Generation of Human alloantigen spesifikke T-celler fra perifert blod
Summary
This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.
Abstract
The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.
Introduction
T-lymfocytter er kritiske komponenter av det adaptive immunsystemet. T-celler er ansvarlige for ikke bare direkte å formidle beskyttende immunresponser mot patogener gjennom en rekke av effektor mekanismer, men også aktivt å opprettholde immunologisk toleranse og selvkobler responsene til andre celler i immunsystemet. Disse funksjonene er rettet gjennom en rekke integrerte signaler, deriblant T-cellereseptoren (TCR) ligering, cytokiner og kjemokiner, og metabolitter 1. Av disse signaler, er av spesiell betydning TCR, da det gir den karakteristiske spesifisitet som definerer den T-celle rolle i adaptiv immunitet. En TCR samvirker med lineære peptid-antigener presentert av MHC (HLA human ortolog) molekyler (pMHC komplekser) i en svært spesifikk og sensitiv måte for å tilveiebringe signaler som initierer T-celle-effektor-funksjon. De biokjemiske parametre for TCR interaksjoner med pMHC ligander gir ikke bare spesifisiteten for Tcelleaktivering, men har også en kvalitativ virkning på etterfølgende T-cellefunksjon 2. Dermed studere T-celle funksjonen krever ofte undersøke svarene av klonale T-celler med definert antigen spesifisitet.
Den humane T-celledelen, som inneholder ca 10 12 αβ T-celler, inneholder anslagsvis 10 juli til 10 august distinkte αβTCRs 3-4. Denne mangfoldige repertoar gir mulighet for anerkjennelse av det store utvalget av peptider fra potensielle patogener som vil nødvendiggjøre en T-celle respons for beskyttende immunitet. Det er anslått at frekvensen av T-celler som reagerer på et gitt fremmed antigen presentert ved selv-MHC er av størrelsesorden 10 -4 til 10 -7 i fravær av forutgående immunrespons mot det antigenet 5. Den naive T-cellerepertoaret er formet av tymisk valg for å sikre evnen til å gjenkjenne selv-MHC antigener og presentere peptid grense reagereivity mot selv peptid antigener, maksimere potensialet verktøy for formidling av beskyttende immunitet to. Men i strid med denne designet reaktivitet, en relativt stor frekvens, 10 -3 til 10 -4, T-celler fra immunologisk naive individer svare på stimulering med allogene celler, erkjenner både de utenlandske MHC molekyler samt endogene peptider de presenterer 6. Erkjennelsen av allogene pMHC ligander er strukturelt lik anerkjennelse av fremmede antigener presentert av selv MHC; TCR gjør kritiske biokjemiske interaksjoner med både allogene MHC-molekylet, så vel som den presenterte peptid 7. Den robuste naturen til responsen av T-celler til allogene stimulering resulterer fra mangfoldet av pMHC komplekser tilstede på overflaten av allogene celler 8. Det er anslått at hvert MHC presenterer omtrent 2 x 10 4 forskjellige endogene peptidantigener 9. Dette breadth av respons på allogene stimulering er et vesentlig aspekt ved den klinisk relevant patologi, slik som allograft-avvisning, eller transplantat-mot-vert sykdom (GVHD), som resulterer fra T-celle alloreactivity.
Utredning av humane T-celle alloreaktive responser har tradisjonelt støttet seg ved å undersøke polyklonale svarene av naive T-celler etter stimulering med allogene celler. Gjentatt stimulering med den samme allogen cellelinje kombinert med begrensende fortynning analyser er i stand til å generere klonale T-celler med definerte anerkjennelse av allogene HLA 10. Dette er imidlertid problematisk metode for undersøkelse av individuelle responser på allogene pMHC ligander, som stort og variert repertoar av endogen pMHC komplekser tilstede for en gitt allogen stimulerer HLA en bred repertoar av T-celler. Denne hovedpopulasjon stimulering og begrensende fortynning tilnærming ville kreve screening av et stort antall kloner for å isolere T-celler med den ønskede Reactiteten mot et enkelt pMHC ligand. I tillegg, er frekvensen av T-celler som responderte til en individuell allogen pMHC ligand relativt lav blant naive T-cellepopulasjoner, som presenterer en barriere for effektiv generering av humane T-cellekloner som reagerer på et gitt antigen.
Identifisering og isolering av antigen-spesifikke T-celler fra polyklonale bestander har blitt aktivert av utviklingen av fluoroforpar-merket pMHC multimerene 11. Denne tilnærmingen benytter spesielle peptidantigener som er lastet inn i rekombinante oppløselige biotinylerte MHC-molekyler som er markert ved binding til en streptavidin-merket fluoroforen. Multimerization av pMHC øker grådighet, og kompenserer for den egen lav (mikrometer) affinitet TCR for løselige pMHC ligander. Merkede celler kan bli identifisert og isolert ved strømningscytometri. Imidlertid er denne metode fremdeles begrenset av den lave frekvensen av antigenspesifikke T-celler hos naive T-cellepopulasjoner, som typiskstørrelsesordener mindre enn grensen på nøyaktig identifikasjon og kvantifisering på de fleste flowcytometere. For å møte denne begrensningen, har en metode for pMHC tetramer merking og påfølgende magnetiske kuler berikelse for tetramerfritt merket celler er utviklet 12. Denne metoden har vist pålitelig deteksjon, telling, og isolering av lavfrekvente antigen-spesifikke T-celler.
Denne protokollen beskriver en effektiv protokoll for generering av humane T-celle-kloner som spesifikt responderer til individuelle allogene pMHC ligander. Protokollen gjelder pMHC (HLA) multimer merking og anrikning for isolering av alloantigen-spesifikke humane T-celler med flowcytometri cellesortering og en robust fremgangsmåte for in vitro-kultur av humane T-celler for å muliggjøre produksjon av T-cellekloner fra enkelt sorterte cellene ( oversikt i figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100 x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
References
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
