Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generation of Human alloantigen spesifikke T-celler fra perifert blod

Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52257
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pathology, University of California, San Diego

Introduction

T-lymfocytter er kritiske komponenter av det adaptive immunsystemet. T-celler er ansvarlige for ikke bare direkte å formidle beskyttende immunresponser mot patogener gjennom en rekke av effektor mekanismer, men også aktivt å opprettholde immunologisk toleranse og selvkobler responsene til andre celler i immunsystemet. Disse funksjonene er rettet gjennom en rekke integrerte signaler, deriblant T-cellereseptoren (TCR) ligering, cytokiner og kjemokiner, og metabolitter 1. Av disse signaler, er av spesiell betydning TCR, da det gir den karakteristiske spesifisitet som definerer den T-celle rolle i adaptiv immunitet. En TCR samvirker med lineære peptid-antigener presentert av MHC (HLA human ortolog) molekyler (pMHC komplekser) i en svært spesifikk og sensitiv måte for å tilveiebringe signaler som initierer T-celle-effektor-funksjon. De biokjemiske parametre for TCR interaksjoner med pMHC ligander gir ikke bare spesifisiteten for Tcelleaktivering, men har også en kvalitativ virkning på etterfølgende T-cellefunksjon 2. Dermed studere T-celle funksjonen krever ofte undersøke svarene av klonale T-celler med definert antigen spesifisitet.

Den humane T-celledelen, som inneholder ca 10 12 αβ T-celler, inneholder anslagsvis 10 juli til 10 august distinkte αβTCRs 3-4. Denne mangfoldige repertoar gir mulighet for anerkjennelse av det store utvalget av peptider fra potensielle patogener som vil nødvendiggjøre en T-celle respons for beskyttende immunitet. Det er anslått at frekvensen av T-celler som reagerer på et gitt fremmed antigen presentert ved selv-MHC er av størrelsesorden 10 -4 til 10 -7 i fravær av forutgående immunrespons mot det antigenet 5. Den naive T-cellerepertoaret er formet av tymisk valg for å sikre evnen til å gjenkjenne selv-MHC antigener og presentere peptid grense reagereivity mot selv peptid antigener, maksimere potensialet verktøy for formidling av beskyttende immunitet to. Men i strid med denne designet reaktivitet, en relativt stor frekvens, 10 -3 til 10 -4, T-celler fra immunologisk naive individer svare på stimulering med allogene celler, erkjenner både de utenlandske MHC molekyler samt endogene peptider de presenterer 6. Erkjennelsen av allogene pMHC ligander er strukturelt lik anerkjennelse av fremmede antigener presentert av selv MHC; TCR gjør kritiske biokjemiske interaksjoner med både allogene MHC-molekylet, så vel som den presenterte peptid 7. Den robuste naturen til responsen av T-celler til allogene stimulering resulterer fra mangfoldet av pMHC komplekser tilstede på overflaten av allogene celler 8. Det er anslått at hvert MHC presenterer omtrent 2 x 10 4 forskjellige endogene peptidantigener 9. Dette breadth av respons på allogene stimulering er et vesentlig aspekt ved den klinisk relevant patologi, slik som allograft-avvisning, eller transplantat-mot-vert sykdom (GVHD), som resulterer fra T-celle alloreactivity.

Utredning av humane T-celle alloreaktive responser har tradisjonelt støttet seg ved å undersøke polyklonale svarene av naive T-celler etter stimulering med allogene celler. Gjentatt stimulering med den samme allogen cellelinje kombinert med begrensende fortynning analyser er i stand til å generere klonale T-celler med definerte anerkjennelse av allogene HLA 10. Dette er imidlertid problematisk metode for undersøkelse av individuelle responser på allogene pMHC ligander, som stort og variert repertoar av endogen pMHC komplekser tilstede for en gitt allogen stimulerer HLA en bred repertoar av T-celler. Denne hovedpopulasjon stimulering og begrensende fortynning tilnærming ville kreve screening av et stort antall kloner for å isolere T-celler med den ønskede Reactiteten mot et enkelt pMHC ligand. I tillegg, er frekvensen av T-celler som responderte til en individuell allogen pMHC ligand relativt lav blant naive T-cellepopulasjoner, som presenterer en barriere for effektiv generering av humane T-cellekloner som reagerer på et gitt antigen.

Identifisering og isolering av antigen-spesifikke T-celler fra polyklonale bestander har blitt aktivert av utviklingen av fluoroforpar-merket pMHC multimerene 11. Denne tilnærmingen benytter spesielle peptidantigener som er lastet inn i rekombinante oppløselige biotinylerte MHC-molekyler som er markert ved binding til en streptavidin-merket fluoroforen. Multimerization av pMHC øker grådighet, og kompenserer for den egen lav (mikrometer) affinitet TCR for løselige pMHC ligander. Merkede celler kan bli identifisert og isolert ved strømningscytometri. Imidlertid er denne metode fremdeles begrenset av den lave frekvensen av antigenspesifikke T-celler hos naive T-cellepopulasjoner, som typiskstørrelsesordener mindre enn grensen på nøyaktig identifikasjon og kvantifisering på de fleste flowcytometere. For å møte denne begrensningen, har en metode for pMHC tetramer merking og påfølgende magnetiske kuler berikelse for tetramerfritt merket celler er utviklet 12. Denne metoden har vist pålitelig deteksjon, telling, og isolering av lavfrekvente antigen-spesifikke T-celler.

Denne protokollen beskriver en effektiv protokoll for generering av humane T-celle-kloner som spesifikt responderer til individuelle allogene pMHC ligander. Protokollen gjelder pMHC (HLA) multimer merking og anrikning for isolering av alloantigen-spesifikke humane T-celler med flowcytometri cellesortering og en robust fremgangsmåte for in vitro-kultur av humane T-celler for å muliggjøre produksjon av T-cellekloner fra enkelt sorterte cellene ( oversikt i figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Denne protokollen krever bruk av perifere blodprøver fra frivillige mennesker. All forskning med mennesker, skal gjennomgås og godkjennes av en menneske Studies Institutional Review Board for å sikre samsvar med Helsinkideklarasjonen (2013) og helseforsikring bærbarhet og Accountability Act of 1996.

1. Isolering av T-celler fra helblod

  1. Før start, varmes densitetsgradient mediet til romtemperatur. Delmengde 4 ml tettshetsgradient medium i 2-4 sterile 15 ml koniske sentrifugerør (1 tube vil bli brukt for hver 10 ml totalt volum av fortynnet blod).
  2. Skaff 10-20 ml blod i 1-2 natrium heparin spraylakkert (grønn-top) venøse blodoppsamlingsrør. Samle menneskelige eksemplarer under veiledning av utdannede personer og ifølge en Institutional Review Board godkjent protokollen.
  3. Tørk utsiden av rørene med 70% etanol. Fjern forsiktig topper av filled prøverør og dekanter blod inn i et sterilt 50 ml sentrifugerør.
  4. Tilsett 10 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS) til hver av blodprøverøret. Samle PBS, legge til dekantert fullblod, og bland forsiktig.
  5. Legg 25 ul human T-celle berikelse Cocktail / 2 ml totalt volum. Inkuber ved romtemperatur i 20 min.
  6. Ved hjelp av en 10 ml pipette, laget opp til 10 ml av 1: 1 fortynnet blod forsiktig på toppen av densitetsgradient-medium. Vær forsiktig med å ikke forstyrre overflaten av densitetsgradienten medium.
  7. Sentrifuger lagdelt blod og densitetsgradient medium ved 1200 xg i 20 min ved 20 o C
  8. Fjerne rørene fra sentrifugen, til å ta vare ikke forstyrre grenseflaten mellom densitetsgradient medium og sjiktet av leukocytter ved grenseflaten mellom det densitetsgradient mediet, og den fortynnede plasma. Ved hjelp av en 5 ml pipette, nøye samle leukocytt laget og overføre til en ny steril 50 ml konisk badekare.
  9. Legg PBS for å bringe volumet av oppsamlet PBL til 50 ml, og bland forsiktig.
  10. Sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter ved 20 ° C. Dekanter.
  11. Resuspender cellene pelletert i 10 ml sterilt flowcytometri sortering buffer (sterilfiltrert PBS inneholdende 1% BSA). Prøve 10 mL av cellesuspensjon, fortynne 01:10 (legg til 90 mikroliter) trypanblått å telle celler ved hjelp av en hemocytometer (forventet avkastning 1-4 x 10 6 celler / tube fullblod).
    1. Fjern 1 ml alikvot, overføre til 5 ml rør, og holde på is for analyse av T-celler som ikke er merket med tetramer. Hold cellesuspensjon på is.

2. Magnetic berikelse av alloantigen-spesifikke T-celler

  1. Fortynne alloantigen pMHC tetramer til 1: 100 i sterile slags buffer.
  2. Sentrifuger cellesuspensjon (9 ml fra trinn 1.11) ved 600 xg i 5 minutter ved 20 o C Dekanter.
  3. Tilsett 50 mL fortynnet alloantigen pMHC tetramer til pelletertceller (opp til 10 7 celler). Bland forsiktig ved pipettering. Overføre til en steril 5 ml tube. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
  4. Tilsett 2 ml slags buffer. Sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter ved 20 ° C. Dekanter.
  5. Resuspender celler i 100 ul slags buffer. Tilsett 10 pl Biotin Seleksjon Cocktail og inkuber i 15 min ved romtemperatur.
  6. Tilsett 5 ul magnetiske nanopartikler og inkuber i 10 min ved romtemperatur.
  7. Legg 2,5 ml slags buffer og bland forsiktig ved pipettering. Fjerne 100 pl alikvot, overføre til 5 ml rør, og holde på is for analyse av pre-berikelse celler.
  8. Plasser 5 ml rør inneholdende cellesuspensjonen i celleseparasjons magnet. Kapselen bør være løst oppå røret. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
  9. Fjerne hetten fra røret forsiktig. Holde røret og magnet sammen, dekanter innholdet i røret inn i en frisk 5 ml tube. Ikke trykk eller riste rørinnholdet tilfjerne de siste dråper av væske.
  10. Fjerne røret fra magneten. Tilsett 2 ml kaldt slags buffer og bland forsiktig ved pipettering. Prøve 10 mL av cellesuspensjon, tynnes 1: 2 (legg til 10 mikroliter) trypanblått å telle celler ved hjelp av en hemocytometer.

3. Utarbeidelse av T-celler for encellede flowcytometrisystemer Cell Sorting

  1. Legg kaldt sorter buffer til alle rør av celler (tetramer umerket, tetramer-merkede un-anriket, og tetramer-merket anriket) for å bringe volumet til 3 ml.
  2. Sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C og dekanter buffer for å utvinne celler.
  3. Suspender pelleterte celler i 25 mL kald slags buffer. Tilsett 5 mL menneskelig Fc blokk. Inkuber på is i 20 min.
  4. Forbered antistoffer for flowcytometri sortering. Bland 15 mL slags buffer, 15 mL anti-CD5, 15 mL anti-CD14, og 15 mikroliter anti-CD19.
  5. Tilsett 20 pl av antistoffblandingen i hvert rør av celler. Inkuber på is i 20 min.
  6. Tilsett 2 ml kald buffer sorter til hvert rør.
  7. Sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter ved 4 ° C og dekanter buffer for å utvinne celler.
  8. Resuspender cellene i en konsentrasjon på 1 -2 x 10 6 celler / ml i buffer sorter.
  9. Delmengde 100 ul av human T-cellekulturmedium (Iscoves DMEM supplert med 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 ug / ml gentamycin, 50 uM 2-merkaptoetanol, 10% varme-inaktivert humant AB-serum, og 2,5 ng / ml rekombinant humant IL-2) til hver brønn av en 96-brønns rundbunnet cellekulturplate. Hold på is.

4. Isolering av tetramerfritt merket T-celler av encellede flowcytometrisystemer Sorting

  1. Etablere flowcytometri gating parametere for å identifisere alloantigen-pMHC Tetramer merket T-celler (figur 2.a). Bruk pre-berikelse tetramer merket brøkdel å etablere gating strategier for å eliminere dubletter, gate på lymfocytter, utelukker CD19 uttrykker B-celler og CD14uttrykkende monocytter, og identifisere T-celler ved ekspresjon CD5. Bruk prøven ikke er merket med en fluorescens-tetramer som minus en kontroll for å etablere gating for identifikasjon av tetramer-bindende T-celler (med 0% av CD5 CD14 + - CD19 - celler fra prøven ikke er merket ved tetramer skal falle innenfor denne gate) .
    MERK: Avblending strategier som ikke er tilstrekkelig strenge vil resultere i isolering av ikke-T-celler eller T-celler som ikke er antigenspesifikk, mens altfor restriktive port strategier vil redusere antallet T-celler isolert.
  2. Programmere plate parametere for enkelt celle slag. Rett sorter å plassere en CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + celle i hver brønn. Rett plate satt opp til å inneholde en negativ kontroll godt (ingen celler sortert i brønnen) og en positiv kontroll brønn (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - celler) i hver rad (figur 2.B
  3. Ved hjelp av den etablerte strømningscytometri portstyringsstrategi og plateoppsett, isolere individuelle tetramer-bindende T-celler direkte inn i 96-brønns plate ved anvendelse av en strømningscytometrisk cellesorterer.

5. Kultur og Utvidelse av alloantigen-spesifikke T-celle Clones

  1. Etter fullførelse av cellesortering, sentrifuger plate ved 600 xg i 5 minutter ved 20 ° C. Sted kulturplate ved 37 ° C i en 6% CO2-inkubator.
  2. Vortex stimulerende anti-CD3 / anti-CD28 microbeads for 30 sek å suspendere perler.
  3. Beregn volum av aktivator-perler som kreves for stimulering av T-celler som er samlet (0,5 mL av aktivator-mikroperler / brønn). Overfør beregnet volum av stimulatorer perler til en steril 5 ml rør. Tilsett 1 ml human T-cellekulturmedium og virvle.
  4. Plasser røret med mikro suspensjon i magnet. Kapselen bør være løst oppå røret. Inkuber i 2 min ved romtemperatur.
  5. Forsiktig fjernehetten fra røret. Holde røret og magnet sammen, dekanter innholdet i røret inn i en frisk 5 ml tube. Ikke trykk eller riste rørinnholdet.
  6. Fjerne røret fra magneten. Legg human T-cellekulturmedium (100 ul medium / 0,5 ul av mikroperler innledningsvis tilsatt).
  7. Alikvoter 100 ul av aktivator perlesuspensjon til hver brønn på 96-brønns plate. Inkuber kulturplate ved 37 ° C i en 6% CO2-inkubator.
  8. Overvåk cellevekst daglig ved mikroskopisk undersøkelse. Små klynger av prolifererende celler kan observeres mikroskopisk etter 5-7 dager med kultur (figur 3.A).
    MERK: Visualisering av T-cellekulturer på dette punktet kan være vanskelig, og fraværet av observercellegruppene på dette stadium ikke kan være en indikasjon på en voksende mangel på T-celler.
  9. På 14 dager etter celleisolasjon, fôr kulturer ved å forsiktig fjerne 100 mL av media ut av toppen av kultur og erstatte med 100 μ; L friske human T-cellekulturmedium. Fortsett å inkubere kulturen plate ved 37 ° C i en 6% CO2-inkubator.
  10. Overvåke cellevekst daglig av mikroskopisk undersøkelse og vurdering av fargen på kulturmediet. Store celleclustere bør være synlig mikroskopisk 2 - 3 dager etter medium endring. Makroskopisk, bør cellepelletene blir synlige i løpet av de 14 dager etter utskiftning av medium.
  11. På 28 dager etter celleisolasjon, identifisere voksende kloner ved mikroskopisk undersøkelse. Overfør 200 ul volum av vekstpositive 96-brønns platekulturer til individuelle brønner i en 48-brønners vevkulturplate inneholdende 200 ul human T-cellekulturmedium.
  12. Tilsett 100 ul inneholdende 12,5 pl av stimulatoriske anti-CD3 / anti-CD28-mikroperler (fremstilt som beskrevet i avsnitt 5.2 til 5.6). Inkuber kulturplate ved 37 ° C i en 6% CO2-inkubator.
  13. Overvåk kultur vekst daglig av mikroskopisk examinering og evaluering av fargen på kulturmediet. Når T-celle-kulturen når 2x10> 6 / ml (vanligvis 3-5 dager etter re-stimulering, kan anslås ved den dag da mediet begynner å dreie strå-gul), overføre kulturen til en brønn av en 24-brønns vevskulturplate og tilsett 500 ul human T-cellemedium.
  14. På 10-14 dager følger re-stimulering, samle 200 ul T cellekultur for å vurdere alloantigen spesifisitet av flowcytometri analyse av pMHC tetramer binding (ved hjelp av merking og gating strategi er beskrevet i kapittel 3 og 4.1).

6. Langsiktig Re-stimulering og kultur av T-celle kloner

  1. Kontinuerlig re-stimulere og utvide klonale T cellekulturer med ønsket spesifisitet kan være hver 14. dag. Samle T-cellekulturer i en steril 5 ml rør på dag 14 etter den siste anti-CD3 / CD28 stimulering mikroperle. Kombiner flere brønner i det samme T-celle-klon i en enkelt tube, opp til et volum på 2,5 ml. Legg medium for å bringe det endelige volum til 2,5 ml, og bland forsiktig ved pipettering.
  2. Plasser 5 ml rør inneholdende T-cellekultur i celleseparasjons magnet for å fjerne gamle mikroperler fra kulturen. Kapselen bør være løst oppå røret. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
  3. Fjerne hetten fra røret forsiktig. Å holde røret og magneten sammen, dekanter cellesuspensjonen inn i et frisk 5 ml rør. Ikke trykk eller riste rørinnholdet å fjerne de siste dråper av væske.
  4. Legg medium for å bringe det endelige volum til 4 ml. Prøve 10 mL å telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
  5. Gjenoppretter T-celler ved sentrifugering ved 600 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
  6. Dekanter supernatanten. Resuspender T-celler ved 10 6 celler / ml human T-cellekulturmedium. Overføring 1 ml alikvoter til hver brønn av en 24-brønns vevskulturplate.
  7. Re-stimulere T-celler ved tilsetning av 100 ul medium inneholdende 12,5 pl av stimulerende anti-CD3 / aNTI-CD28 microbeads (som beskrevet i kapittel 5.2 til 5.6). Inkuber ved 37 ° C i en 6% CO2-inkubator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver generering av klonal humane T-cellekulturer med definert spesifisitet alloantigen via en magnetisk anrikning vulst og encellede strømningscytometri sortering strategi. Figur 1 gir en oversikt over prosessen.

Figur 1
Figur 1: Oversikt Protokoll Protokollen er beskrevet her gir en pålitelig metode for generering av alloantigen spesifikke human T-celle kloner fra perifert blod.. Prosessen med enkelt T-celle isolasjon og sette opp cellekultur er ventet å ta ca 4,5 time. Ekspansjon av T-cellekloner krever flere runder av ikke-spesifikk T-cellestimulering og kulturen, noe som tok 14 dager. Klonale kulturer kan testes for alloantigen spesifisitet 28 dager etter isolasjon og kulturer kan bli ytterligere utvidet for ytterligere testing ved gjentatte rounds av stimulering.

Den forventede utbyttet av alloantigen-spesifikke T-celler, vil være avhengig av donoren, den alloantigen som brukes, og det tilsvarende frekvens av reaktive T-celler i donoren. En gjennomsnittlig frisk donor vil ha 4,5 til 10,0 x 10 6 leukocytter / ml blod, med ca. 20% T-lymfocytter Figur 2 illustrerer resultatene av måling av binding av T-celler fra et HLA-DR4 (HLA-DRB1 * 04: 01. ) -negative donor til et bestemt alloantigen, aminosyreresiduer 30-48 av HLA-A2 protein (DTQFVRFDSDAASQRMEPR, A2 30-48) presentert av klasse II molekylet HLA-DR4 13.

Figur 2
Figur 2: Flow-cytometri sortering av alloantigen tetramer-merkede celler for generering av enkeltcellekulturer. A. Strømningscytometrisk identifisering og isolering av A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer-merkede T-celler fra et HLA-DR4-negativ donor. T-celler beriket for tetramerfritt merket celler ved magnetiske kuler utvalget ble sortert ved flowcytometri, gating på sing CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + lymfocytter som illustrert. Tetramer-umerkede celler ble anvendt som en fluorescens-minus en kontroll for å etablere gating for tetramer + celler. B. Tetramer + T-celler ble sortert i en 96-brønns rundbunnet vevskulturplate inneholdende 100 ul human T-cellekulturmedium. Platen set-up inkludert positive og negative kontrollbrønner som angitt.

Fra et utgangstall på 2,0 x 10 7 leukocytter har vi funnet en frekvens på alloantigen-spesifikke celler av T-celler 1/4776:

1.1x10 6 tetramerfritt beriket celler x 0,992 (Sing) x 0,744 (lymfocytter) x 0,477 (CD5 + CD14 - CD19 -) x 0,0034 (Tetramer + T-celler) / 2,0 x10 7 perifert blod leukocytter x 0,314 (pre-berikelse CD3 +)

Fra start 2.0x10 7 leukocytter var vi i stand til å isolere 88 individuelle tetramerfritt merket T-celler for kultur. Etter to runder med anti-CD3 / CD28 mikro stimulering og kultur som beskrevet identifiserte vi to vekst-positive kulturer ved mikroskopisk undersøkelse (representativt eksempel på veksten 10 dager etter en enkelt celle isolasjon og kultur vist i Figur 3.a). Klonale kulturer ble ekspandert til 1 ml, som beskrevet, og alloantigen spesifisitet ble bedømt ved å undersøke binding av A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer (figur 3.B).

Figur 3
Figur 3. Evaluering av T-cellekulturer. A. Mikroskopisk undersøkelse av 96-brønns plate T-cellekulturer. Representative eksempel på T-cellekultur 10dager etter isolering av de enkelte T-celler ved flow cytometri sortering. Celler ble stimulert med 0,5 mL anti-CD3 / CD28-mikroperler / brønn (eksempler angitt ved pilspiss) i et volum på 200 ul human T-cellekulturmedium. B. T-celle-alloantigen klonale spesifisitet for T-cellekulturer evaluert ved flow cytometri analyse av pMHC tetramer merking. Klonale T cellekulturer fra flowcytometri isolert CD5 + CD14 - CD19 - A2 30-48 / HLA-DR4 Tetramer + lymfocytter ble undersøkt for A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer bindende etter 4 uker med in vitro kultur. Tetramer-umerkede celler ble anvendt som en fluorescens-minus en kontroll for å etablere gating for tetramer + celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm Becton, Dickenson and Company 366480
Lymphoprep Stemcell Technologies 7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit Stemcell Technologies 15061
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg Corning 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
EDTA Sigma-Aldrich E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer NIH Tetramer Facility NA
EasySep Biotin Selection Kit Stemcell Technologies 18553
EasySep Selection magnet Stemcell Technologies 18000
TruStain FcX Human Fc blocking solution Biolegend 422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) Biolegend 300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14) Biolegend 325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19) Biolegend 302205
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine Corning 15-016-CV
HEPES Corning 25-060-CI
b-Mercaptoethanol  Life Technologies 21985-023
Glutamax Life Technologies 35050061
Gentamicin sulfate (50 mg/ml) Omega Scientific GT-50
Human AB serum, male donor Omega Scientific HS-30
Recombinant human IL-2 Peprotech AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Life Technologies 11131D
Media
Cell sorting buffer
PBS, pH 7.4 1 L
BSA 10 g
EDTA (0.5 M) 2 ml
Human T Cell Culture Medium
Iscove's DMEM 351.6 ml
Heat-inactivated human AB serum 40 ml
HEPES (1 M) 4 ml
Glutamax (100x) 4 ml
Gentamicin (50 mg/ml) 0.4 ml
b-mercaptoethanol (14.3 M) 1.4 ml
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) 1 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
  2. Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
  3. Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
  4. Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
  5. Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
  6. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  7. Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
  8. Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
  9. Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
  10. Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
  11. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  12. Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  13. Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
  14. Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
  15. Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
  16. Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
  17. Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).

Tags

Immunology T-celle immunologi human cellekultur transplantasjon strømningscytometri alloreactivity
Generation of Human alloantigen spesifikke T-celler fra perifert blod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jama, B. P., Morris, G. P.… More

Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (93), e52257, doi:10.3791/52257 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter