter studeres på denne måte.

Figur 4 viser de ufargede SH-SY5Y celler samt prøver farget for CD24-APC og / eller den intracellulære nevronale MAP2 antigen (FITC kanal) etter fiksering og permeabilization. Som sistnevnte kan påvirke spredningsegenskaper, baBAKGRUNN fluorescens og overflate epitope flekker, tomter tjene til å dokumentere vedlikeholdt overflate uttrykk for nevrale CD24 etter intracellulær farging. Videre er samlokalisering av nevronale MAP2 flekker på CD24-positive brøkdel vist. Det er kritisk for å sikre trofast deteksjon av overflateantigenet ved sammenligning med CD24 overflate ekspresjon på levende celler. Videre spesifisitet av den intracellulære deteksjon løpet bakgrunn, ikke-spesifikk antistoffbinding og autofluorescence må bekreftes. Påvisning av intracellulære antigener via Zenon fluorescens-basert eller primær + sekundære antistoffbaserte strategier gir sammenlignbare resultater, som gir en begrunnelse for å vurderer dette mer tidseffektive tilnærming (Hopp over punkt 5.3). Mens protokollen er robust og muliggjør den kombinerte påvisning av en rekke forskjellige underlag og intracellulære markører med begrenset bakgrunnsfluorescens, anbefales det å nøye følge de inkubasjonstider og vasketrinnanordnet i protokollen. Videre er det tilrådelig å analysere i det minste tre uavhengige forsøks repetisjoner og å merke seg at merking intensitet og overflatestabilitet epitop kan være markør-spesifikke og kan kreve ytterligere optimalisering. Når etablert for et bestemt mål, til tross for manglende evnen til å analysere morfologiske egenskaper, strømningscytometrisk deteksjon av overflate og intracellulære antigener eller intracellulære antigener alene er kompatibelt med konvensjonelle fluorescens-mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres her er vel etablert for neural cellekulturer avledet fra humane stamceller, men kan like anvendes på andre neurale cellekilder, inkludert primære neural vev eller cellelinjer. I tillegg til embryonale kilder, kan neurale stamceller og forløperceller ekstraheres fra den nevrogene regioner av voksen hjerne 27. Videre flow cytometri og FACS kan utnyttes til å kvantifisere, analysere og isolere forskjellige cellepopulasjoner, inkludert moden nerveceller 54, 33, astroglia microglial 55, oligodendrocytter 56 eller endotelceller 57 fra postnatal hjernevev.

Uavhengig av kilden, optimale betingelser for fiksering og permeabilization trenger å bli bestemt for hver celletype eksperimentelt, da overskudd av ett av trinnene kan føre til en massiv endring av spredningsegenskaper som påvirker strømningscytometrisk avlesning. Effektivitet av protokollen er også avhengig av stabilligheten av overflatemolekyler poste permeabilization. Det bør bemerkes at ulike overflate epitoper kan bli påvirket av celle manipulering som en del av fremgangsmåten i varierende grad. Også enzymatiske høsting med trypsin erstatning eller liberase-1, for eksempel, kan påvirke en rekke celleoverflate epitoper, men i mindre grad, sammenlignet med bruken av Accutase eller papain 7.

Spesifikke epitoper kan bli påvirket av den samme behandlingen paradigme i varierende grad: mens VCAM-1 (vascular celleadhesjonen protein-1; CD106) kan påvirkes av høsting, dissosiasjon, fiksering og permeabilization i en ganske følsom måte, ICAM-1 ( intercellulært Adhesion Molecule-1; CD54) kan vise en mer robust uttrykk mønster bevart gjennom hele prosedyren 58.

Mens tidligere enten overflaten 25,28 eller intracellulær antigen merking 14 er anvendt i neurobiology paradigmer, tilnærminger kombinere både methods 38 kan gi nye nevrale overflateantigen kandidater og gi ytterligere cytometrisk avlesning alternativer.

Vi gjennomfører rutinemessig overflaten flekker skritt før intracellulær antigen flekker og har brukt som strategi for å utvide vår sett med overflatemarkører for neuropoiesis 38 ved hjelp av en rekke menneskelige nevrale cellelinjer. Titrering av antistoff og inkubasjonstider må bli optimalisert for de respektive celletyper, målrette epitoper og eksperimentelle paradigmet. Tilsvarende må CFSE konsentrasjonen og mengden av celler som brukes per farging optimaliseres for hver cellelinje, som ikke alle cellelinjer sette flekker på en identisk måte med den samme mengde av CFSE konsentrasjon.

CFSE har en maksimal eksitasjon på 494 nm og emisjon av topp 521 nm (grønn kanal, FL-1-detektor), derav en hvilken som helst fluorescenslekkasjer til andre kanaler må kompenseres for å bestemme spesifikk fluorescensemisjonen. Alternative fargestoffer som for eksempel Cell Trace Violet (CTV), Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD), Horizon V550, Horizon V450 har blitt prøvd og testet for å bli brukt i stedet for CFSE 59,60.

I strømningscytometri, er det viktig å bestemme den faktiske spesifikke fluorescerende signal fra bakgrunnen. Derfor er de mest hensiktsmessige kontroller må være nøye utvalgt, og kan omfatte hjelp av en ikke-nevral eller på annen måte negativ cellelinje for å understreke antistoffspesifisiteten (såkalt intern negative kontroller 38,46). Autofluorescens av hver celle kilde må tas i betraktning. Isotype kontroller kan betraktes i stor grad unnværlig i de fleste nervecelle deteksjon paradigmer 13,46.

Gitt den store variasjoner observert i cellekultursystemer (spesielt de som er avledet fra stamceller), og av fargingsprosedyre, er inkluderingen av biologiske replikater anbefales sterkt. Det skal bemerkes at bruk av genetiske reportere er etannen måte å bruke nevrale flowcytometri 61,62. Nylig, Maroof et al. Benyttet en Nkx2.1-GFP reporter tilnærming for å sortere forskjellige kortikal-lignende nevronale subpopulasjoner fra humane embryonale stamceller 63.

En up-and-coming feltet er representert ved undersøkelsen av nevrale exosomes i biomedisinske områder så forskjellige som tumorbiologi og nevrodegenerasjon 64, og flowcytometri av exosomes eller deres isolasjon ved perle-baserte analyser gir viktige verktøy for denne søken 65. For beslektet video protokollen se 66.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Life Technologies 11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+ Life Technologies 14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x) Life Technologies 11140035
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250061
Paraformaldehyde Carl Roth 335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V PAA Laboratories, Coelbe K41-001
Tween-20 Detergent Calbiochem 655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eBioscience 65-0850-84
DMSO AppliChem A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml Millipore SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25) NUNC 156367
Cell culture treated flasks (T 75) NUNC 156499
Conical tubes (15 ml) Greiner Bio-One 188271
Conical tubes (50 ml) Greiner Bio-One 227261
Pasteur pipet, glass (150 mm) STEIN Labortechnik, Remchingen S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl) Corning 4125
Pipet tips (1-200 µl) Corning 4126
Pipet tips (100-1000 µl) Corning 4129
Serological pipets, 5 ml Corning 4051
Serological pipets, 10 ml Corning 4101
Serological pipets, 25 ml Corning 4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) Sarstedt 72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Greiner Bio-One 616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) Sarstedt 72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody eBioscience 17-0247-42 Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody eBioscience 12-0549-42 Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody Covance PRB-435P Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit Life Technologies A21206 Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit Life Technologies Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber Marienfeld 0640010
Vortex Scientific Industries G560E
Thermomixer comfort Eppendorf 5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer Becton Dickinson (BD) 653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R Peqlab 91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC Hettich 4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 Thermo Scientific 51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i Thermo Scientific 51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort Integra Biosciences 158320
Microscope, Axiovert 40 CFL Zeiss 451212
Pipet controller, accu-jet pro Brand 26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) Gilson F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) Gilson F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) Gilson F144566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  2. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
  3. Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
  4. Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
  5. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  6. Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
  7. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  8. Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
  9. Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
  10. McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
  11. Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
  12. Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
  13. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  14. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  15. Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
  16. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  17. Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  18. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  19. Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
  20. Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
  21. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
  22. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  23. Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
  24. Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
  25. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
  26. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
  27. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
  28. Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
  29. Peh, G. S. -L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
  30. Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
  31. Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
  32. Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
  33. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
  34. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  35. Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
  36. Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  37. Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
  38. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
  39. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
  40. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
  41. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  42. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  43. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
  44. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
  45. Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
  46. Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
  47. Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
  48. Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
  49. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
  50. Tham, C. -S., Lin, F. -F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
  51. Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
  52. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
  53. Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
  54. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
  55. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  56. Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
  57. Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
  58. Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
  59. Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  60. Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
  61. Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
  62. Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
  63. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  64. Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
  65. Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
  66. Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  67. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
  68. Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
  69. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
  70. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
  71. Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
  72. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Tags

Nevrovitenskap CD markører overflateantigener intracellulære antigener flowcytometri nevroner gliaceller neurale stamceller fluorescensaktivert celle sortering (FACS) CD24 CD54 CFSE
Flowcytometrisystemer protokoller for Surface og Intracellulær Antigen Analyser av Neural celletyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., … More

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter