Introduction
Akım sitometri yoğun içsel dağılım özellikleri, hücre yüzey antijeni ifade ve diğer floresan parametreleri 1-3 vasıtasıyla hücre popülasyonlarının tanımlamak için immünoloji, hematoloji ve onkoloji istismar edilmiştir. Kan soy geliştirme ve hastalık halinde bizim anlayışlar ilk uygulama 4,5'ten sonra bu metodolojinin sürekli arıtma önemli ölçüde bir sonucudur. Akış nicel ve genel analitik potansiyeli artan farkındalık sitometri son zamanlarda kök hücre araştırmalarında da daha yaygın kullanımını teşvik etmiştir ve kısa bir zaman dilimi 6 benzer derin ilerleme sağlayabilir. Ancak, özellikle nöral popülasyonları analiz ve izole etmek için akış sitometri uygulaması uzun zorlu olarak algılanmıştır. Doğal olarak süspansiyonda mevcut hematopoietik hücrelerin aksine, sinir hücresi tipleri, tipik olarak glia ve çeşitli o içerebilir aşırı derecede karmaşık kaynaklardan toplanırTher çevreleyen hücreleri ve aynı zamanda işlem taşıyan nöronların karmaşık bir ağdır. Sonuç olarak, nörobiyoloji günlük araştırma rutinleri onun tam potansiyeline flow sitometri çok yönlülüğünü uygulamak için henüz. Ancak nörobiyolojisinde analitik repertuarın değerli unsuru olarak kabul edilebilir olduğu sürece uygun bir tek hücre süspansiyonu elde edilebilir (ve protokoller bu amaçla 7 için tasarlanmış ve optimize edilmiş) halinde, akış sitometrisi ve floresans ile aktive edilen hücre çeşitleme (FACS) 8-11.
. Fluidik, optik ve elektronik: akım sitometri analizi ve bir akış sitometresinde bileşenlerinin Şekil 1. İlke akış sitometrelerinde üç ana sistemleri içermektedir. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin bir akıcı akış kılıf flui ile gerçekleştirilir (birincil doku ya da in vitro kültürü hazırlanmış)hidrodinamik yoluyla d merkez çekirdek örneği kısıtlayan, odaklama. Optik parçalar uygun dedektör sinyal doğrudan hücrelere ve optik filtrelerin akışı aydınlatmak lazerler oluşmaktadır. elektronik sinyaller, daha sonra bir bilgisayar tarafından işlenir ve veri analizi ve yolluk için bir monitörde görüntülenebilir dönüştürülür tespit ışık sinyalleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir sitometresinin yapı blokları dahil altta yatan temelleri en azından temel bir anlayış akış sitometri yöntemleri kar Kullanıcılar (inceleme için 12,13 görüyorum; ayrıca bakınız Şekil 1). Bir lazer ışını da 'tek dosya' birbiri ardına lazer ışınının geçmesine süspansiyon hücreleri içeren bir hidrodinamik odaklı akışkan akışı ile kesişir. interceptiBu sorgulama alanına ışık saçılması lazer sonuçları ile hücre (veya bu konuda herhangi bir diğer parçacık, sırasıyla) ile. (Parçacık / hücre granulosity yansıtan tarafında dağılım) Dağınık ışık, hem de dik olan doğrultu (parçacık boyutu ile ilişkili ileri dağılım, hem) lazer yönünde devamında tespit edilebilir. Bu Anılan dağılım özellikleri (aynı zamanda veya hücresel enkaz, hava kabarcıkları, vb) bir etiketsiz örnek yaygın ilk yolluk için kullanılan yan dağılım grafiği iki değişkenli ileri saçılma bir sinyal (olay) üretecektir neden özel etiketleme, gerekmez. Uygun lazerler ve karşılık gelen uyarma ve emisyon spektrumu için özel filtreler kullanılarak, bir hücrenin pozitiflik, yoğunluk seviyesinde veya flüoresan işaretler yokluğu için analiz edilebilir. Akış sitometrik uygulamalarının çoğunluğu hücre yüzey antijenleri üzerinden karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır. Hematopoietik lineag aksineE, sinir soy yüzey epitop ifade desenleri 5'e göre daha az kapsamlı tanımlanmış kalmıştır. Yüzey antijenleri istismar bir avantajı, canlı hücreler, FACS gibi sıralama paradigmalar hücre tabi olmasıdır. Buna karşılık, hücre içi antijen boyama canlı hücreler gerektiren mansap uygulamaları engelleyen, epitop-antikor etkileşimi aracılık tespit ve permeabilization adımları gerektirir. Dikkat çekici bir şekilde, bu tür yaklaşımlar yine çok nicel deneyleri 14 yanı sıra, RNA ve protein ekspresyonu 15 alt baş analizler için izin verir. Hematoloji, immünoloji ve onkoloji genellikle belirli alt popülasyonlar 16 tanımlamak için birlikte bir düzineden fazla belirteçleri kullandık. Ayrıca, kitle sitometri veya CyTOF geç 30 parametreleri aynı anda 17,18 kadar analiz etmek için kullanılabilir.
Nöral kök hücre uygulamaları yanı sıra birincil kültürlerin 14,19,20 hücrelerin heterojen olarak içinIn vitro ortak bir olgudur 21-23 olduğunu. ilgi hedef kitleyi temsil etmeyen hücreler deneysel okuma 24,25 için bir potansiyel karıştırıcı faktör somutlaştırmak. Uygun, heterojen bir hücre süspansiyonu içinde bulunan farklı hücresel alt kümeleri bu çeşitli popülasyonları tanımlamak için kullanılabilir farklı (bilinen veya henüz deşifre edilecek) antijen ifade profilleri, ayı. Biyomedikal uygulamaları kolaylaştırmak, dolayısıyla böylece, hücresel heterojenite çözümünde önemli bir rol oynayabilir ve Flow sitometri (in vitro deneyler, hücre tedavisi) ve en alakalı alt kümesi 24,26 odaklanarak kantitatif okuma optimize. Çeşitli yüzey antijen kombinasyonları özel nöral hücre tiplerinin kantitatif ve izole izin vermek için son birkaç yıl içinde tespit edilmiştir. Bu nöral kök hücreler 27 NSC izolasyonu için CD15 / CD24 / CD29 yüzey antijenlerinin kombinasyonu, differentia zenginleştirilmesi için CD133 içerirTed nöron ve nöral krest hücreleri 28 veya CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271, diğer imzalar 29,30 arasında nöral ve glial alt kümeleri 25, izole etmek. Nöronlar ötesinde, gliyal belirteçler A2B5 31, CD44, 25 NG2 32 ve GLAST 33 içerir. Son zamanlarda yayın Parkinson hücre nakli dopaminerjik öncüleri zenginleştirmek için orta beyin tabanının habercisi işaretleyici CORIN 34,35 36 paradigmalar istismar etmiştir. CD molekülleri sadece belirteçler değil, hücre-hücre etkileşimleri ve hücrenin yeteneği fonksiyonel ilgili arabulucular dışı matriks molekülleri ipuçlarını cevap ve büyüme faktörleri 37. Ayrıca sinir soy gelişimini karakterize etmek için kombinasyon CD antijenlerinin cephanelik arttırıcı bir strateji, söz konusu özel bir hücre tipi için bir CD antijeni kombinasyonu için taranması ve tanımlamak için bilinen hücre içi belirteçler kullanmaktır. Biz son zamanlarda böyle bir yaklaşım sömürülen ve CD4 belirledik9f - / CD200 nöral ayırt uyarılmış pluripotent kök hücre kültürü sistemleri 38 nöronal alt kümelerini zenginleştirmek için yeni bir yaklaşım olarak yüksek birleştirici ifade desenleri. Burada, içerir ve ikinci protokolü (ve bunların isteğe bağlı varyasyonlar) 'in yüzey boyama ve hücre içi boyama akış sitometrisi ile nöral hücre alt-popülasyonunu tanımlamak için aynı anda kullanılabilir tartışır.
Deneysel protokol seçenekleri Şekil 2. akış diyagramı. Şekil protokolde yer alan önemli adımlardan şematik bir temsilini tasvir etmektedir. İsteğe bağlı adımlar (KAKE boya veya hücre içi antijen etiketleme) açık gri kutular ile gösterilir. Hasattan sonra, bu hücre yüzey boyamadan önce nöral hücre süspansiyonlarının yaşayabilirliği ve hücre sayısını belirlemek için gereklidir. Pozitif olarakde negatif kontroller olarak ilgi örneklere ek olarak dahil edilmesi gerekir. Numuneler akım sitometri ile analiz ve / veya hücre sıralama paradigmalar kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Daha önce hücre içi boyama 38 için ikincil bir antikor ile kombinasyon halinde birincil antikor kullanmış iken, şimdi, böylece hücre manipülasyonu 39 aşamaları azaltarak küçük bir değişikliği gibi floresan Fab parçaları (Zenon etiketleme) yoluyla birincil antikor kovalent olmayan etiketleme getirmektedir. Ayrıca, protokolün çok yönlü bir başka örnek olarak, antijen lekeleme yüzey önce süksinimidil ester (CFSE) karboksifloresan ile bir deney alt-grubun isteğe bağlı bir etiketleme kullanır. Böyle KAKE ön-etiketleme, iki hücre hatları ya da deneysel koşullar hemen doğrudan karşılaştırma (sağlarVs KAKE-etiketli. Tek bir örnek tüpü, değişiklik veya inkübasyon süresi ince farklılıkların azaltılması ve antikor tasarruf içinde) etiketsiz. CFSE, yaygın üreme 41,42 ve Barkod deneylerde 43,44, hücre takibi 40 için kullanılan kurulu bir floresan boya olan. Gerçek sıralama adımlar (FACS, immünomanyetik hücre ayırma veya immunopanning) Bu protokolün bir parçası değil ise Nihayet, prensip olarak, burada açıklanan hasat ve etiketleme işlemleri antijen ya da hücre içi etiketleme-tabanlı uygulamaları sıralama yüzey tabi olabilir verim örnekleri yapmak 15 25,28.
Bu makale ile, biz hedefliyoruz: bir olarak hücre içi KAKE boya etiketleme adım 41,45 sunmak, bir hücre içi hedeflerin tespiti için protokol yanı sıra kombine yüzeyi ve hücre içi antijen analizi 38 özetlemek, geçerli bir yüzey antijeni boyama protokolü 25,28 özetlemek com için deneysel seçenekkarşılaştırmalı nöral hücre popülasyonlarının analizleri ve sitometrik analizi (strateji ve veri sunumu 47 yolluk uygun kontrolleri 13,46) akış yaklaşımları özetlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sinir Hücre Hasat
- Mikroskopla Değerlendirme:
- Bir deney başlamadan önce, parlak alan veya faz kontrast mikroskobu ile kültür durumunu kontrol edin.
NOT: disseksiyonlar elde edilen primer sinir dokusu iken, ilke olarak, eşit mükellef sitometri analizi 14,28 akış, protokolün odak in vitro nöral hücre sistemleri elde edilen hücreler üzerinde olduğuna dikkat edin.
- Bir deney başlamadan önce, parlak alan veya faz kontrast mikroskobu ile kültür durumunu kontrol edin.
- Hücrelerin Toplanması 7:
- Yavaşça Mg + 2 ile yapışık hücre çanak / şişe, yıkama / Ca2 + serbest fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), oda sıcaklığında (örneğin, T75 şişesinin 5 mi, 6-çukurlu plaka için oyuk başına 3 ml veya 10 mi için 10 cm çanak).
NOT: PBS protokol boyunca kullanılan Mg 2+ / Ca 2+ ücretsizdir.- Video Örneğin,% 80 birbirine karıştığında, SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin bir T75 şişesinin kullanımı. Durumlarda nerede ek yıkama adımları uygulayınönemli ölçüde çöp kabı içinde mevcuttur.
- Serum albümini içeren PBS 48, Percoll, ya da Ficoll 49 santrifüj gradyanlar ve / veya ticari olarak temin edilebilen boncuklar 50,51 ile yıkama düşünün. Miyelin ve diğer lipid ya da diğer kirletici maddelerin çıkarılması yetişkin birincil doku kaynakları kullanılıyorsa, özellikle önemlidir.
- Doku kültürü kabının tüm yüzeyini kaplar, uygun bir hacminde önceden ısıtılmış (37 ° C), tripsin değiştirme ekleyin.
NOT: Alternatif, Accutase veya diğer enzimatik sindirim seçenekleri göz önünde bulundurun. Bu kritik adım olumsuz (7 bakınız) yüzey epitop ifadesini etkileyebilir. - Hücreleri ayırmak için izin vermek için (hücre tipine göre), 5 dakika - 2 37 ° C 'de çanak / şişeyi inkübe edin. Yavaşça hücreleri çıkarmak için bir serolojik pipet ile doku kültürü gemi veya gömme dokunun. (Bu gibi daha sonraki aşamada hücre kaybı ve pıhtılaşmayı neden olabilir) sindirim üzerinde kaçının.
- Siki kez akış tamponu (PBS içinde% 2 FBS) hacminin eklenmesiyle tripsin değiştirme uench ve 15 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak.
- Tek bir hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere - (1.000 ul, 100) ya da bir 5 mi serolojik pipet yavaşça mikrolitre pipet kullanılarak bir hücre süspansiyonu çiğnemek.
- 25 ° C'de 5 dakika boyunca 220 x g'de hücreleri santrifüjleyin. Dikkatle geride bırakarak pelet süpernatant aspire.
- Yeniden askıya pellet (boyutuna bağlı olarak, akış tamponu uygun hacimde bir pelet gibi, SH-SY5Y hücrelerinin bir T75 şişesinin birleşik için tipik bir verim, en az 10 x 10 6 hücre, bu durumda hücreler içinde Akış tamponu, 5 ml) içinde tekrar süspanse edilir.
NOT: Daha büyük parçalar veya pıhtılaşma gözlenmesi halinde, 30 ile filtre - 100 mikron örgü.
- Yavaşça Mg + 2 ile yapışık hücre çanak / şişe, yıkama / Ca2 + serbest fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), oda sıcaklığında (örneğin, T75 şişesinin 5 mi, 6-çukurlu plaka için oyuk başına 3 ml veya 10 mi için 10 cm çanak).
- Hücre sayımı 52:
- Tr hacminde belli bir oranda bir mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu küçük bir kısım aktarın ve seyreltikypan mavi veya bir hemositometrede transfer veya otomatik hücre sayım sistemi önce alternatif bir canlılığı boya.
- (CFSE etiketi ile devam ise)% 0.1 BSA ile akış tamponu veya PBS uygun hacimde eklenmesiyle, 1 x 10 6 yaşar hücre / ml'lik bir konsantrasyonda hücre süspansiyonu seyreltin.
NOT: Propidyum iyodür, 7-aminoactinomycin D, anneksin V ve piyasada mevcut düzeltilebilir canlılığı tahlil kitleri hücrelerin canlılığını değerlendirmek için alternatif seçenekler temsil eder. Daha önce 53 kullanılabilir tarif edildiği gibi aynı zamanda, apoptoz deneyleri kaspaz-3 floresans kullanılmıştır. Floresan kanallar tüm örneklerin dahil halinde sonraki adımlar için seçenekleri sınırlayabilir Bu reaktiflerin tarafından "işgal" olacak.
CFSE kullanma 2. Hücre içi Boya Etiketleme (Şekil 3)
- Kolayca kullanılabilen bir arzu stok konsantrasyonu CFSE seyreltin.
NOT: Bu deneylerin bir stok konsantrasyonu için0.01 mM kullanılmıştır. Ampirik KAKE optimal çalışma konsantrasyonunu belirlemek. - 0,1 uM değerinde bir nihai konsantrasyona hücrelerin ml başına 0.01 mM CFSE çözeltisi (Bölüm 1.3.2, PBS +% 0.1 BSA içinde, 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda), 10 ul ekle. Kısaca girdap iyice karıştırın.
Not: Burada kullanılan CFSE konsantrasyonları boyanın toksikliği hücre dolayısıyla, genel olarak çoğalma deneylerinde uygulanabilir göre daha düşük bir on-kat azdır. Biz hücre canlılığı üzerindeki olumsuz etkilerini gözlemlemek yok. - Sabit şekilde çalkalanarak (200 rpm) oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Işıktan koruyunuz.
- Tüplere akış tamponu 5 hacmi eklenerek boya söndürüldü. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 94 x g'de santrifüjleyin.
- Geride bırakarak pelet süpernatant atın. Akış tamponu, 5 hacim ile hücrelerin yeniden askıya.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 94 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 1 x 10 6 hücre konsantrasyonunda akış tamponu içerisinde hücrelerin yeniden askıya / mi.
- Lekeli hücre süspansiyonu ilgi boyanmamış hücrelerin eşit sayıda ekleyin. Antijen boyama protokolü (Bölüm 3) yüzey geçin.
CFSE, boya etiketleme. SH-SY5Y nöroblastoma hücreleri ile iki hücre hatları arasında farklı CD yüzey antijeni ifade Şekil 3. Algılama önceden etiketlenmiş olan etiketlenmemiş BJ fibroblastlar ile karşılaştırıldığında daha sonra tespit edilebilmesi için CFSE ile. (; Ok uçları = BJ fibroblastlar ok = SH-SY5Y) yüzey işaretleyicileri CD24 ya da CD54 (her ikisi de APC birleşik) ile karıştırılmış numunenin (sağ panel) eş zamanlı boyama hücre çizgileri bağlı CFSE boyama kolaylıkla ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. SH-SY5Y hücrelerinin çoğunluğu CD24 fakat CD54 (ICAM-1) ifade etmektedir. Buna karşılık, BJ fibroblastlar (negatif KAKE) CD54 pozitif ama CD24 için büyük ölçüde olumsuzdur."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
3. Hücre Yüzey Boyama
- Numunelerin ve kritik kontroller (Tablo 1) olmak üzere Etiket tüpler.
| Tüp hayır. | Örnek adı | Antijen-florofor | Seyreltme |
| 1 | Lekesiz hücreler | - | |
| 2 | Tek lekeli | CD24-APC | 01:50 |
| 3 | Tek lekeli | Tuj1-Alexa fluor 488nm | 1: 2000 |
| 4 | Lekeli Çift | CD24-APC | 01:50 |
| Tuj1-Alexa fluor 488nm | 1: 2000 | ||
| 5 | Tek lekeli | İkincil Sadece: Alexa fluor 488nm | 1: 2000 |
Tüplerin Tablo 1. L ist deney sitometrisi tipik akış dahil edilecek. Tablo, bu video makalede tarif edilen bir ko-lekeleme deneyi için gerekli örnek tüplerinin en az bir setini göstermektedir. İdeal deney elde edilen sonuçların doğru yorumlanması için gerekli tüm kontrolleri (negatif, pozitif yanı sıra tazminat kontrolleri) içermesi gerekir.
- Her bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (Bölüm 2.7 veya 1.3.2 itibaren) hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
NOT: Emin 0,1 x 10 6 hücre minimum hücre süspansiyonu 100 ul başına mevcut olduğundan emin olun. - Uygun seyreltmede örnek flüorofor konjuge antikor ekleyin.
NOT: deney öncesinde her antikor için seyreltme çalışma belirleyin. Bir liste için o Tablo 2 bakınızf sinir yüzey antijenleri.
| Antijen | Hücre Tipi | Referans |
| CD15 | Nöral kök hücreler | [28, 67] |
| CD24 | Nöronal hücre | [28, 68] |
| CD29 | Nöral kök hücreler | [28, 69, 70] |
| CD44 | Glial hücreler | [25] |
| CD49f | Nöral kök hücreler | [38] |
| CD56 (NCAM) | Nöronal hücre | [71] |
| CD133 | Nöral kök hücreler | [27] |
| CD184 | Nöral kök hücreler ve glial hücreler | [25] |
| CD200 | Nöronal hücre | [38] |
| CD271 | Nöral krest kök hücreleri | |
| A2B5 | Glial hücreler | [31] |
| CORIN | Dopaminerjik öncüleri | [35, 36] |
| FORSE1 | Nöral kök hücreler (MGK) | [72] |
| GLAST | Glial hücreler | [33] |
| NG2 | Glial hücreler | [32] |
Sinir yüzey antijenlerinin Tablo 2. seçilmesi. Bu tabloda, sinir soyu karakterize etmek için kullanılan yüzey antijenleri artan paneli örnek için çeşitli sinir hücresi tipleri tarafından eksprese edildiği yüzey epitoplarının bir listesini sağlar. Bu seçim tam ve bu belirteçlerin çoğu diğer nöral ve nöral olmayan hücrelerin bir dizi ifade olduğunu olmaktan uzak olduğunu unutmayın. Sonuç olarak, çok sayıda markalama kombinasyonları için daha iyi tanımlaması ve belirtilen sinir alt kümeleri izole etmek için gerekli olacaktır.
- Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (200 rpm) üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin.
- Akış tampon yıkama
- Tüplere akış tamponu 1 ml ilave edilir. 4 ° C de 4 dakika boyunca 380 x g'de santrifüjleyin.
- Geride bırakarak pelet süpernatant atın.
- Tekrar yıkama adımı tekrarlayın.
- İkinci yıkamadan sonra, süpernatant süzün ve 100 ul son hacim olması için akış tamponu içerisinde hücrelerin yeniden askıya.
- Akım sitometri analizi için numune kullanın. Alternatif olarak, Bölüm 4 ve 5 ile devam edin.
NOT: Hücreler sıralanır ve kültür sonrası FACS içine geri koymak için ise (yani, fiksasyon veya permeabilization olmadan canlı hücre süspansiyonu), hasat, boyama ve analitik adımlar sırasında aseptik teknikleri uygulamak.
4. Sabitleme ve Permeabilization 38
- Sabitleme kullanarak paraformaldehid (PFA):
- PBS içinde% 2 PFA içeren sabitleme tamponu hazırlayın.
- Hücre süspansiyonunun 100 ul sabitleme tampon 500 ul ekle.
- Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (100 rpm) üzerinde 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- PBS içinde% 2 PFA içeren sabitleme tamponu hazırlayın.
- PBS yıkama:
- Tüpüne PBS içinde 1 ml ilave edilir. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 380 x g'de santrifüjleyin.
- Tüp yaklaşık 100 ul bırakarak süpernatant süzün / atın.
- Tween-20 ile geçirgenleştirme:
- PBS içinde% 0.7 Tween-20 içeren permeabilizasyon tampon hazırlayın.
- Hücre süspansiyonunun 100 ul permeabilizasyon tampon maddesi içinde 500 ul ekle.
- Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (100 rpm) üzerinde 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- (Bölüm 4.2 de tarif edildiği gibi), bir kez PBS ile hücre yıkayın ve tüpler co süpernatanmpletely, geride sadece topak bırakılmıştır.
5. Hücre içi Antijen Boyama 38 (Şekil 4)
- Birincil antikor çözeltileri hazırlanması:
- % 1 sığır serum albümin,% 10 serum (örneğin, normal eşek veya keçi serumu) ve% 0.5 Tween-20 ile PBS içinde ihtiva eden seyreltme tamponu içinde primer antikorlar ile seyreltilir.
NOT: İkincil antikorlar büyütüldüğü türe bağlı kullanılmak üzere serum seçin. - Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak primer antikorun Zenon floresan etiketleme kullanın.
- Uygun bir seyreltme (20 ul ≤ toplam hacim) PBS içinde birincil antikor 1 ug hazırlayın.
- Antikor çözeltisi Zenon floresan IgG etiketleme reaktifi (Bileşen A) 5 ul ekle.
- Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı.
- Reaksiyon karışımına Zenon bloke belirteci (Bileşen B), 5 ul ekle.
- Kuluçkaya yatmakOda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir karışımı. 30 dakika içinde örnek antikor uygulayın.
- % 1 sığır serum albümin,% 10 serum (örneğin, normal eşek veya keçi serumu) ve% 0.5 Tween-20 ile PBS içinde ihtiva eden seyreltme tamponu içinde primer antikorlar ile seyreltilir.
- Birincil antikor boyama:
- Hücre pelet birincil antikor solüsyonu, 100 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın çiğnemek.
- Seçenek olarak ise, uygun seyreltme hücre süspansiyonu Zenon fluoresein etiketli antikor ekleyin.
- Işıksız bir orbital bir karıştırıcı (200 rpm) ile 30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. (Bölüm 4.2 açıklar gibi) PBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve arkasında sadece pelet bırakarak, tamamen tüplerin süpernatant kaldırmak.
- (Zenon fosforla etiketlenmiş antikorlar için gerekli değildir) sekonder antikor boyama:
- Uygun bir konsantrasyonda PBS içinde sekonder antikor ile seyreltilir.
- Hücre pelet sekonder antikor çözeltisi 100 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın çiğnemek. Karanlıkta bir çalkalama (200 rpm) ile 30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
- (Bölüm 4.2 açıklandığı gibi) PBS ile numuneleri iki kez yıkayın.
- Akış tamponu ile bir kez yıkayın (Bölüm 3.5).
- Akış tampon yaklaşık 150 ul hücreleri yeniden askıya ve akış sitometresinde analiz.
Yüzeyi ve hücre içi proteinlerin Şekil 4. Eş-boyama. Veri Flow sitometri ikincil + primer yüzey boyama ile birlikte Zenon floresein-tabanlı hücre içi boyama karşı antikor bazlı arasında bir karşılaştırma örneğidir. Y-ekseni (sol üst kadran) ve x-ekseni (sağ alt kadranda) üzerinde özel pozitifliği sırasıyla map2 ve CD24, lekeli hücreleri gösterir. Ko-boyama işleminden sonra ortak MAP2 ve CD24 ifadesi, üst sağ çeyrek dairesi (sağ panel) 'de görülebilir. Ile karşılaştırılmasıAlexa fluor 488.; MAP2-etiketleme verimleri benzer sonuçlar için Zenon floresein (alt) karşı (üst AF488) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
6. Akış Sitometrik Analizi
- Sinyal tespiti için uygun filtreler ile akış sitometresiyle boyama protokolü tamamlanmasından hemen sonra akış sitometrik analiz yapıldı. FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), ve FL-4 (675/25) bant geçiren filtreler ile 488 nm mavi ve 640 nm kırmızı lazer kullanın.
- Enkaz ve ölü hücreleri hariç ileri ve yan dağılım dayalı birincil kapıları ayarlayın.
- Yüzey ve tek lekeli kontrolleri kullanarak spektral örtüşme için boyanmamış örnekleri ve tazminat dayalı ≤0.5% intraselüler antijen için ayarlayın floresan kapıları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol yönlü deneysel yaklaşımlar (Şekil 2) sağlar. En kısa versiyonda, yüzey antijenlerinin basit boyama için bir kılavuz olarak kabul edilebilir (1, 3 ve 6 aşamada). Bunu daha karmaşık bir formda, hücre içi antijenlere bir dizi eş-etiketleme paradigmaların bir sayısı (2 ve / veya 4-5 isteğe bağlı aşama) takip edilebilir. Ayrıca, KAKE etiketleme adım hücre-hücre etkileşimi çalışmalarında alt popülasyonlar hücre etiketleme / izleme için programı örneğidir ya sitometrik barkod deneyleri (adım 2) akış. Canlı hücre popülasyonu (adım 2 de elde edilmiş ve / veya 3) ayırma paradigmalar (FACS) ve post-tür hücre kültürü gibi akış aşağı analiz hücre uygundurlar. Diğer yandan, bir araya hücre içi ve hücre yüzey antijeni boyama (3-5 adımları)kendi başına analitik okuma fırsatları sunmaktadır. Örneğin, (- nöronal FACS / CD200 yüksek imzalar. CD49f tespit etmek Turaç ve arkadaşları 38, tarafımızca uygulanmış) sinir hücresi popülasyonlarının, özellikle alt-gruplarla ilgili Belirli CD antijenlerinin ko-lokalizasyonunu tespit edilmesi. Bu ve diğer örnek, sinir belirteçler CD15, CD29, CD49f ve FORSE1 Bilhassa sinir kök hücreleri ile ilişkili olan Tablo 2, verilen ve CD24 ve CD56 nöronal hücrelerinde bol edilir. Bu belirteçlerin birkaç özel olmakla birlikte, farklı boyama yoğunlukları ve çok değişkenli ifade analizi analizi ve özellikle nöral alt popülasyonlarının izolasyonu için özel işaretleyici setleri tanımlamak için yardımcı olabilir.
Şekil 3 hücre içi boya ve yüzey boyama birleştirici kullanımından elde edilen tipik sonuçlar örneğidir. veriler iki ayrı hücre popülasyonları kolayca i nasıl ayırt edilebileceğini göstermekna bağlı nüfus birinin önce etiketleme örnek karışık. Burada, SH-SY5Y nöroblastoma hücreleri CFSE ile etiketlenmiş ve yeşil bir kanal (FL1 y-ekseni) sergileyen floresan açıkça bu durumda BJ fibroblastlar içinde, lekesiz ikinci popülasyonundan ayrılır. Iken köklü karakteristik fibroblast (CD54) ve nöral (CD24) belirteçleri gösterilmiştir (kendi hedef nüfus mevcut, FL2 veya sırasıyla FL4 floresan, x-ekseni) benzer yaklaşımlar ek tanımlanamayan antijenlere taranması için kullanılabilir. Bundan başka, ilk için ko-kültür deneyleri etiketli, iki (veya daha fazla) alt popülasyonlarının hücre-hücre etkileşimleri etkiler, bu şekilde incelenebilir.
Şekil 4, tespit ve geçirgenleştirmeden sonra CD24-APC ve / veya hücre içi nöronal MAP2 antijeni (FITC kanalı) için boyandı boyanmadan SH-SY5Y hücrelerinin yanı sıra örnekleri göstermektedir. Dağılım özelliklerini etkileyebilir ikincisi, ba olarakckground floresan ve yüzey epitop boyama, araziler hücre içi boyama sonra nöral CD24 ve muhafaza yüzey ifadesini belgelemek için hizmet vermektedir. Ayrıca, CD24-pozitif fraksiyonu üzerinde nöronal MAP2 boyama eş-lokalizasyonu gösterilmiştir. Canlı hücrelerde CD24 yüzey ifadesi kıyasla yüzey antijeni sadık algılama sağlamak için önemlidir. Arka plan üzerinde hücre içi algılama Ayrıca özgüllüğü, non-spesifik antikor bağlanma ve otofloresans teyit edilmesi gerekmektedir. Zenon floresan tabanlı veya birincil + ikincil antikor bazlı stratejiler yoluyla hücre içi antijenlerin tespiti, bu kez daha verimli bir yaklaşım (atlama adımı 5.3) dikkate alınması gerekliliğini ortaya koymaktadır karşılaştırılabilir sonuçlar, verir. Protokol sağlamdır ve yüzey ve sınırlı eşiğe hücre içi belirteçlerin bir dizi birleştirilmiş tespit edilmesini sağlar iken, yakından kuluçka süreleri ve yıkama adımları için uygun önerilirProtokolde yer. Ayrıca, en az üç bağımsız deney tekrarları analiz etme ve markör-spesifik olabilir etiketleme yoğunluğu ve yüzey epitop stabilitesini nota ve daha fazla optimizasyon gerektirebilir tavsiye edilir. Bir kez morfolojik özelliklerini analiz yetisine sahip olmayan rağmen, sadece geleneksel floresan mikroskobu ile uyumlu yüzey ve hücre içi antijenlere ya da hücre içi antijenlere sitometrik algılama, akış belirli bir hedef için kurulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol, insan kök hücrelerinden elde edilen nöral hücre kültürleri için oluşturulmuş, ancak aynı derecede birincil doku ya da nöral hücre hatları dahil olmak üzere, diğer nöral hücre kaynaklarına uygulanabilir. Embriyonik kaynaklardan ek olarak, nöral kök veya progenitor hücreler yetişkin beyin 27 nörojenik bölgelerinden elde edilebilir. Ayrıca, akım sitometri ve FACS olgun nöronlar 54, astroglial 33, mikrogliyal 55, oligodendrositler 56 veya doğum sonrası beyin dokusundan endotel hücreleri 57 dahil olmak üzere çeşitli hücre popülasyonlarının, ölçmek analiz ve izole etmek için kullanılabilir.
Adımlardan birini aşırı akış sitometrik okuma etkileyen saçılım özelliklerinin büyük bir değişikliğe yol açabilir gibi kaynağı ne olursa olsun, tespit ve permeabilizasyon ihtiyacı için uygun koşullar, deney, her hücre türü için belirlenir. Protokol verimliliği de stabil bağlıdırYüzey moleküllerinin Sığ geçirgenliği sonrası. Farklı yüzey epitoplar değişen derecelerde prosedürünün bir parçası olarak hücre manipülasyonu etkilenebilir unutulmamalıdır. Ayrıca tripsin değiştirilmesi veya Liberase®-1 ile enzimatik hasat Örneğin, Accutase veya papain 7 kullanımına kıyasla hücre yüzeyi epitoplarının ancak daha az bir dereceye kadar bir dizi etkileyebilir.
Belirli epitoplar değişen derecelerde, aynı tedavi modelinin etkilenebilir: ise, VCAM-1 (damar hücresi yapışma proteini-1; CD106), oldukça hassas bir şekilde hasat etme, çözünme, sabitleme ve geçirgenliği etkilenebilir ICAM-1 ( Hücreler arası Yapışma Molekülü-1; CD54) prosedür 58 boyunca korunmuş bir daha sağlam ifade desenini görüntüleyebilir.
14 nörobiyoloji paradigmaları uygulanmıştır önce ya yüzey 25,28 veya hücre içi antijen etiketleme yaparken, hem m birleştirerek yaklaşımlarıyeni nöral yüzey antijeni adayları verim ve ek sitometrik okuma seçenekleri sağlayabilir 38 ethods.
Rutin olarak hücre içi antijen boyamadan önce yüzey boyama aşamasını yürütmek ve insan nöral hücre çizgilerinin aralığı kullanılarak neuropoiesis 38 yüzey markerlerinin eden genişleten bu strateji kullanılmıştır. Antikorlar ve kuluçka süreleri titrasyonu, ilgili hücre türleri için optimize edilmesi gereken epitopları ve deneysel paradigma hedef alacaktır. Tüm hücre hatları, CFSE konsantrasyonu, aynı miktarda olan, aynı şekilde leke Benzer şekilde, CFSE konsantrasyonu ve boyama başına kullanılan hücre miktarı, her bir hücre hattı için optimize edilmelidir.
(; FL-1 dedektör yeşil kanal), dolayısıyla diğer kanallar herhangi bir floresan dağıtma özel floresan emisyonu belirlemek için telafi edilmesi gereken KAKE bir zirve 494 nm uyarma ve 521 nm zirve emisyonu vardır. Böyle Ce gibi alternatif boyalarll İz Violet (CTV), Hücre Çoğalma Boya eFluor 670 (CPD), Horizon V550, V450 Horizon başarıyla denenmiş ve yerine KAKE 59,60 arasında kullanılmak üzere test edilmiştir.
Akış sitometrisi, bu arka plan gerçek spesifik floresan sinyalini belirlemek için çok önemlidir. Bu nedenle, en uygun kontroller dikkatle seçilmelidir ve antikor özgüllüğünü altını olmayan bir nöral veya başka olumsuz hücre hattını kullanarak içerebilir (yani iç negatif kontroller 38,46 usare miktarı denir). Her bir hücre kaynağı Otoflöresans dikkate alınmalıdır. İzotip kontrol 13,46 paradigmalar en nöral hücre algılama büyük ölçüde vazgeçilebilir olarak kabul edilebilir.
Hücre kültürü sistemlerinde gözlenen önemli farklılıklar (kök hücrelerden türetilmiş olanlar) Verilen ve boyama işleminin, biyolojik çoğaltır dahil şiddetle tavsiye edilir. Genetik muhabir kullanımı olup, şöyle belirtilmelidirBaşka yolu 61,62 sitometri nöral akışını kullanın. Son zamanlarda, Maroof ark., Insan embriyonik kök hücrelerinden 63 farklı kortikal gibi nöronal alt popülasyonlar sıralamak için bir Nkx2.1-GFP muhabiri yaklaşımı kullanılır.
Bir önümüzdeki yukarı-ve-alan tümör biyolojisi ve nörodejenerasyonda 64 gibi çeşitli biyomedikal alanlarda nöral eksozomlann keşif tarafından temsil ve eksozom flow sitometri veya boncuk-tabanlı deneyleri kendi izolasyon bu arayışı 65 önemli araçlar sağlar. İlgili video protokolü için 66 bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) |  Life Technologies |
11330057 | |
| DPBS without Ca2+ Mg2+ | Life Technologies |
14190169 | |
| Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) | Life Technologies |
10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies |
11140035 | |
| TrypLE Express | Life Technologies |
12604013 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies |
15250061 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth |
335.3 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | PAA Laboratories, Coelbe |
K41-001 | |
| Tween-20 Detergent | Calbiochem |
655205 | |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | eBioscience |
65-0850-84 | |
| DMSO | AppliChem |
A1584 | |
| Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore |
SCGPU02RE | |
| Cell culture treated flasks (T 25) | NUNC |
156367 | |
| Cell culture treated flasks (T 75) | NUNC |
156499 | |
| Conical tubes (15 ml) | Greiner Bio-One |
188271 | |
| Conical tubes (50 ml) | Greiner Bio-One |
227261 | |
| Pasteur pipet, glass (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen |
S03710150 | |
| Pipet tips (0.1-10 µl) | Corning |
4125 | |
| Pipet tips (1-200 µl) | Corning |
4126 | |
| Pipet tips (100-1000 µl) | Corning |
4129 | |
| Serological pipets, 5 ml | Corning |
4051 | |
| Serological pipets, 10 ml | Corning |
4101 | |
| Serological pipets, 25 ml | Corning |
4251 | |
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml) | Sarstedt |
72,699 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Greiner Bio-One |
616201 | |
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | Sarstedt |
72,695,500 | |
| Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody | eBioscience |
17-0247-42 | Working dilution 1:50 |
| Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody | eBioscience |
12-0549-42 | Working dilution 1:50 |
| Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody | Covance |
PRB-435P | Working dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies |
A21206 | Working dilution 1:2,000 |
| Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies |
Z-25342 | |
| Neubauer-Improved counting chamber | Marienfeld |
0640010 | |
| Vortex | Scientific Industries |
G560E | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf |
5355 000.001 | |
| Accuri C6 flow cytometer | Becton Dickinson (BD) |
653118 | |
| Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R | Peqlab |
91-PSPIN-24R | |
| Orbital shaker, Unimax 1010 | Heidolph |
543-12310-00 | |
| Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC | Hettich |
4480-50 | |
| Class II Biological safety cabinet Safe 2020 | Thermo Scientific |
51026640 | |
| CO2 Incubator, Heracell 240i | Thermo Scientific |
51026331 | |
| Vacuum system, Vacusafe comfort | Integra Biosciences |
158320 | |
| Microscope, Axiovert 40 CFL | Zeiss |
451212 | |
| Pipet controller, accu-jet pro | Brand |
26303 | |
| Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson |
F144563 | |
| Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson |
F144565 | |
| Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson |
F144566 |
References
- Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
- Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
- Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
- Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
- McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
- Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
- Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
- Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
- Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
- Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
- Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
- Peh, G. S. -L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
- Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
- Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
- Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
- Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
- Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
- Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
- Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
- Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
- Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Tham, C. -S., Lin, F. -F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
- Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
- Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
- Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
- Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
- Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
- Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
- Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
- Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
- Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
- Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
