We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.
Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.
फ्लो बड़े पैमाने पर आंतरिक बिखराव गुण, कोशिका की सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति, और अन्य प्रतिदीप्ति मापदंडों 1-3 के माध्यम से सेल आबादी को परिभाषित करने के इम्यूनोलॉजी, रुधिर विज्ञान और ऑन्कोलॉजी में शोषण किया गया है। खून वंश विकास और रोग में हमारी अंतर्दृष्टि अपनी आरंभिक कार्यान्वयन 4,5 के बाद इस पद्धति की निरंतर शोधन का एक महत्वपूर्ण डिग्री करने के लिए एक परिणाम है। प्रवाह के मात्रात्मक और समग्र विश्लेषणात्मक क्षमता का जागरूकता बढ़ी cytometry के हाल ही में स्टेम सेल अनुसंधान के क्षेत्र में अपनी और अधिक व्यापक उपयोग के लिए प्रोत्साहित किया है और एक छोटे समय सीमा 6 में इसी तरह गहरा प्रगति सक्षम हो सकता है। हालांकि, विशेष रूप से तंत्रिका आबादी का विश्लेषण और अलग करने के लिए फ्लो के आवेदन लंबे समय से चुनौतीपूर्ण के रूप में माना गया है। स्वाभाविक रूप से निलंबन में मौजूद hematopoietic कोशिकाओं के विपरीत, तंत्रिका कोशिका प्रकार के आम तौर glia और विभिन्न ओ शामिल हो सकते हैं कि जरूरत से ज्यादा जटिल स्रोतों से काटा जाता हैवहाँ आसपास की कोशिकाओं के साथ ही प्रक्रिया असर न्यूरॉन्स की एक जटिल नेटवर्क। नतीजतन, तंत्रिका जीव विज्ञान दैनिक अनुसंधान दिनचर्या में अपनी पूरी क्षमता के लिए फ्लो की चंचलता को लागू करने के लिए अभी तक है। हालांकि तंत्रिका जीव विज्ञान में विश्लेषणात्मक प्रदर्शनों की सूची का एक महत्वपूर्ण तत्व माना जा सकता है, के रूप में लंबे समय से एक व्यवहार्य एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न किया जा सकता है (और प्रोटोकॉल उद्देश्य है कि 7 के लिए तैयार कर लिया और अनुकूलित किया गया है) के रूप में, प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS) 8-11।
। Fluidics, प्रकाशिकी और इलेक्ट्रॉनिक्स: प्रवाह cytometric विश्लेषण और एक प्रवाह cytometer के घटकों के चित्रा 1. सिद्धांत प्रवाह cytometers तीन मुख्य सिस्टम शामिल। निलंबन में कोशिकाओं की एक सुव्यवस्थित प्रवाह म्यान flui द्वारा पूरा किया है (प्राथमिक ऊतक या इन विट्रो संस्कृति में से तैयार)hydrodynamic के माध्यम से घ इसके केंद्र कोर करने के लिए नमूना सीमित केंद्रित थी। ऑप्टिकल भागों उपयुक्त डिटेक्टरों के लिए संकेत प्रत्यक्ष कि कोशिकाओं और ऑप्टिकल फिल्टर की धारा रोशन कि पराबैंगनीकिरण से बना रहे हैं। इलेक्ट्रॉनिक संकेतों, बाद में एक कंप्यूटर द्वारा संसाधित और डेटा विश्लेषण और gating के लिए एक निगरानी पर कल्पित करने के लिए परिवर्तित कर रहे हैं पता लगाया प्रकाश का संकेत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एक कोशिकामापी की इमारत ब्लॉकों सहित अंतर्निहित बुनियादी बातों का कम से कम एक बुनियादी समझ से प्रवाह cytometric विधियों लाभ के उपयोगकर्ता (समीक्षा के लिए 12,13 देख, यह भी चित्रा 1 देखें)। एक लेजर बीम बदले में 'एकल फाइल' एक के बाद एक में लेजर बीम के माध्यम से पारित जो निलंबन में कोशिकाओं, जिसमें एक hydrodynamically ध्यान केंद्रित fluidic धारा के साथ intersects। interceptiइस पूछताछ के बिंदु से प्रकाश के प्रकीर्णन में लेजर परिणामों के साथ एक सेल (या उस बात के लिए किसी अन्य कण) की पर। (; कण / सेल की granulosity दर्शाती पक्ष स्कैटर) बिखरे हुए प्रकाश, साथ ही सीधा अपनी दिशा के लिए (कण के आकार के साथ जुड़े आगे तितर बितर, लेजर) दिशा की निरंतरता में पता लगाया जा सकता है। इन aforementioned बिखराव गुण (भी या सेलुलर मलबे, हवा के बुलबुले, आदि) एक unlabeled नमूना सामान्यतः प्रारंभिक gating के लिए प्रयोग किया जाता पक्ष तितर बितर साजिश बनाम द्विचर आगे तितर बितर पर एक संकेत (घटना) उत्पन्न होगा जो कारण है कि विशिष्ट लेबलिंग, की आवश्यकता नहीं है। उपयुक्त लेज़रों और इसी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए विशिष्ट फिल्टर का उपयोग करके, एक सेल अपनी सकारात्मकता, तीव्रता के स्तर पर, या फ्लोरोसेंट मार्करों के अभाव के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। प्रवाह cytometric अनुप्रयोगों के बहुमत कोशिका की सतह एंटीजन के माध्यम से लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया है। हिमेटोपोयटिक lineag के विपरीतई, तंत्रिका वंश सतह मिलान अभिव्यक्ति पैटर्न 5 के अनुसार कम बड़े पैमाने पर परिभाषित कर रह गया है। सतह एंटीजन शोषण का एक फायदा जीवित कोशिकाओं ऐसे FACS के रूप में छँटाई लद सेल के अधीन किया जा सकता है। इसके विपरीत, intracellular प्रतिजन धुंधला व्यवहार्य कोशिकाओं की आवश्यकता है कि बहाव के अनुप्रयोगों precluding, मिलान-एंटीबॉडी बातचीत में मध्यस्थता करने के निर्धारण और permeabilization के चरणों की आवश्यकता है। ध्यान से, इस तरह के दृष्टिकोण अभी भी कई मात्रात्मक assays के 14 के साथ ही शाही सेना और प्रोटीन अभिव्यक्ति 15 के लिए नीचे की ओर विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। रुधिर, इम्यूनोलॉजी और ऑन्कोलॉजी अक्सर विशेष उप-जनसंख्या 16 को परिभाषित करने के संयोजन के रूप में एक दर्जन से अधिक मार्कर का इस्तेमाल किया है। इसके अतिरिक्त, जन cytometry या CyTOF अब 30 मापदंडों एक साथ 17,18 अप करने के लिए विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
तंत्रिका स्टेम सेल अनुप्रयोगों के साथ ही प्राथमिक संस्कृतियों 14,19,20 कोशिकाओं की विविधता में लिएइन विट्रो एक आम घटना 21-23 है। ब्याज का लक्ष्य आबादी का प्रतिनिधित्व नहीं कोशिकाओं प्रयोगात्मक readout के 24,25 के लिए एक संभावित confounding कारक प्रतीक रहे। सुविधाजनक, एक विषम सेल निलंबन के भीतर मौजूद विभिन्न सेलुलर कैंपेन्स इन विभिन्न आबादियों को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो अलग (जाना जाता है या अभी तक deciphered जा सकता है) प्रतिजन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, सहन। जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की सुविधा है, इसलिए इस प्रकार, सेलुलर विविधता को हल करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं और प्रवाह cytometry (इन विट्रो assays, सेल थेरेपी) और सबसे अधिक प्रासंगिक सबसेट 24,26 पर ध्यान केंद्रित करके मात्रात्मक readout के अनुकूलन। विभिन्न सतह प्रतिजन संयोजन विशिष्ट तंत्रिका कोशिका प्रकार के quantitation और अलगाव की अनुमति के लिए पिछले कुछ वर्षों में पहचान की गई है। यह तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को 27, एनएससी के अलगाव के लिए CD15 / CD24 / CD29 सतह एंटीजन का एक संयोजन, differentia के संवर्धन के लिए CD133 शामिलटेड न्यूरॉन और तंत्रिका शिखा कोशिकाओं 28 या CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 अन्य हस्ताक्षर 29,30 के बीच तंत्रिका और glial कैंपेन्स 25, अलग करने के लिए। न्यूरॉन्स के अलावा, glial मार्करों A2B5 31 CD44 25, NG2 32 और GLAST 33 में शामिल हैं। हाल के एक प्रकाशन पार्किंसंस कोशिका प्रत्यारोपण में डोपामिनर्जिक व्यापारियों के लिए समृद्ध करने के लिए मध्यमस्तिष्क floorplate अग्रदूत मार्कर CORIN 34,35 36 लद का शोषण किया है। सीडी अणुओं केवल मार्कर नहीं कर रहे हैं, लेकिन सेल सेल बातचीत की और एक सेल की क्षमता के कार्यात्मक प्रासंगिक मध्यस्थों बाह्य मैट्रिक्स अणुओं से संकेत करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए और विकास के 37 कारकों। आगे तंत्रिका वंश विकास चिह्नित करने के लिए मिश्रित सीडी एंटीजन के शस्त्रागार को बढ़ाने की एक रणनीति के ब्याज की एक विशेष सेल प्रकार के लिए सीडी प्रतिजन संयोजन के लिए स्क्रीन और परिभाषित करने के लिए जाना जाता है इंट्रासेल्युलर मार्कर का उपयोग करने के लिए है। हमने हाल ही में इस तरह के एक दृष्टिकोण शोषण और सीडी 4 की पहचान की है9 फ – / CD200 neurally भेदभाव प्रेरित स्टेम सेल संस्कृति सिस्टम 38 से न्यूरोनल कैंपेन्स समृद्ध बनाने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण के रूप में उच्च मिश्रित अभिव्यक्ति पैटर्न। यहाँ, हम में शामिल हैं और बाद के प्रोटोकॉल (और उसके वैकल्पिक रूपों) में जो सतह धुंधला और intracellular धुंधला फ्लो द्वारा तंत्रिका कोशिका उप-जनसंख्या को परिभाषित करने के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है पर चर्चा की।
प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विकल्पों में से चित्रा 2. प्रवाह आरेख। आंकड़ा प्रोटोकॉल में शामिल प्रमुख कदम के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दर्शाया गया है। वैकल्पिक कदम (CFSE डाई या intracellular प्रतिजन लेबलिंग) हल्के भूरे रंग के बॉक्स से संकेत कर रहे हैं। कटाई के बाद, यह कोशिका की सतह धुंधला करने से पहले तंत्रिका कोशिका निलंबन की व्यवहार्यता और सेल नंबर का आकलन करने के लिए आवश्यक है। सकारात्मक रूप मेंसाथ ही नकारात्मक नियंत्रण हित के नमूनों के अलावा में शामिल होने की जरूरत है। नमूने प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया है और / या सेल छँटाई लद में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
हम पहले से intracellular धुंधला 38 के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयोजन में प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है, अब हम जिससे सेल हेरफेर 39 के इस कदम को कम करने, एक मामूली बदलाव के रूप में फ्लोरोसेंट फैब टुकड़े (Zenon लेबलिंग) के माध्यम से प्राथमिक एंटीबॉडी के गैर-सहसंयोजक लेबलिंग परिचय। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा का एक और उदाहरण के रूप में, हम प्रतिजन धुंधला करने के लिए सतह से पहले succinimidyl एस्टर (CFSE) Carboxyfluorescein से एक प्रयोगात्मक सबसेट का एक वैकल्पिक लेबलिंग रोजगार। इस तरह के CFSE पूर्व लेबलिंग दो सेल लाइनों या प्रयोगात्मक शर्तों के तत्काल सीधी तुलना (सक्षम बनाता हैबनाम CFSE लेबल। एक भी नमूना ट्यूब, विचरण या ऊष्मायन समय में सूक्ष्म अंतर को कम करने और एंटीबॉडी बचत के भीतर) लेबल हटाया गया। CFSE सामान्यतः प्रसार 41,42 और barcoding प्रयोगों 43,44 में, सेल ट्रैकिंग 40 के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक स्थापित फ्लोरोसेंट रंजक है। वास्तविक छँटाई कदम (FACS, immunomagnetic सेल जुदाई या immunopanning) इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं हैं, जबकि अंत में, सिद्धांत रूप में, यहाँ वर्णित कटाई और लेबलिंग प्रक्रियाओं antigen- या intracellular लेबलिंग आधारित छँटाई अनुप्रयोगों के लिए सतह के अधीन किया जा सकता है कि उपज नमूने 15 25,28।
इस लेख के साथ, हम करने के लिए लक्ष्य: एक के रूप में एक intracellular CFSE डाई लेबलिंग कदम 41,45 मौजूद है, एक इंट्रासेल्युलर ठिकानों का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल के साथ ही संयुक्त सतह और intracellular प्रतिजन विश्लेषण 38 को संक्षेप में, एक व्यवहार्य सतह प्रतिजन धुंधला प्रोटोकॉल 25,28 को संक्षेप में कॉम के लिए प्रयोगात्मक विकल्पparative तंत्रिका कोशिका आबादी का विश्लेषण करती है, और cytometric विश्लेषण (रणनीति और डेटा प्रस्तुति 47 gating उचित नियंत्रण 13,46,) प्रवाह करने के लिए दृष्टिकोण संक्षेप।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल अच्छी तरह से मानव स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिका संस्कृतियों के लिए स्थापित किया गया है, लेकिन उतना ही प्राथमिक ऊतक या तंत्रिका कोशिका लाइनों सहित अन्य तंत्रि?…
The authors have nothing to disclose.
Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Life Technologies | 11330057 | www.lifetechnologies.com | |
DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14190169 | www.lifetechnologies.com | |
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies | 10270-106 | www.lifetechnologies.com | |
MEM Non-essential amino acids (100 x) | Life Technologies | 11140035 | www.lifetechnologies.com | |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | www.lifetechnologies.com | |
Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250061 | www.lifetechnologies.com | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.3 | www.carlroth.com | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe | K41-001 | www.gelifesciences.com | |
Tween-20 Detergent | Calbiochem | 655205 | www.merckmillipore.de | |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience | 65-0850-84 | www.ebioscience.com | |
DMSO | AppliChem | A1584 | www.applichem.com | |
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore | SCGPU02RE | www.millipore.com | |
Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC | 156367 | www.thermoscientific.com | |
Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC | 156499 | www.thermoscientific.com | |
Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One | 188271 | www.greinerbioone.com | |
Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One | 227261 | www.greinerbioone.com | |
Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen | S03710150 | www.stein-labortechnik.de | |
Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning | 4125 | www.corning.com | |
Pipet tips (1-200 µl) | Corning | 4126 | www.corning.com | |
Pipet tips (100-1000 µl) | Corning | 4129 | www.corning.com | |
Serological pipets, 5 ml | Corning | 4051 | www.corning.com | |
Serological pipets, 10 ml | Corning | 4101 | www.corning.com | |
Serological pipets, 25 ml | Corning | 4251 | www.corning.com | |
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt | 72,699 | www.sarstedt.com | |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One | 616201 | www.greinerbioone.com | |
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt | 72,695,500 | www.sarstedt.com | |
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience | 17-0247-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
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Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience | 12-0549-42 | www.ebioscience.com Working dilution 1:50 |
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Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance | PRB-435P | www.covance.com Working dilution 1:2000 |
|
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies | A21206 | www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000 |
|
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies | Z-25342 | www.lifetechnologies.com | |
Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld | 0640010 | www.marienfeld-superior.com | |
Vortex | Scientific Industries | G560E | www.scientificindustries.com | |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.001 | www.eppendorf.com | |
Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) | 653118 | www.bdbiosciences.com/instruments/accuri | |
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab | 91-PSPIN-24R | www.peqlab.de | |
Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | www.heidolph-instruments.de | |
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich | 4480-50 | www.hettichlab.com | |
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific | 51026640 | www.thermoscientific.com | |
CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific | 51026331 | www.thermoscientific.com | |
Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences | 158320 | www.integra-biosciences.de | |
Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss | 451212 | www.zeiss.de | |
Pipet controller, accu-jet pro | Brand | 26303 | www.brand.de | |
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson | F144563 | www.gilson.com | |
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson | F144565 | www.gilson.com | |
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson | F144566 | www.gilson.com |