Summary
Med denne studien, innfører vi en standardisert stresset modell for den isolerte superfuseres storfe netthinnen for fremtiden preklinisk terapeutisk testing. Effekten av enten hypoksi (rent N 2) eller glutamat stress (250 pM glutamat) på retinal funksjon representert ved a- og b-bølgeamplitudene ble evaluert.
Abstract
Neuroprotection har vært et sterkt felt av etterforskningen i ophthalmological forskning de siste tiårene, og påvirker sykdommer som grønn stær, retinal vaskulær okklusjon, netthinneavløsning, og diabetisk retinopati. Det var formålet med denne studien er å innføre en standardisert spenning modell for framtidig terapeutisk preklinisk testing.
Bovine netthinner ble fremstilt og perfundert med en oksygenmettet standardløsning, og ERG ble registrert. Etter innspillingen stabile b-bølger, hypoksi (ren N 2) eller glutamat stress (250 mikrometer glutamat) ble utøves i 45 min. Å undersøke effekter på fotoreseptoren funksjon alene, ble en mM aspartat tilsettes for å oppnå en-bølger. ERG-gjenvinning ble overvåket i 75 min.
For hypoksi, ble en reduksjon i a-bølgeamplituden på 87.0% bemerkes (p <0,01) etter en eksponeringstiden på 45 minutter (reduksjon på 36,5% etter slutten av utvaskings p = 0,03). I tillegg kan en innledende redusere påvirkerletthet i b-bølgeamplitudene av 87,23% ble registrert, som nådde statistisk signifikans (p <0,01, reduksjon på 25,5% ved utgangen av utvasking, p = 0,03).
For 250 um glutamat, en innledende 7,8% reduksjon av a-bølgeamplitudene (p> 0.05) etterfulgt av en reduksjon på 1,9% (p> 0,05). En reduksjon på 83,7% av b-bølgeamplitudene (p <0,01) ble observert; etter en utvasking av 75 min reduksjonen var 2,3% (p = 0,62). I denne studien, er et standardisert stresset modell presenteres som kan være nyttig for å identifisere mulige nervecellene effekter i fremtiden.
Introduction
Neuroprotection har vært et sterkt felt av etterforskningen i ophthalmological forskning de siste tiårene. Netthinnen er en svært følsom nevronale nettverk som avhenger i stor grad oksygenering og påvirkes sterkt av metabolismen av dens omkringliggende celler. Store okulær patologi knyttet til nervecelleskade er retinal vaskulær okklusjon, glaukom, og netthinneavløsning.
Retinal arterieokklusjon, som et eksempel for retinal vaskulær okklusjon, fører til et plutselig tap av syn på grunn av hypoksi av den indre retina 1. Det er ofte forbundet med generelle vaskulære sykdommer 2 og fører til en vedvarende synstap 1, med bare 8% av pasienter utvinne synsskarphet betydelig en. Selv arteriell fibrinolyse har blitt foreslått som et alternativ behandling, kan fordelen ikke bli vist i en randomisert klinisk studie tre.
Glaukom og netthinneavløsningbegge har en økning i glutamatkonsentrasjon 4-6. Glutamat henhold fysiologiske betingelser påtreffes som en eksitatorisk transmitter i hele sentralnervesystemet og det indre retina 7,8. Forhøyede glutamatnivået har blitt funnet ikke bare i grønn stær og netthinneavløsning 5,6, men også i proliferativ diabetisk retinopati 9. En økning av glutamat muligens fører til eksitotoksisitet og derfor nervecelleskade 10. I de fleste tilfeller av netthinneavløsning og i noen tilfeller av proliferativ diabetisk retinopati kirurgi på netthinnen (pars plana vitrektomi) er nødvendig. Under pars plana vitrektomi mekanisk manipulasjon, lyse lys av den optiske fiber eller skjærspenning utøves av høye strømningsrater vanningsløsninger under lange operasjoner utøve en ekstra stress på netthinnen 11,12.
Alle de nevnte sykdommer, har til felles at patologien er lokalisert til Retinen alene og utgjør den ophthalmologic samfunn med utfordringen å finne måter å beskytte netthinnen som en nevro system.
Elektroretinogrammet (ERG) er standardmetoden for evaluering av in vivo fotoreseptoren funksjon (a-bølge), og funksjonen av den indre retina (B-bølge). ERG måles ved sølv-elektroder som føres inn i hornhinnen, og øynene blir stimulert av en økende grad av lys for å detektere defekter i stenger eller kjegler, eller i det indre netthinnen. Forskjellige defekter i netthinnen kan påvises ved endringer i amplitude (styrken på responsen) eller latens (tiden til respons-intervall) av ERG. Ulike ERG protokollen og målemetoder (mønster-ERG, multifokal-ERG eller lyse felt ERG) tillate ytterligere differensiering av defekter. Teknikken med den isolerte hinnen er innført nylig, noe som gjør det mulig å evaluere effekter på netthinnen uten interferens fra f.eks en studie dyretsgenerelle reaksjoner 13,14.
Det var formålet med denne studie for å evaluere og innføre en definert og standardisert spenning modell for hypoksi og glutamat stress på superfuseres isolert hinnen. Dermed håper vi å legge grunnlaget for fremtidige studier av nervecellene effekter av enkelte agenter eller intraokulære vanningsløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av storfe Eyes
- Skaff storfe øyne rett etter at dyret er slaktet.
- Transportere de beskyttede øyne "Sickel-oppløsning" et spesielt medium inneholdende 120 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2, 1,5 mM NaH 2PO 4, 13,5 mM Na HPO 2 4 og 5 mM glukose RT.
- Utføre utarbeidelsen av netthinnen under mørke tilpasset forhold med en svakt rødt lys.
- Fjern den fremre del av øyet. Utfør en ekvatorial snitt ca. 4 mm posteriort for limbus. Deretter fjerne hornhinnen, iris, strålelegeme og objektiv i ett stykke. Hold netthinne i Sickel-løsning.
- Mekanisk løsne glasslegemet vedlegg til retinal overflaten og fjerne glasslegemet fra den åpne øyet cup.
- Etterpå dele øyet inn i fire kvadranter og punch ut runde områder av ca. 7 mm diameter ved hjelp av en trephine.
- Forsiktig skille retinafra pigmentet epitel og plassere den på en opptaksenhet inne i en boks beskyttet mot lys. Opptaksenheten består av en plastvedlikehold med en maske i midten; plassere hinnen på mesh og deretter løse med en plastring direkte på elektrodene.
MERK: Plastvedlikehold har to kanaler til å tillate en konstant strømning av mediet.
2. Opptak elektroretinogrammet (ERG)
- For å kunne ta opp elektroretinogrammet bruke to sølv / sølv-klorid-elektroder på hver sin side av netthinnen og perfuse netthinnen ved en konstant perfusjon hastighet av ca. 1 ml / min, og konstant temperatur på 37 ° C. Bruk "Sickel-løsning" mettet med oksygen.
- Før du starter målingen, mørk tilpasse netthinnen (beskytt det mot lys under alle målinger) og bruke stimulanse intervaller på fem min. Bruk en 1 Hz enkelt hvit xenon blits for stimulering med en intensitet satt til 6,3 MLX på retinal overflaten. Bruk kalibrert nøytrale tetthetsfilter og en lett stimulus på 10 usek styres av en timer for å få optimale responser.
- For å måle og behandle data, filtrere ERG og forsterke det (100 Hz høypassfilter, 50 Hz hakk filter, 100.000 x forsterkning) ved hjelp av en Grass RPS312RM Amplifier. Prøv å filtrere ut mulige forstyrrende frekvenser som kan forstyrre signalet. For å behandle data, bruk en analog-til-digital datainnsamling bord på en stasjonær datamaskin (PC-kompatibel).
- Etter den mørke prøveperioden under konstant perfusjon, måle amplitudene av det elektriske signalet til stabile b-bølgeamplitudene er registrert.
MERK: Amplituden anses stabile hvis fem enkeltmålinger oppnå en middelverdi, og avviker mindre enn 10%. Et godt eksempel på enkle målinger er gitt i figur 1. - For å starte testing, erstatte rent oksygen ved enten rent nitrogen (antall enkle forsøk, n = 5) for å teste for hypoksieller 250 um glutamat (n = 5).
- Registrere elektriske responser hver 5 min i 45 min.
- Etter testperioden, perfuse netthinne med standard medium mettet med oksygen i 75 minutter og se på endringer av b-bølgeamplituden. Dette er utvaskingsfasen. Mål b-bølgeamplituden fra trauet av en bølge til toppen av den b-bølge.
- For å undersøke virkningen av hypoksi eller glutamat på fotoreseptoren potensial henhold scotopic betingelser, undertrykke b-bølgen ved tilsetning av 1 mM til næringsoppløsningen.
- Etter innspilling av et stabilt fotoreseptor potensial for 30 min, gjennomføre prosedyren som før, utsette netthinne 45 min til de forskjellige vannings løsninger med 1 mM aspartat. Bruk samme utvaskingsperiode (trinn 2.8) som nevnt tidligere.
3. Data Analysis
- For å statistisk evaluere dataene og sikre en normalfordeling for alle data, for eksempel ved hjelp av Kolmogorov-Smirnovtest 15.
- Beregn reduksjon av A- og B-bølgeamplitudene i prosenter etter eksponering fase i forhold til den siste målingen før gjennomgangen. Sammenlign reduksjon av ERG-amplituder etter 45 min - ved slutten av gjennomgangen perioden - til ERG målt før påføring.
- Sammenlign a- og b- bølge ved slutten av utvaskingsfasen til den tilsvarende amplitude før eksponering for å undersøke en mulig utvinning.
- For statistisk analyse, bruke programvaren JMP statistisk programvare eller SPSS programvare. Beregn data hele som gjennomsnitt ± standardavvik. Anslå betydningen av den aktuelle statistisk test.
MERK: Disse testene kan være forskjellig avhengig av den eksperimentelle omfang. I denne innstillingen, kan du bruke Student paret t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter en time av perfusjon av netthinnens preparater med oksygenmettet standardløsning (figur 1A og B) ERG-amplituder viste stabilisering og mindre variasjon av amplituder mellom enkeltmålinger. pH, osmotisk trykk, temperatur og pO 2 (med unntak av hypoksi testing) ble holdt konstant i alle tester.
For å isolere den fotoreseptoren signal fra signalet fra den indre hinnen, ble 1 mM aspartat tilsatt til standardløsningen for å undertrykke b-bølgen (figur 1A). Under testing av virkningen av hypoksi, ble en reduksjon i a-bølgeamplituden på 87.0% bemerkes (p <0,01) etter en eksponeringstiden på 45 minutter. Ved slutten av utvasking, ble en reduksjon på 36,5% bemerket som var statistisk signifikant (p = 0,03, figur 2A). I tillegg ble en innledende reduksjon av b-bølgeamplitudene av 87,23% registreres, at like nådde statistisk signifikans (p <0,01). I denne innstillingen en reduksjon på 25,5%ble notert, som var statistisk signifikant (p = 0,03, figur 2B).
Etter utstilling med 250 mikrometer glutamat, en 7,8% ikke-signifikant reduksjon av a-bølge amplituder ble oppdaget etter (p> 0,05) det definerte tidsintervallet. Dette ble etterfulgt av en ikke-signifikant reduksjon på 1,9% (p> 0.05, figur 3A). Enkelt målinger er vist i tabell 1 og 2.
Når det gjelder B-bølge, reduserte amplituder av ERG av 83,7% ble registrert som var statistisk signifikant (p <0,01, figur 3B). Ved slutten av utvasking, ble en b-bølge utvinning bemerket noe som resulterer i en ikke-signifikant reduksjon på 2,3% etter 75 minutter av perfusjon med standard oppløsning (p = 0,62).
Figur 1: Eksempel på en ERG måling fra isolert perfusert bovin retina (A) a-bølgen er vist i.ERG av isolert perfusert bovin retina. B-bølgen undertrykkes ved tilsetning av 1 mM aspartat i næringsløsningen. (B) b-bølgen er dominerende i henhold scotopic lysforhold. En 10 ms lys stimulans med en lysintensitet på 6,3 MLX brukes.
Figur 2: Effekt av hypoksi etter en eksponeringstid på 45 min på (A) a-bølge og i (B) b-bølge amplituden av ERG. Gjennomsnitt av representative narkotika serien (n = 5). Den horisontale linjen over kurven markerer hypoksi tid. Den stiplede linjen (A) angir anvendelsen av aspartat 1 mM å avdekke fotoreseptoren potensial. Standardavvik for hver serie av forsøk er gitt umiddelbart før og etter påføring, så vel som ved slutten av forsøket. Statistisk analyse ble utført på tidspunkter som bruker standardavviket (rett før og etter application, så vel som ved slutten av forsøket): (A) En reduksjon i a-bølgeamplituden på 87.0% ble registrert etter en eksponeringstiden på 45 minutter i forhold til begynnelsen av forsøket. På slutten av rettssaken, ble en betydelig nedgang på 36,5% bemerket. (B) En betydelig reduksjon i b-bølgeamplitudene av 87,23% ble registrert i slutten av utstilling tid. På slutten av rettssaken, ble en betydelig reduksjon på 25,5% bemerket.
Fig. 3: Effekter av 250 pM glutamat påført i 45 minutter i (A) a-bølgeamplituden og (B) b-bølge amplituden av ERG av isolert perfusert bovin retina Gjennomsnitt av representative medikament serie (n = 5) . Den horisontale linjen over kurven markerer applikasjon av glutamat. Den stiplede linjen (A) angir anvendelsen av aspartat 1 mM å avdekke fotoreseptoren potensial. Standard avvik for hver serie av forsøk er gitt umiddelbart før og etter påføring, så vel som ved slutten av forsøket. Statistisk analyse ble utført på de tidspunkter med standardavvik (rett før og etter påføring, så vel som ved slutten av forsøket): (A) Etter at eksponeringstiden på 250 um glutamat en ikke-signifikant reduksjon av en bølge amplituder (7,8%) ble detektert. På slutten av rettssaken, ble en ikke-signifikant reduksjon på 1,9% funnet. (B) Når det gjelder b-bølge, betydelig redusert amplituder av ERG med 83,7% ble registrert. Ved slutten av forsøket, ble en ikke-signifikant reduksjon på 2,3% er angitt.
| [Min] | b-wave amplitude [uV] | SD | a-wave amplitude [uV] | SD |
| 0 | 9.2 | <td align = "right"> 0,836660027-10,4 | 1,140175425 | |
| 5 | 9.2 | 1,095445115 | -10 | 1 |
| 10 | 10 | 0 | -10,6 | 0,547722558 |
| 15 | 9.4 | 1,140175425 | -9,6 | 0,547722558 |
| 20 | 9.4 | 0,547722558 | -10 | 1 |
| 25 | 9.4 | 0,894427191 | -10,8 | 0,447213595 |
| 4.2 | 2,774887385 | -6,6 | 2.50998008 | |
| 35 | 4 | 2,449489743 | -5 | 2,236067977 |
| 40 | 3.8 | 1,788854382 | -5 | 1 |
| 45 | 3.6 | 1,341640786 | -5 | 2,121320344 |
| 50 | 2.4 | 1,140175425 | -4 | 1,870828693 |
| 55 | 2.2 | 0,836660027 | -3,4 1,140175425 | |
| 60 | 2.6 | 0,547722558 | -3,4 | 1,816590212 |
| 65 | 1.8 | 0,836660027 | -2,8 | 1,303840481 |
| 70 | 1.2 | 0,447213595 | -1,4 | 0,894427191 |
| 75 | 4.2 | 0,836660027 | -5,2 | 2,683281573 |
| 80 | 5.8 | 1,303840481 | -6 | 2,828427125 |
| 85 | 1,095445115 | -4,8 | 0,836660027 | |
| 90 | 6.8 | 1,095445115 | -6,2 | 2,387467277 |
| 95 | 7.4 | 1,816590212 | -5,6 | 2,302172887 |
| 100 | 6.4 | 0,547722558 | -6,2 | 2,863564213 |
| 105 | 6.6 | 0,894427191 | -7,2 | 2,049390153 |
| 110 | 6.2 | 1,643167673 | -6,4 | <td align = "right"> 2,966479395|
| 115 | 8.8 | 3,898717738 | -6 | 3.16227766 |
| 120 | 7.4 | 1,516575089 | -6 | 2.34520788 |
| 125 | 6.8 | 1,095445115 | -6 | 2,645751311 |
| 130 | 7 | 1 | -6,6 | 1,816590212 |
Tabell 1: Kolmogorov-Smirnov resultater.
| [Min] | b-wave amplitude [uV] | SD | a-wave amplitude [uV] SD | |
| 0 | 9.25 | 0.5 | -10 | 1 |
| 5 | 10.5 | 0,577350269 | -10 | 1 |
| 10 | 10.25 | 0.5 | -10,4 | 0,894427191 |
| 15 | 10.5 | 0,577350269 | -9,6 | 0,894427191 |
| 20 | 10 | 0,816496581 | -9,6 | 0,547722558 |
| 25 | 10.75 | 0.5 | 0,836660027 | |
| 30 | 3 | 1,825741858 | -8,4 | 2,701851217 |
| 35 | 6 | 3,559026084 | -9 | 1 |
| 40 | 5,25 | 2.62995564 | -8,4 | 2,966479395 |
| 45 | 2.75 | 2,061552813 | -9 | 1,414213562 |
| 50 | 2.75 | 0,957427108 | -8 | 0,707106781 |
| 55 | 1 | -10,2 | 1,095445115 | |
| 60 | 2.25 | 0,957427108 | -8,4 | 1,816590212 |
| 65 | 2 | 1,414213562 | -8,6 | 1,140175425 |
| 70 | 1,75 | 0.5 | -9,4 | 2,701851217 |
| 75 | 8 | 3,464101615 | -9,2 | 2.28035085 |
| 80 | 9.5 | 3,696845502 | -9 | 1 |
| 85 | 8 | 2,160246899 | -10,8 | 2.48997992 |
| 90 | 8,25 | 0,957427108 | -9,2 | 2,167948339 |
| 95 | 9.25 | 2,872281323 | -10 | 1,870828693 |
| 100 | 9,75 | 0,957427108 | -9,6 | 1,140175425 |
| 105 | 13.5 | 3,872983346 | -9,2 | 1,643167673 |
| 110 | 11.75 | -9,6 | 1,140175425 | |
| 115 | 9 | 1,825741858 | -10 | 1,870828693 |
| 120 | 11 | 3,366501646 | -9,8 | 1,303840481 |
| 125 | 11 | 2,708012802 | -10,8 | 0,447213595 |
| 130 | 10.5 | 0,577350269 | -10 | 1 |
Tabell 2: Representative målinger for hypoksi for b-bølgeamplitudene og en bølge amplituder.
| Glutamat a-bølge data | Glutamat b-bølge data | Hypoksi a-bølge data | Hypoksi b-bølge data | |
| D | 0,103827009 | 0.17415038 | 0,195 | 0.125 |
| p-verdi | 0,928603977 | 0,375501627 | 0.250 | 0,781 |
| alfa | 0,05 | 0,05 | 0,05 | 0,05 |
Tabell 3: Representative målinger for 250 mikrometer glutamat for b-bølgeamplitudene og a-bølgeamplitudene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble en betydelig innvirkning på b-wave amplitude etter 45 min av hypoksi funnet. Denne reduksjonen var fortsatt signifikant etter utvasking fasen. En lignende effekt på fotoreseptoren potensial kunne observeres.
Resultatene støttes av andre publiserte data 16 og gir oss mulighet til å studere mulige nervecellene effekter etter hypoksi.
Etter 45 min utstilling av 250 mikrometer glutamat, fant vi en statistisk signifikant innvirkning bare på b-wave amplitude som var fullt reversible ved slutten av utvaskingsperiode. Fotoreseptoren potensialet ble ikke påvirket av 250 mikrometer glutamat. Det faktum at bare den indre netthinne ble påvirket av hypoksi indikerer at endringene er veldig subtil, og at vi derfor har en veldig sensitiv og standardisert indikator for mulig neuroprotection. Aspartat hemmer spesifikt overføring fra fotoreseptoren til horizontal eller bipolare celler og dermed undertrykker B-bølgen.
Dette funnet er i strid med funn av Green DG og Kapousta-Bruneau NV, som fant at med konsentrasjoner av 250 og 500 mm glutamat deres b-bølger innspillingen var mer stabile over tid i forhold til media alene 17. For å forklare denne motsetningen flere forskjeller i de innstillinger som må tas i betraktning: Sickel-oppløsning ble benyttet i denne modellen det andre publikasjonen brukes Ringer-løsning.
Målingene ble utført med en rekke andre publikasjon med en enkelt elektrode. Bovine øyne fra slakteriet ble brukt mens den andre publikasjonen beskrevet ferske rotte øyne. Effekten var reversibel med en tidsmessig hemming ved høye glutamat konsentrasjoner. Det er alminnelig kjent at en viss meget lav mengde av glutamat er nødvendig for god opprettholdelse av øyet, og at større mengder er giftige. Vi kan anta at de bovine øynene fra slaughterhouse mer glutamat blir lansert i forhold til nylagde øynene resulterer i glutamatnivået blir annerledes enn forventet fra eksperimentelt lagt glutamat.
Måle responsen ved bruk av en oppstilling over hele netthinnen i stedet for en elektrode, som er hovedsakelig påvirket av de nærmeste celler, kan også føre til en lengre overlevelsestid på grunn av lavere mekanisk skade. Til slutt, er sammensetningen av mediet avgjørende. I 1960, Prof. Sickel tungt investert i å utvikle denne spesialiserte media for disse målingene, og han var i stand til å finne en optimalisert media uten glutamat for en stabil retinal respons 13,14.
Den beskrevne modellen er avhengig av en isolert hinnen i stedet for en hel dyr. I en in vivo-system, er øyet isolert ved blod-retina-barrieren fra andre organer i dyr. Fordelen med denne modellen er at forstyrrende parametre i studie dyr, for eksempel anestesieller posisjonen av elektrodene ikke forekommer, noe som tillater en høyere grad av standardisering. Standardisering er et kritisk punkt i dyreforsøk, spesielt når det gjelder øyet 18.
Begrensningene ved denne metode er den korte testperioden, og det faktum, at det ikke er en dyremodell. Vi vet av erfaring at ERG amplituder holde seg stabilt i ca 8 timer, derfor testperioden nevnt i innledningen kan utvides til en lengre utredning og oppfølging periode, men man bør alltid vurdere at jo lenger et enkelt eksperiment er utvidet, det mer sannsynlig høyere standardavvik vil finne sted.
En ulempe ved modellen er derfor at det ikke langtidsstudier kan utføres, og bare et begrenset antall av manipuleringer til netthinnen er mulig. For utstrakt manipulering og spesielle erg som multi-fokal ERG styrt av SLO som beskrevet i Dutescu et al., For eksempel in vivo-eksperiments er nødvendig 19.
Denne modellen kan lett brukes for menneske eksplantert netthinne fra f.eks utskrapte øyne. Siden dette sensitivt materiale er komplisert å få tak i, eksperimenter på storfe netthinne er mer gjennomførbart, men bør tolkes holde dette i bakhodet.
De kritiske trinn i protokollen er transport og forbereder netthinnen under mørke tilpasset forholdene. Dette er viktig for å oppnå de maksimale mulige svar. Noen ganger kan det ta et par minutter å forsiktig skille netthinnen fra den underliggende pigment epitel. Forsiktig risting av utstanset hinnen noen ganger forenkler denne prosessen. Mens plassere hinnen på nettet, er det viktig å plassere hinnen med den ytre retina på nettet. Etter trephanization, vil kantene av retina bøyes litt oppover som indikerer posisjonen til den indre retinal lag.
Storfe retina er mer lik den menneskelige netthinnen sammenligned til netthinnen i øyet gnager på grunn av en tilsvarende glassaktig-linse-forhold og en vaskulær struktur som ligner på en av det menneskelige øye 20; Derfor, selv om små laboratoriedyr som rotter eller mus, er mye brukt for testing av retinal biokompatibilitet, toksisitetsstudier utført på slike dyr er ofte mindre anvendelig for mennesker 20. Fylogenetisk analyse av myocilin gen - et gen som i sin muterte formen bevirker autosomal dominant juvenile åpenvinkelglaukom - viser at det bovine gen er nærmere beslektet med det humane gen enn den til rotte eller mus, 21. Myocilin kan finnes i trabekelverket-celler, så vel som i netthinnen. Endelig viste vi en god korrelasjon mellom storfe og menneske isolerte erg og ERG effekter 12.
I vår modell ble aspartat ansatt for å avdekke fotoreseptoren potensiell P III ved å avskaffe den b-bølgen. Dette gir utprøver anledning til å skillemellom virkninger på den indre retinal nettverket og fotoreseptoren funksjon 22. Mens b-bølgen er en mye mer følsom parameter med hensyn til det integrerte funksjons, er a-bølgeamplituden mer stabil og mer motstandsdyktig mot stress, på grunn av det faktum at a-bølgen bare reflekterer reaksjonen av fotoreseptorene i lyset det. I motsetning til dette, b-bølgen avhenger av celle-til-celle-interaksjon av forskjellige retinale celler, og aktiviteten av fotoreseptorene. Ved å bruke aspartat å isolere en bølge det er mulig å undersøke effekten av manipulasjoner på fotoreseptorene 23 alene.
I denne studien ble en standardisert neuronal toksisitet modell som kan brukes for å teste neurobeskyttende midler ble evaluert. Som en utsikter vil det være interessant å korrelere elektrofysiologisk funksjon med protein-biokjemisk analyse eller å korrelere funksjon med cellenes stoffskifte eller mRNA uttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germany | 1,064,041,000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germany | 1,050,010,250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germany | 58,330,250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germany | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germany | 1,065,860,500 | |
| 5 mM glucose | Merck Pharma, Germany | 40,741,000 |
References
- Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
- Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J.
- Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
- Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
- Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
- Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
- Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
- Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
- Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
- Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
- Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
- Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
- Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
- Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
- Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
- Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
- Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
- Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).
