Summary
עם מחקר זה, אנו מציגים מודל מתח סטנדרטי לרשתית שור superfused המבודדת לבדיקה טיפולית פרה-קלינית בעתיד. ההשפעה או היפוקסיה (N הטהור 2) או מתח גלוטמט (250 גלוטמט מיקרומטר) על תפקוד רשתית מיוצג על ידי a- ואמפליטודות ב-גל הוערכה.
Abstract
Neuroprotection היה שדה חזק של חקירה במחקר רפואת עיניים בעשורים האחרונים ומשפיע מחלות כגון גלאוקומה, חסימת כלי דם ברשתית, היפרדות רשתית, ורטינופתיה סוכרתית. זה היה מושא מחקר זו כדי להציג מודל מתח סטנדרטי לבדיקה טיפולית פרה-קלינית בעתיד.
רשתיות שור הוכנו וperfused עם פתרון סטנדרטי חמצן רווי, וERG נרשם. לאחר ההקלטה ב-גלים יציבים, היפוקסיה (N הטהור 2) או מתח גלוטמט (250 מיקרומטר גלוטמט) שהופעל במשך 45 דקות. כדי לחקור את ההשפעות על תפקוד קולטי אור לבד, 1 aspartate מ"מ נוסף לקבלת-גלים. ERG-התאוששות הייתה פיקוח על 75 דקות.
להיפוקסיה, ירידה בגל משרעת של 87.0% נרשמה (p <0.01) לאחר זמן אקספוזיציה של 45 דקות (ירידה בשיעור של 36.5% לאחר תום p כישלון = 0.03). בנוסף, decr ראשונילהקל באמפליטודות ב-גל של 87.23% נרשמו, שהגיעה למובהקות סטטיסטיות (p <0.01, ירידה בשיעור של 25.5% בסוף השטיפה, p = 0.03).
עבור 250 מיקרומטר גלוטמט, ירידה של 7.8% ראשוני של אמפליטודות-גל (p> 0.05) ואחריו ירידה של 1.9% (p> 0.05). ירידה של 83.7% מאמפליטודות ב-גל (p <0.01) צוין; לאחר כישלון של 75 דקות הירידה הייתה 2.3% (p = 0.62). במחקר זה, מודל מתח סטנדרטי מוצג שעשוי להיות שימושי כדי לזהות השפעות נוירו אפשריות בעתיד.
Introduction
Neuroprotection היה שדה חזק של חקירה במחקר רפואת עיניים בעשורים האחרונים. הרשתית היא רשת עצבית רגישה מאוד שתלוי באופן משמעותי בחמצון ומושפע במידה רבה על ידי חילוף החומרים של תאים המקיפים אותה. פתולוגיות עיניות עיקריות הקשורות לנזק לתאי עצב הן חסימות כלי דם ברשתית, גלאוקומה, והיפרדות רשתית.
חסימת עורק רשתית, כדוגמא לחסימה של כלי דם ברשתית, מובילה לאובדן פתאומי של ראייה בשל חוסר חמצן של הרשתית הפנימית 1. היא קשורה לעתים קרובות עם פתולוגיות כלליות של כלי דם 2 ומובילים לאובדן ראייה מתמשך 1, עם רק 8% מהחולים מתאוששים חדות ראייה באופן משמעותי 1. למרות הפירוק פיברין עורקים הוצע כאפשרות טיפול, התועלת לא ניתן לראות בניסוי קליני אקראי 3.
גלאוקומה והיפרדות רשתיתלשניהם יש עלייה בריכוז הגלוטמט 4-6. גלוטמט בתנאים פיסיולוגיים הוא נתקל כמשדר מעורר בכל מערכת העצבים המרכזית וכל 7,8 הרשתית הפנימית. רמות גבוהות גלוטמט נמצאו לא רק בגלאוקומה והיפרדות רשתית 5,6 אלא גם ברטינופתיה סוכרתית שגשוג 9. עלייה בגלוטמט אולי מובילה להפעלת יתר רעילה, ולכן, תאי עצב נזק 10. ברוב המקרים של היפרדות רשתית ובמקרים מסוימים של ניתוח שגשוג רטינופתיה סוכרתי ברשתית (vitrectomy Plana pars) הם הכרחיים. במהלך המניפולציה מכאנית vitrectomy Plana סעיפים, אור הבהיר של הסיבים האופטיים או מאמץ גזירה המופעל על ידי ספיקות גבוהות של פתרונות השקיה במהלך פעילות ארוכה להפעיל לחץ נוסף על 11,12 הרשתית.
כל המחלות שהוזכרו במשותף שפתולוגיה היא מקומית לרטיןלבד ומהווים קהילת ophthalmologic עם האתגר למצוא דרכים להגן על הרשתית כמערכת נוירו.
Electroretinogram (ERG) הוא השיטה סטנדרטית להערכת in vivo פונקצית קולטי אור (גל) והפונקציה של הרשתית הפנימית (ב-גל). ERG נמדד בכסף-אלקטרודות הציגו לתוך הקרנית והעיניים נמצאות מגורה על ידי רמה הולך וגדל של אור כדי לזהות פגמים במוטות או קונוסים או ברשתית הפנימית. פגמים שונים ברשתית יכולים להיות מזוהים על ידי שינויים במשרעת (עוצמת התגובה) או חביון (תגובה-מרווח זמן ל) של ERG. שיטות פרוטוקול ומדידת ERG שונות (דפוס-ERG, multifocal-ERG או שדה בהיר ERG) מאפשרים בידול נוסף של פגמים. הטכניקה של הרשתית המבודדת כבר הציגה לאחרונה, כך שניתן לבדוק את ההשפעות על הרשתית ללא הפרעות מלמשל בעלי חיים מחקר שלתגובות כלליות 13,14.
זה היה מטרת מחקר זה להעריך ולהציג את מודל מתח מוגדר ואחיד להיפוקסיה ומתח גלוטמט על הרשתית המבודדת superfused. לפיכך, אנו מקווים להניח את היסודות למחקרים עתידיים על השפעות נוירו של סוכנים מסוימים או פתרונות השקיה התוך עיני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת עיני שור
- השג עיני שור ישירות לאחר החיה שנשחטה.
- להעביר את העיניים מוגנות ב" Sickel-פתרון "בינוני מיוחד המכיל 120 mM NaCl, KCl 2 מ"מ, 0.1 מ"מ MgCl 2, 0.15 מ"מ CaCl 2, 1.5 מ"מ לאא 2 גלוקוז מ"מ 4 PO, 13.5 מ"מ Na 2 HPO 4 ו -5 ב RT.
- לבצע את ההכנה של הרשתית בתנאים מותאמים כהים עם אור אדום עמום.
- הסר את החלק הקדמי של העין. בצע בערך חתך משווני אחורי 4 מ"מ לימבוס. לאחר מכן להסיר את הקרנית, קשתית, גוף הריסים ועדשה בחתיכה אחת. שמור את הרשתיות בSickel-פתרון.
- מכאני לשחרר קבצים מצורפים זגוגית אל פני השטח הרשתית והזגוגית להסיר מכוס עין הפתוחה.
- לאחר מכן מחלק את העין לארבעה רבעים ואגרוף החוצה עגול אזורים של CA. 7 מ"מ קוטר באמצעות מקדחה.
- בעדינות להפריד את הרשתיתמאפיתל הפיגמנט ולמקם אותו על מכשיר הקלטה בתוך קופסא המוגנת מפני אור. מכשיר ההקלטה מורכב ממתחזק פלסטיק עם רשת באמצע; למקם את הרשתית ברשת ולאחר מכן לתקן עם טבעת פלסטיק ישירות על האלקטרודות.
הערה: יש מתחזק הפלסטיק שני ערוצים כדי לאפשר זרימה מתמדת של המדיום.
2. הקלטה electroretinogram (ERG)
- על מנת לרשום electroretinogram, להשתמש בשתי אלקטרודות כסף / כסף-כלוריד בכל צד של הרשתית וינקב הרשתית במהירות זלוף קבועה של CA. 1 מיליליטר / דקה וטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס. השתמש ב" Sickel-הפתרון "רווי בחמצן.
- לפני שמתחיל את המדידה, כהה להתאים את הרשתית (להגן עליו מפני אור במהלך כל המדידות) ולהשתמש במרווחים של חמש דקות גירוי. השתמש בבזק 1 הרץ יחיד לבן קסנון לגירוי בעוצמה מוגדרת 6.3 MLX על פני השטח הרשתית. שימוש מכויל מסנני צפיפות ניטראליים וגירוי אור של 10 μsec נשלט על ידי שעון עצר כדי שתהיה לי תגובות אופטימליות.
- כדי למדוד ולעבד את הנתונים, לסנן ERG ומגביר אותו (מסנן high pass 100 הרץ, 50 מסנן חריץ הרץ, 100,000 x הגברה) באמצעות דשא RPS312RM מגבר. נסה לסנן תדרים מטרידים אפשריים שעלולים להפריע לאות. כדי לעבד את הנתונים, השתמש רכישת לוח אנלוגי לדיגיטלי נתונים במחשב שולחני (PC תואם).
- לאחר תקופת ההסתגלות הכהה מנות קבועות, למדוד את אמפליטודות של האות החשמלי עד אמפליטודות ב-גל יציב נרשמת.
הערה: אמפליטודות נחשבת יציבה אם חמש מדידות יחידים להגיע לערך ממוצע ולסטות פחות מ -10%. דוגמא טובה למדידות בודדות ניתנת באיור 1. - כדי להפעיל את הבדיקה, להחליף חמצן טהור או על ידי חנקן טהור (מספר הניסויים בודדים, n = 5) לבדיקת היפוקסיהאו גלוטמט מיקרומטר 250 (n = 5).
- רשום את התגובות חשמליות כל 5 דקות במשך 45 דקות.
- לאחר תקופת הבדיקה, תנקב את הרשתיות עם מדיום סטנדרטי רווי בחמצן במשך 75 דקות ומסתכלים על השינויים של משרעת ב-הגל. זהו שלב השטיפה. מדוד את משרעת ב-גל מהשפל של הגל לשיא של ב-הגל.
- כדי לחקור את ההשפעה של היפוקסיה או גלוטמט על פוטנציאל קולטי האור בתנאי scotopic, לדכא ב-הגל על ידי הוספת 1 מ"מ לפתרון התזונתי.
- לאחר הקלטת פוטנציאל קולטי אור יציב למשך 30 דקות, לבצע את ההליך כמו קודם, חושף את הרשתיות 45 דקות לפתרונות השקיה השונות עם 1 מ"מ aspartate. השתמש באותה תקופה מתנה (שלב 2.8) כאמור.
ניתוח 3. נתונים
- על מנת להעריך סטטיסטית את הנתונים, להבטיח התפלגות נורמלית לכל הנתונים, למשל באמצעות קולמוגורוב-סמירנובבדיקה 15.
- לחשב את הפחתת עוצמות a- וb-גל באחוזים לאחר שלב החשיפה בהשוואה למדידה האחרונה לפני התערוכה. השווה את ההפחתה של ERG-אמפליטודות לאחר 45 דק '- בסוף תקופת התערוכה - לERG נמדדה לפני היישום.
- השווה את גל a- וb- בסוף שלב השטיפה למשרעת המקבילה לפני התערוכה לבחון התאוששות אפשרית.
- לניתוח סטטיסטי, להשתמש בתוכנת תוכנת JMP הסטטיסטית או תוכנת SPSS. לחשב נתונים לאורך כממוצע ± סטיית תקן. להעריך את משמעות על-פי המבחן הסטטיסטי המתאים.
הערה: בדיקות אלה עשויות להיות שונות, בהתאם להיקף ניסיוני. בהגדרה זו, להשתמש במבחן t המזווג של הסטודנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אחרי שעה 1 של זלוף של הכנות רשתית עם פתרון רווי חמצן סטנדרטי (איור 1 א 'וב') ERG-אמפליטודות הראתה התייצבות ופחות וריאציה של אמפליטודות בין מדידות בודדות. pH, לחץ האוסמוטי, טמפרטורה, וPO 2 (פרט לבדיקות היפוקסיה) נשמרו קבועים לכל הבדיקות.
כדי לבודד את אות קולטי האור מהאות של הרשתית הפנימית, 1 מ"מ aspartate התווסף לפתרון הסטנדרטי לדכא ב-הגל (איור 1 א). במהלך הבדיקה של ההשפעה של היפוקסיה, ירידה בגל משרעת של 87.0% נרשמה (p <0.01) לאחר זמן אקספוזיציה של 45 דקות. בסופו של כישלון, ירידה בשיעור של 36.5% צוינה כי היה מובהק סטטיסטי (p = 0.03, איור 2 א). בנוסף, ירידה ראשונית באמפליטודות ב-גל של 87.23% נרשמה, שהמשמעות הגיעה באותה מידה סטטיסטית (p <0.01). בהגדרה זו ירידה של 25.5%צוין, כי היה מובהק סטטיסטי (p = 0.03, איור 2).
אחרי אקספוזיציה עם 250 מיקרומטר גלוטמט, 7.8% ירידה לא משמעותית של גל אמפליטודות התגלתה לאחר (p> 0.05) את מרווח הזמן המוגדר. זאת בעקבות ירידה לא משמעותית של 1.9% (p> 0.05, איור 3 א). מדידות יחידים מוצגות בטבלה 1 ו -2.
בנוגע לב-הגל, ירד אמפליטודות של ERG על ידי 83.7% נרשמו שהיו משמעותיים מבחינה סטטיסטית (p <0.01, איור 3). בסופו של כישלון, התאוששות ב-גל צוינה וכתוצאה מכך לירידה לא משמעותית של 2.3% לאחר 75 דקות של זלוף עם פתרון סטנדרטי (p = 0.62).
איור 1: דוגמא למדידת ERG מהמבודד רשתית שור perfused ()-הגל מוצג ב.ERG של הרשתית מבודדת שור perfused. ב-הגל מדוכא על ידי הוספת aspartate 1 מ"מ לפתרון התזונתי. (B) ב-הגל הוא דומיננטי בתנאי אור scotopic. גירוי 10 ms אור בעוצמת אור של 6.3 MLX משמש.
איור 2: השפעות של היפוקסיה לאחר זמן חשיפה של 45 דקות על ()-גל ועל משרעת (B) ב-הגל של ERG. ממוצע של סדרת סמים נציג (n = 5). הפס האופקי מעל העקומה מסמן את פעם היפוקסיה. הקו המקווקו () מסמן את היישום של aspartate 1 מ"מ לחשוף פוטנציאל קולטי אור. סטיות תקן לכל סדרה של ניסויים ניתנות ישירות לפני ואחרי היישום, כמו גם בסוף המשפט. ניתוח סטטיסטי בוצע בזמן-נקודות באמצעות סטיית התקן (ישירות לפני ואחרי Applicatיון, כמו גם בסוף המשפט): (א) ירידה בגל משרעת של 87.0% נרשם לאחר זמן אקספוזיציה של 45 דקות בהשוואה לתחילת המשפט. בסופו של המשפט, ירידה משמעותית של 36.5% נרשמה. ירידה משמעותית באמפליטודות ב-גל של 87.23% (B) נרשם בסוף זמן התערוכה. בסופו של המשפט, הפחתה משמעותית של 25.5% נרשמה.
איור 3:. אפקטים של גלוטמט 250 מיקרומטר מיושם במשך 45 דקות על () משרעת גל ומשרעת ב-הגל (B) של ERG של מבודד perfused שור רשתית הממוצע של סדרת סמים נציג (n = 5) . הפס האופקי מעל העקומה מסמן את היישום של גלוטמט. הקו המקווקו () מסמן את היישום של aspartate 1 מ"מ לחשוף פוטנציאל קולטי אור. Staסטיות ndard לכל סדרה של ניסויים ניתנות ישירות לפני ואחרי היישום, כמו גם בסוף המשפט. ניתוח סטטיסטי בוצע בזמן הנקודות עם סטיית התקן (ישירות לפני ואחרי היישום, כמו גם בסוף המשפט): (א) לאחר זמן החשיפה של 250 מיקרומטר גלוטמט הפחתה לא משמעותית של גל אמפליטודות (7.8%) זוהתה. בסופו של המשפט, הפחתה לא משמעותית של 1.9% נמצאה. (ב) בנושא ב-הגל, ירדה באופן משמעותי אמפליטודות של ERG על ידי 83.7% נרשמו. בסופו של המשפט, הפחתה לא משמעותית של 2.3% נרשמה.
| זמן [דקות] | משרעת ב-גל [μV] | SD | גל משרעת [μV] | SD |
| 0 | 9.2 | <align = td "right"> .836660027-10.4 | 1.140175425 | |
| 5 | 9.2 | 1.095445115 | -10 | 1 |
| 10 | 10 | 0 | -10.6 | .547722558 |
| 15 | 9.4 | 1.140175425 | -9.6 | .547722558 |
| 20 | 9.4 | .547722558 | -10 | 1 |
| 25 | 9.4 | .894427191 | -10.8 | .447213595 |
| 4.2 | 2.774887385 | -6.6 | 2.50998008 | |
| 35 | 4 | 2.449489743 | -5 | 2.236067977 |
| 40 | 3.8 | 1.788854382 | -5 | 1 |
| 45 | 3.6 | 1.341640786 | -5 | 2.121320344 |
| 50 | 2.4 | 1.140175425 | -4 | 1.870828693 |
| 55 | 2.2 | .836660027 | -3.4 1.140175425 | |
| 60 | 2.6 | .547722558 | -3.4 | 1.816590212 |
| 65 | 1.8 | .836660027 | -2.8 | 1.303840481 |
| 70 | 1.2 | .447213595 | -1.4 | .894427191 |
| 75 | 4.2 | .836660027 | -5.2 | 2.683281573 |
| 80 | 5.8 | 1.303840481 | -6 | 2.828427125 |
| 85 | 1.095445115 | -4.8 | .836660027 | |
| 90 | 6.8 | 1.095445115 | -6.2 | 2.387467277 |
| 95 | 7.4 | 1.816590212 | -5.6 | 2.302172887 |
| 100 | 6.4 | .547722558 | -6.2 | 2.863564213 |
| 105 | 6.6 | .894427191 | -7.2 | 2.049390153 |
| 110 | 6.2 | 1.643167673 | -6.4 | <align = td "right"> 2.966479395|
| 115 | 8.8 | 3.898717738 | -6 | 3.16227766 |
| 120 | 7.4 | 1.516575089 | -6 | 2.34520788 |
| 125 | 6.8 | 1.095445115 | -6 | 2.645751311 |
| 130 | 7 | 1 | -6.6 | 1.816590212 |
טבלת 1: קולמוגורוב-סמירנוב תוצאות.
| זמן [דקות] | משרעת ב-גל [μV] | SD | גל משרעת [μV] SD | |
| 0 | 9.25 | 0.5 | -10 | 1 |
| 5 | 10.5 | .577350269 | -10 | 1 |
| 10 | 10.25 | 0.5 | -10.4 | .894427191 |
| 15 | 10.5 | .577350269 | -9.6 | .894427191 |
| 20 | 10 | .816496581 | -9.6 | .547722558 |
| 25 | 10.75 | 0.5 | .836660027 | |
| 30 | 3 | 1.825741858 | -8.4 | 2.701851217 |
| 35 | 6 | 3.559026084 | -9 | 1 |
| 40 | 5.25 | 2.62995564 | -8.4 | 2.966479395 |
| 45 | 2.75 | 2.061552813 | -9 | 1.414213562 |
| 50 | 2.75 | .957427108 | -8 | .707106781 |
| 55 | 1 | -10.2 | 1.095445115 | |
| 60 | 2.25 | .957427108 | -8.4 | 1.816590212 |
| 65 | 2 | 1.414213562 | -8.6 | 1.140175425 |
| 70 | 1.75 | 0.5 | -9.4 | 2.701851217 |
| 75 | 8 | 3.464101615 | -9.2 | 2.28035085 |
| 80 | 9.5 | 3.696845502 | -9 | 1 |
| 85 | 8 | 2.160246899 | -10.8 | 2.48997992 |
| 90 | 8.25 | .957427108 | -9.2 | 2.167948339 |
| 95 | 9.25 | 2.872281323 | -10 | 1.870828693 |
| 100 | 9.75 | .957427108 | -9.6 | 1.140175425 |
| 105 | 13.5 | 3.872983346 | -9.2 | 1.643167673 |
| 110 | 11.75 | -9.6 | 1.140175425 | |
| 115 | 9 | 1.825741858 | -10 | 1.870828693 |
| 120 | 11 | 3.366501646 | -9.8 | 1.303840481 |
| 125 | 11 | 2.708012802 | -10.8 | .447213595 |
| 130 | 10.5 | .577350269 | -10 | 1 |
טבלה 2: מדידות נציג להיפוקסיה לאמפליטודות ב-גל וגל אמפליטודות.
| גלוטמט-גל נתונים | נתונים ב-גל גלוטמט | נתוני-גל היפוקסיה | נתונים ב-גל היפוקסיה | |
| D | .103827009 | 0.17415038 | 0.195 | 0.125 |
| p-value | .928603977 | .375501627 | 0.250 | .781 |
| אלפא | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
אמפליטודות מדידות נציג לגלוטמט מיקרומטר 250 לאמפליטודות ב-גל וגל: טבלה 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, יש השפעה משמעותית על משרעת ב-הגל לאחר 45 דקות של חוסר חמצן נמצאה. הפחתה זו עדיין הייתה משמעותית לאחר שלב השטיפה. השפעה דומה על פוטנציאל קולטי האור יכולה להיות שנצפתה.
התוצאות נתמכות על ידי נתונים אחרים שפורסמו 16 ולתת לנו את ההזדמנות ללמוד השפעות נוירו אפשריות לאחר היפוקסיה.
אחרי 45 דקות של אקספוזיציה 250 מיקרומטר גלוטמט, אנחנו לא מוצאים את ההשפעה מובהקת סטטיסטי רק במשרעת ב-הגל שהייתה הפיך במלואו בסוף תקופת המתנה. פוטנציאל קולטי האור לא הושפע 250 מיקרומטר גלוטמט. העובדה שהרשתית הפנימית רק הושפעה היפוקסיה מצביעה על כך שהשינויים הם עדינים מאוד ואנחנו ש, לכן, יש חיווי רגיש מאוד וסטנדרטי לneuroprotection האפשרי. Aspartate במיוחד מעכב העברת מקולטי האור לHorizontאל או תאים דו קוטביים וכך מדכא את b-הגל.
ממצא זה עומד בניגוד לממצאים של גרין DG וKapousta-Bruneau NV, שמצא כי בריכוזים של 250 ו- 500 מ"מ גלוטמט ההקלטה ב-גליהם היו יציבה יותר לאורך זמן בהשוואה לתקשורת לבד 17. כדי להסביר את הסתירה הזאת כמה הבדלים בהגדרות צריכים להילקח בחשבון: Sickel-פתרון היה בשימוש במודל זה פרסום האחר המשמש Ringer-פתרון.
מדידות בוצעו עם מערך הפרסום האחר עם אלקטרודה בודדת. עיני שור מבית המטבחיים שמשו בעת הפרסום האחר המתואר עיני עכברוש טריות. ההשפעה הייתה הפיכה עם עיכוב זמני בריכוזים גבוהים גלוטמט. הוא ידוע בכינוי שמאוד נמוכה כמות מסוימת של גלוטמט היא הכרחית לתחזוקה טובה של העין, וכי סכומים גבוהים יותר הם רעילים. אנו יכולים להניח כי בעיני השור מslaughterhouse יותר גלוטמט המתפרסם בהשוואה לעיניים מוכנות טרי וכתוצאה מכך רמות הגלוטמט להיות שונות מצפוי מגלוטמט הוסיף בניסוי.
מדידת התגובה באמצעות מערך על פני כל הרשתית ולא אלקטרודה, שבעיקר מושפעת מהתאים הקרובים ביותר, עשוי גם להוביל לזמן הישרדות ארוך יותר בשל נזק מכאני נמוך יותר. לבסוף, ההרכב של התקשורת הוא קריטי. ב -1960, פרופ 'Sickel השקיע רב בפיתוח תקשורת מיוחדת זה למדידות אלה, והוא היה מסוגל למצוא מדיה מותאמת ללא צורך גלוטמט לתגובת רשתית יציבה 13,14.
המודל המתואר מסתמך על רשתית מבודדת ולא כל בעלי חיים. במערכת in vivo, עין מבודדת על ידי הדם-הרשתית-המכשול מאיברים אחרים של בעלי החיים. היתרון של המודל הזה הוא שמפריע פרמטרים בבעלי חיים מחקר, כגון הרדמהאו עמדה של אלקטרודות לא מתרחשת, המאפשרת רמה גבוהה יותר של סטנדרטיזציה. תקינה היא נקודה קריטית בניסויים בבעלי חיים, בייחוד בכל קשור לעין 18.
המגבלות של שיטה זו הן תקופת מבחן הקצרה והעובדה, שזה לא מודל של בעלי חיים. אנו יודעים מניסיון שאמפליטודות ERG יישארו יציבה במשך כ -8 שעות, ולכן תקופת הבדיקה שצוינה במבוא ניתן להרחיב אקספוזיציה ארוכה יותר ותקופת מעקב, אבל תמיד צריך לשקול כי ניסוי בודד יותר מורחב, סביר יותר סטיות תקן גבוהות יותר יתרחשו.
חסרון של המודל הוא, אפוא, כי ניתן לבצע אין מחקרים ארוך טווח ורק כמות מוגבלת של מניפולציות לרשתית אפשרית. למניפולציה נרחבת וERGs מיוחד כמו ERG רב-מוקדי מונחה על ידי SLO כפי שמתואר בet al Dutescu. לדוגמא, בניסוי vivoים הוא הכרחי 19.
מודל זה יכול לשמש בקלות לרשתית אנושית explanted למשל מעיני enucleated. ומכיוון שחומר רגיש זה מסובך להשיג, ניסויים על רשתית שור הם ריאלי יותר אבל יש לפרש שמירה את זה בחשבון.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול מעבירים והכנת הרשתית בתנאים מותאמים כהים. זה חשוב כדי לקבל את התגובות אפשריות המקסימלי. לפעמים זה יכול לקחת כמה דקות כדי להפריד בעדינות את הרשתית מאפיתל הפיגמנט הבסיסי. טלטול עדין של רשתית האגרוף החוצה לעתים מקל על התהליך הזה. תוך שימת הרשתית ברשת, חשוב למקם את הרשתית עם הרשתית החיצונית ברשת. לאחר trephanization, הקצוות של הרשתית יהיו לכופף מעט כלפי מעלה מציינים את המיקום של שכבת הרשתית הפנימית.
רשתית השור היא יותר דומה לרשתית האנושית להשוותד לרשתית של העין המכרסמים בגלל יחס זגוגית-עדשה דומה ומבנה כלי דם דומה לאחד מהעין האנושית 20; כך, למרות שחיות מעבדה קטנות כמו חולדות או עכברים נמצאות בשימוש נרחב לבדיקת biocompatibility רשתית, בדיקות רעילות שבוצעו על בעלי חיים כאלה הן לעתים קרובות פחות רלוונטיות לבני אדם 20. ניתוח פילוגנטי של גן myocilin - גן שעברה המוטציה בצורתה גורמת גלאוקומה פתוחה זווית דומיננטית לנוער אוטוזומלית - מראה כי גן השור קשור באופן הדוק יותר לגן האנושי יותר מזה של החולדה או עכבר 21. ניתן למצוא Myocilin בתאי meshwork trabecular, כמו גם ברשתית. לבסוף הראינו מתאם טוב בין השור וERGs המבודד האנושי ואפקטי ERG 12.
במודל שלנו aspartate הועסק לחשוף קולטי האור P פוטנציאל III ידי ביטול ב-הגל. זה נותן לחוקר ההזדמנות לבדלבין השפעות על רשת הרשתית הפנימית ותפקוד קולטי האור 22. בעוד ב-הגל הוא פרמטר הרבה יותר רגיש בכל קשור לתפקוד המשולב, משרעת גל הוא יציב יותר ועמיד יותר ללחץ, בשל העובדה כי הגל משקף את התגובה של קולטני האור לאור היחיד זה. בניגוד לכך, ב-הגל תלוי באינטראקציה של תאי רשתית שונים ותא אל תא הפעילות של קולטני האור. באמצעות aspartate לבודד את גל זה ניתן לבחון את ההשפעה של מניפולציות על הקולטניים האור לבד 23.
במחקר זה מודל רעילות עצבי סטנדרטי שיכול לשמש לבדיקת סוכני neuroprotective הוערך. כהשקפה יהיה מעניין לתאם פונקצית אלקטרו עם ניתוח חלבון-ביוכימי או לתאם עם פונקצית חילוף חומרים תאיים או אפילו ביטוי mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germany | 1,064,041,000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germany | 1,050,010,250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germany | 58,330,250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germany | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germany | 1,065,860,500 | |
| 5 mM glucose | Merck Pharma, Germany | 40,741,000 |
References
- Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
- Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. Hypertension-related eye disorders). Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).
- Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
- Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
- Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
- Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
- Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
- Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
- Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
- Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
- Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
- Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
- Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
- Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
- Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
- Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
- Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
- Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).
