Summary
本研究では、我々は将来の前臨床治療試験のための孤立した灌流ウシ網膜のための標準化された応力モデルをご紹介。 A及びB波振幅によって表さ網膜機能上のいずれかの低酸素（純粋なN 2）またはグルタミン酸ストレス（250μMグルタミン酸）の効果を評価した。
Abstract
神経保護は、過去数十年で眼科研究の調査の強い分野きや、緑内障、網膜血管閉塞、網膜剥離、および糖尿病性網膜症などの疾患に影響を与えています。それは、将来の前臨床治療試験のための標準化された応力モデルを紹介する本研究の目的であった。
ウシ網膜を調製し、灌流酸素飽和標準溶液とし、ERGを記録した。安定したB波を記録した後、低酸素（純粋N 2）またはグルタミン酸応力（250μmのグルタミン酸）が45分間に発揮した。単独の光受容体機能に対する効果を調べるために、1mMのアスパラギン酸は、波を得た。 ERG-回復は75分間モニターした。
低酸素症の場合、87.0％の波振幅の減少は45分（ウォッシュアウトP = 0.03の終了後に36.5％の減少）の露出時間の後に（P <0.01）が認められた。さらに、初期のDECR87.23パーセントのb波振幅の容易さは、統計的有意に（p <0.01、ウォッシュアウトの終了時の25.5％の減少はp = 0.03）に達したことを記録した。
250μmのグルタミン酸、1.9％た（p> 0.05）の減少が続く波振幅た（p> 0.05）の最初の7.8％の減少である。 b波振幅た（p <0.01）の83.7％の減少が認められた。 75分のウォッシュアウト後に減少が2.3％（P = 0.62）であった。本研究では、標準化されたストレスモデルは、将来の可能性神経保護効果を同定するために有用であり得ることが示されている。
Introduction
神経保護は、過去数十年で眼科研究の調査の強い分野となっている。網膜は、酸素化に大きく依存し、その周囲の細胞の代謝によって強く影響され、高感度の神経回路網である。神経細胞の損傷に関連する主な眼の病状は、網膜血管閉塞、緑内障、および網膜剥離である。
網膜動脈閉塞は網膜血管閉塞のための例として、内側網膜1の低酸素状態に視力の突然の損失につながる。それは、多くの場合、一般的な血管の病理2に関連付けられており、患者のわずか8％を大幅に1視力を回復し、永続的な視覚喪失1につながる。動脈の線維素溶解が治療選択肢として提案されているが、利益は、無作為化臨床試験3に示すことができなかった。
緑内障と網膜剥離両方のグルタミン酸濃度4-6の増加を持っている。生理学的条件下でグルタミン酸は、全体の中枢神経系全体に興奮トランスミッタと内側の網膜7,8として検出された。上昇グルタミン酸レベルは、緑内障及び網膜剥離5,6においても、増殖性糖尿病性網膜9のみならず発見されている。グルタミン酸の増加は、おそらく、したがって、神経細胞の損傷10の興奮毒性につながり。網膜剥離の網膜（毛様体輪の硝子体切除）上の増殖性糖尿病網膜症の手術のいくつかのケースでは、ほとんどの場合必要です。扁平部の硝子体切除機械的操作時には、光ファイバーや長い操作中に灌漑ソリューションの高流量によって発揮されるせん断応力の明るい光が網膜11,12に追加のストレスを発揮する。
すべての疾患は、病理がレチンに局在している点で共通している単独および感覚神経系として網膜を保護する方法を見つけるという課題に眼科コミュニティをもたらす。
電図（ERG）は、インビボで光受容体機能（波）と内網膜（b波）の機能を評価するための標準的な方法である。 ERGは、角膜内に導入銀電極で測定され、眼は、ロッドまたは円錐または内側の網膜の欠陥を検出するための光のレベルの増加によって刺激されている。網膜における異なる欠陥は、振幅（応答の強さ）またはERGの待ち時間（時間 - 応答間隔）の変化によって検出することができる。異なるERGプロトコルと測定方法（パターン-ERG、多焦点-ERGまたは明視野ERG）は、欠陥のさらなる差別化を可能にする。単離された網膜の技術により、試験動物の例からの干渉なしで、網膜への影響を評価すること、最近導入された一般的な反応は13,14。
評価および灌流孤立網膜上の低酸素症およびグルタミン酸ストレスのために定義され、標準化された応力モデルを紹介するこの研究の目的だった。したがって、私たちは、特定の薬剤または眼内灌漑ソリューションの神経保護効果に関する今後の研究のための基礎を築くことを望んでいます。
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Protocol
ウシ目の調製
- 動物が屠殺された直後に牛の目を入手します。
- 120のNaCl、2のKCl、0.1のMgCl 2、0.15のCaCl 2、1.5 mMののNaH 2 PO 4、13.5のNa 2 HPO 4および5 mMグルコースでを含む特別な媒体」Sickel-ソリューション」で保護された目を輸送RT。
- 暗赤色灯と暗順応条件下での網膜の準備を行います。
- 眼の前の部分を削除します。赤道切開CAを実行します角膜輪部に4ミリメートルの後部。その後、1枚で角膜、虹彩、毛様体およびレンズを取り外します。 Sickel-溶液中の網膜にしてください。
- 機械的に網膜表面にガラス質の添付ファイルを緩め、オープンアイカップから硝子体を除去する。
- その後4つの象限に目を分割し、約ラウンド領域をパンチアウトトレフィンを使用して直径7mm。
- 静かに網膜を分離色素上皮から、光から保護ボックス内部の記録装置の上に置きます。記録装置は、中央にメッシュプラスチックメンテナで構成されています。メッシュ上に、網膜を配置し、電極上に直接プラスチックリングで固定します。
NOTE：プラスチックメンテ媒体の一定の流れを可能にするために二つのチャンネルを有している。
2.録音電図（ERG）
- 、電位図を記録する網膜の両側にある銀/塩化銀電極を使用し、約一定の灌流速度で網膜を灌流するために1ml /分、37℃の一定温度。酸素で飽和した「Sickel-ソリューション」を使用してください。
- 測定を開始する前に、暗い網膜を適応させる（すべての測定中に光から保護する）と、5分の刺激間隔を使用しています。網膜表面で6.3 MLXに設定された強度で刺激のための1 Hzの単一の白色キセノンフラッシュを使用してください。 使用は、最適な応答を得るために、減光フィルタ、タイマによって制御さ10マイクロ秒の光刺激をキャリブレート。
- グラスRPS312RMアンプを使用して（100Hzのハイパスフィルタ、50 Hzのノッチフィルタ100,000のx増幅）を測定し、処理したデータを、ERGをフィルタリングして増幅した。信号を乱す可能性のある妨害の周波数をフィルタリングしてみてください。データを処理するために、デスクトップコンピュータ（PC互換性のある）のアナログ·デジタルデータ収集ボードを使用する。
- 安定b波振幅が記録されるまで一定の灌流下暗順応期間の後、電気信号の振幅を測定する。
注：5つの測定値が平均値に達し、10％未満を逸脱した場合には、振幅が安定しているとみなされる。単一の測定値の良い例は、 図1に示されている。 - テストを開始するには、純粋な窒素で純酸素を交換する（単一の実験の数、n = 5）の低酸素状態をテストするまたは250μmのグルタミン酸（n = 5）であった。
- 電気的応答45分間5分毎に記録します。
- テスト期間の後、75分間酸素で飽和した標準培地で網膜を灌流し、b波振幅の変化を見てください。これはウォッシュアウトフェーズです。 b波のピークまでのA波の谷からb波の振幅を測定します。
- 暗順応条件下で、感光体電位に対する低酸素またはグルタミン酸の効果を調べるために、栄養液に1mMのを追加することによってb波を抑制する。
- 30分間の安定した感光体の電位を記録した後、1mMのアスパラギン異なる洗浄溶液に網膜45分間さらす前と同様の手順を行う。前述のように同じ休薬期間（ステップ2.8）を使用します。
3.データ分析
- 統計的データを評価するために、 例えば、コルモゴロフ-スミルノフを使用して、すべてのデータのための正規分布を確実にするテスト15。
- 博覧会の前に最後の測定と比較して露光段階後の割合でA及びB波の振幅の減少を計算します。 45分後にERG-振幅の減少を比較する - 展示期間の終わり - ERGへの適用前に測定した。
- 可能な回復を調べるために博覧会前に、対応する振幅にウォッシュアウトフェーズの終了時にA-とB-波の比較。
- 統計分析のために、ソフトウェアJMP統計ソフトウェアまたはSPSSソフトウェアを使用しています。平均±標準偏差として全体のデータを計算します。適切な統計的検定によって有意性を推定します。
注：これらのテストは、実験的な範囲に応じて異なる場合があります。この設定では、スチューデントのt検定を使用しています。
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Representative Results
酸素飽和標準溶液（ 図1AおよびB）と網膜製剤の灌流の1時間後にERG-振幅が安定化し、単一の測定値との間の振幅のより少ない変動を示した。 pHは、浸透圧、温度、及び（低酸素症試験を除く）のpO 2は、すべてのテストのために一定に維持した。
内網膜の信号から光受容体の信号を分離するために、1mMのアスパラギン酸は、b波（ 図1A）を抑制するために、標準溶液に添加した。低酸素の効果の試験中に、87.0％の波振幅の減少は、45分の露出時間の後に（p <0.01）が認められた。ウォッシュアウトの終了時に、36.5％の減少た（p = 0.03、 図2A）は、統計的に有意であったが認められた。さらに、87.23パーセントのb波の振幅の初期低下が等しく、統計的有意に（p <0.01）に達したことを記録した。このでは25.5％の削減を設定するた（p = 0.03、 図2B）、統計的に有意であったことが、注目された。
250μmのグルタミン酸との博覧会の後、波の振幅の7.8％非大幅な削減が（P> 0.05）後に検出された定義された時間間隔。これは、1.9％の非有意な減少た（p> 0.05、 図3A）が続いた。単一の測定は、表1及び2に示されている。
83.7％を記録したことにより、b波に関しては、統計的に有意であったことERGの振幅を減少させた（p <0.01、 図3B）。ウォッシュアウトの終了時に、b波の回収は、標準液た（p = 0.62）を用いて灌流の75分後に2.3％の非有意な減少をもたらすが認められた。
図1：単離された灌流ウシ網膜からERG測定の例 （A）のa-波が示されている。単離された灌流ウシ網膜のERG。 b波は、栄養液に1mMのアスパラギン酸を添加することによって抑制される。（B）b波は、暗所視光条件下で支配的である。 6.3 MLXの光強度で10ミリ秒の光刺激を使用する。
図2（A）に45分の露光時間後に低酸素の影響波およびERGの（B）b波振幅に関する。代表的な薬物シリーズの平均値（n = 5）であった。曲線上に水平バーは、低酸素症タイムをマーク。点線（A）は、光受容体潜在的なマスクを解除するには、アスパラギン酸の1mMのアプリケーションをマーク。実験の各シリーズの標準偏差は、前と後の塗布、ならびに試験終了時に直接与えられる。統計分析は、標準偏差を用いての時点で実施した（直接に前と後にアプリケーションシート試験の終了時にイオンならびに）：87.0％の波の振幅（A）の減少は、試験の開始時に比べて45分の露出時間後に記録した。試験の終了時に、36.5％の有意な減少が認められた。（B）87.23パーセントのb波振幅の有意な減少は、露出時間の最後に記録した。試験の終了時に、25.5％の有意な減少が認められた。
図3（A）に45分間適用し、250μMグルタミン酸波振幅代表薬物一連の単離された灌流ウシ網膜平均のERGの（B）のb波の振幅の影響（n = 5）の。曲線上水平バーは、グルタミン酸のアプリケーションをマーク。点線（A）は、光受容体潜在的なマスクを解除するには、アスパラギン酸の1mMのアプリケーションをマーク。駅実験の各シリーズのndard偏差が前と後のアプリケーションだけでなく、体験の終了時に直接与えられている。波の非有意な減少が250μmグルタミン酸の暴露時間の後（A）：統計解析は、標準偏差（直接前後アプリケーション、ならびに試験終了時）での時点で行った振幅は（7.8％）が検出されました。試験の終わりに、1.9％の非有意な減少が認められた。（B）b波に関して記録された、著しく83.7％によってERGの振幅を減少させた。試験の終わりに、2.3％の非有意な減少が認められた。
| 時間[分] | b波振幅[μV] | SD | 波振幅[μV] | SD |
| 0 | 9.2 | <のTD ALIGN = "右"> 0.836660027-10.4 | 1.140175425 | |
| 5 | 9.2 | 1.095445115 | -10 | 1 |
| 10 | 10 | 0 | -10.6 | 0.547722558 |
| 15 | 9.4 | 1.140175425 | -9.6 | 0.547722558 |
| 20 | 9.4 | 0.547722558 | -10 | 1 |
| 25 | 9.4 | 0.894427191 | -10.8 | 0.447213595 |
| 4.2 | 2.774887385 | -6.6 | 2.50998008 | |
| 35 | 4 | 2.449489743 | -5 | 2.236067977 |
| 40 | 3.8 | 1.788854382 | -5 | 1 |
| 45 | 3.6 | 1.341640786 | -5 | 2.121320344 |
| 50 | 2.4 | 1.140175425 | -4 | 1.870828693 |
| 55 | 2.2 | 0.836660027 | -3.4 1.140175425 | |
| 60 | 2.6 | 0.547722558 | -3.4 | 1.816590212 |
| 65 | 1.8 | 0.836660027 | -2.8 | 1.303840481 |
| 70 | 1.2 | 0.447213595 | -1.4 | 0.894427191 |
| 75 | 4.2 | 0.836660027 | -5.2 | 2.683281573 |
| 80 | 5.8 | 1.303840481 | -6 | 2.828427125 |
| 85 | 1.095445115 | -4.8 | 0.836660027 | |
| 90 | 6.8 | 1.095445115 | -6.2 | 2.387467277 |
| 95 | 7.4 | 1.816590212 | -5.6 | 2.302172887 |
| 100 | 6.4 | 0.547722558 | -6.2 | 2.863564213 |
| 105 | 6.6 | 0.894427191 | -7.2 | 2.049390153 |
| 110 | 6.2 | 1.643167673 | -6.4 | <のTD ALIGN = "右"> 2.966479395|
| 115 | 8.8 | 3.898717738 | -6 | 3.16227766 |
| 120 | 7.4 | 1.516575089 | -6 | 2.34520788 |
| 125 | 6.8 | 1.095445115 | -6 | 2.645751311 |
| 130 | 7 | 1 | -6.6 | 1.816590212 |
表1：コルモゴロフ-スミルノフ結果。
| 時間[分] | b波振幅[μV] | SD | 波振幅[μV] SD | |
| 0 | 9.25 | 0.5 | -10 | 1 |
| 5 | 10.5 | 0.577350269 | -10 | 1 |
| 10 | 10.25 | 0.5 | -10.4 | 0.894427191 |
| 15 | 10.5 | 0.577350269 | -9.6 | 0.894427191 |
| 20 | 10 | 0.816496581 | -9.6 | 0.547722558 |
| 25 | 10.75 | 0.5 | 0.836660027 | |
| 30 | 3 | 1.825741858 | -8.4 | 2.701851217 |
| 35 | 6 | 3.559026084 | -9 | 1 |
| 40 | 5.25 | 2.62995564 | -8.4 | 2.966479395 |
| 45 | 2.75 | 2.061552813 | -9 | 1.414213562 |
| 50 | 2.75 | 0.957427108 | -8 | 0.707106781 |
| 55 | 1 | -10.2 | 1.095445115 | |
| 60 | 2.25 | 0.957427108 | -8.4 | 1.816590212 |
| 65 | 2 | 1.414213562 | -8.6 | 1.140175425 |
| 70 | 1.75 | 0.5 | -9.4 | 2.701851217 |
| 75 | 8 | 3.464101615 | -9.2 | 2.28035085 |
| 80 | 9.5 | 3.696845502 | -9 | 1 |
| 85 | 8 | 2.160246899 | -10.8 | 2.48997992 |
| 90 | 8.25 | 0.957427108 | -9.2 | 2.167948339 |
| 95 | 9.25 | 2.872281323 | -10 | 1.870828693 |
| 100 | 9.75 | 0.957427108 | -9.6 | 1.140175425 |
| 105 | 13.5 | 3.872983346 | -9.2 | 1.643167673 |
| 110 | 11.75 | -9.6 | 1.140175425 | |
| 115 | 9 | 1.825741858 | -10 | 1.870828693 |
| 120 | 11 | 3.366501646 | -9.8 | 1.303840481 |
| 125 | 11 | 2.708012802 | -10.8 | 0.447213595 |
| 130 | 10.5 | 0.577350269 | -10 | 1 |
表2：b波の振幅と波の振幅のために低酸素症のための代表的な測定。
| 波データをグルタミン酸 | グルタミン酸b波データ | 低酸素A波データ | 低酸素b波データ | |
| D | 0.103827009 | 0.17415038 | 0.195 | 0.125 |
| p値 | 0.928603977 | 0.375501627 | 0.250 | 0.781 |
| アルファ | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
表3：b波の振幅と波の振幅のための250μMのグルタミン酸のための代表的な測定。
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Discussion
本研究では、低酸素症の45分後にb波の振幅に有意な影響が見られた。この減少は、依然としてウォッシュアウト段階の後に有意であった。感光性に関する同様の効果が観察された。
結果は、他の公開されたデータ16でサポートされているし、私たちに低酸素症の後の可能な神経保護効果を研究する機会を与えている。
250μMのグルタミン酸の45分の博覧会の後、我々は唯一のウォッシュアウト期間の終了時に完全に可逆的であったb波の振幅に統計学的に有意な影響を見つけた。感光体電位は250μMグルタミン酸の影響を受けていなかった。唯一の内側の網膜は、低酸素症の影響を受けたという事実は変化が非常に微妙であり、私たちは、そのため、可能な神経保護のために非常に敏感で標準化された指標を持っていることをことを示しています。アスパラギン酸は、特に光受容体からホリゾントへの送信を禁止するしたがって、Alまたは双極細胞とは、b波を抑制します。
この知見は、250及び500 mMの濃度のグルタミン酸とそれらのb波の記録メディア17単独と比較して時間をかけてより安定であることを見出したグリーンDG及びKapousta-ブリュノーNVの知見に反している。この矛盾を説明するための設定でいくつかの違いが考慮される必要がある：Sickel溶液を、このモデルにおいてリンゲル液に使用される他の出版物を使用した。
測定は、単一の電極を持つ配列、他の出版物を用いて実施した。他の出版物は、新鮮なラットの眼を説明しながら、屠殺場から牛の目が使用された。効果が高いグルタミン酸濃度での時間的阻害が可逆的であった。これは、一般的に、グルタミン酸の特定の非常に低い量が眼の良いメンテナンスのために、より高い量が有毒であることが必要であることが知られている。我々はSLから牛の目にそれを前提としなかったaughterhouseよりグルタミン酸は、グルタミン酸レベルを実験的に追加されたグルタミン酸から予想されるより異なることになり、新たに調製し、目に比べてリリースされています。
全体網膜のではなく、主に最も近い細胞に影響される電極、上のアレイを使用して応答を測定し、また、より低い機械的損傷に起因する、より長い生存時間につながるかもしれない。最後に、培地の組成は非常に重要です。 1960年代には、教授Sickelは重く、これらの測定のために、この特殊なメディアの開発に投資して、彼は安定したレチナール応答13,14のためのグルタミン酸を必要とせずに最適化されたメディアを見つけることができた。
説明したモデルは、孤立した網膜全体ではなく動物に依存しています。 インビボ系において、眼球は、動物の他の器官から血液網膜関門によって単離される。このモデルの利点は、そのような麻酔のような実験動物におけるパラメータを、干渉または電極の位置は、標準化の高い程度を可能にする、発生しない。標準化は、特に、眼18について 、動物実験における臨界点である。
この方法の限界は、それが動物モデルではないことを、短い試験期間事実である。したがって、我々は、冒頭で述べたテスト期間が長く博覧会やフォローアップ期間に拡張することができERG振幅は、約8時間安定したままであることを経験から知っている、が、1つは、常により長い単一の実験が、延長されていることを考慮すべきである可能性が高い、より高い標準偏差が発生します。
モデルの欠点は、長期的な研究を行うことができず、網膜への操作量に制限が可能であること、したがって、である。広範な操作及びDutescu らに記載されるようにSLOによって導か多焦点ERGのような特別のERGのために。例えば、in vivoでの実験sが19必要です。
このモデルは、簡単に、除核された目から、例えば 、ヒト網膜外植のために使用することができる。この感光材料を得るために複雑であることから、ウシ網膜上の実験は、より実現可能であるが、このことを念頭に維持すると解釈されるべきである。
プロトコルの重要なステップは暗順応条件の下で網膜を輸送して準備をしている。これは、最大の可能な応答を得ることが重要である。それは時々静かに、基礎となる色素上皮から網膜を分離するために、いくつかの分を取ることができます。打ち抜いた網膜の穏やかに振盪は時々このプロセスを容易にします。ネット上で網膜を置くが、それは、ネット上の外側の網膜で、網膜を配置することが重要です。 trephanization後、網膜の縁が内網膜層の位置を示すわずかに上向きに曲がる。
ウシ網膜は、ヒトの網膜比較するのがより似ているなぜなら同じようなガラス質のレンズ比と人間の目20のいずれかのような血管構造の齧歯類目の網膜にD;例えば、ラットまたはマウスのような実験小動物が広く網膜生体適合性を試験するために使用されるが、従って、このような動物に対して行わ毒性試験は、多くの場合、ヒト20に対してより適用可能である。ミオシリン遺伝子の系統発生解析-ウシ遺伝子は、より密接にラットまたはマウス21よりもヒト遺伝子に関連していることを示している-その変異型で常染色体優性の若年性開放隅角緑内障の原因となる遺伝子ミオシリンは小柱網細胞においてだけでなく、網膜に記載されています。最後に、私たちは、ウシおよびヒト孤立ERGをとERG効果12との間に良好な相関を示した。
我々のモデルではアスパラギン酸は、b波を廃止することにより、感光体潜在的なP IIIのマスクを解除するために使用された。これは調査員を差別化する機会を与えてくれます内網膜ネットワークと光受容体の機能22への影響の間。 b波は、統合機能に関してはるかに敏感なパラメータであるが、波の振幅が原因のa-波光のみを光受容体の反応を反映しているという事実のために、より安定したストレスに対してより抵抗性であるそれ。対照的に、b波は、細胞間の異なる網膜細胞の相互作用と光受容体の活性に依存する。 A波は単独で感光体23上の操作の影響を調べることができるを単離するためにアスパラギン酸を使用することによって。
本研究では神経保護剤を試験するために用いることができる標準化された神経毒性モデルを評価した。見通しとして、それは、タンパク質の生化学的解析と電気生理学的機能を相関させるか、細胞代謝、あるいはmRNA発現と機能を関連付けるために興味深いものになる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germany | 1,064,041,000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germany | 1,050,010,250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germany | 58,330,250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germany | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germany | 1,065,860,500 | |
| 5 mM glucose | Merck Pharma, Germany | 40,741,000 |
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