Abstract
Immunohistokemi är en allmänt använd teknik för detektering av närvaron, plats och relativ förekomst av antigener in situ. Denna inledande nivå protokoll beskriver de reagenser, utrustning och tekniker som krävs för att slutföra immunhistokemisk färgning av gnagare hjärnvävnad, användning av markörer för mikroglia och neuronala element som ett exempel. Närmare bestämt är detta papper en steg-för-steg-protokoll för fluorescerande visualisering av mikroglia och nervceller via immunohistokemi för Iba1 och Pan-neuronal resp. Fluorescens dubbel-märkning är särskilt användbar för lokalisering av flera proteiner i samma prov, som ger möjlighet att noggrant observera interaktioner mellan celltyper, receptorer, ligander, och / eller den extracellulära matrisen i förhållande till varandra såväl som protein co- lokalisering inom en enda cell. Till skillnad från andra tekniker visualisering, kan fluorescens immunohistokemi färgningsintensitet minska ide kommande veckorna månader efter färgning, såvida inte lämpliga försiktighetsåtgärder har vidtagits. Trots denna begränsning, i många applikationer fluorescens dubbel-märkning är att föredra framför alternativ såsom 3,3'-diaminobensidin-tetrahydroklorid (DAB) eller alkaliskt fosfatas (AP), som fluorescens är mer tidseffektivt och möjliggör mer exakt differentiering mellan två eller flera markörer. Diskussionen omfattar felsökningstips och råd för att främja framgång.
Introduction
Immunohistokemi är ett förfarande för detektering av antigener (dvs proteiner) i vävnadssnitt med hjälp av primära antikroppar som binder specifikt till antigenerna av intresse. Immunhistokemi var uppfunnen av JR Marrack 1934 när han konstaterat att antikroppar kunde lokalisera antigener med stor specificitet 1. Från och med 1942, några av de första in vitro-studier med fluorescerande antikroppar för att visualisera immunohistokemi publicerades 2,3, varefter den första in vivo-histokemisk studie publicerades 4. Under 1960-talet, tre decennier efter starten av immunhistokemiska metoder, började enzymkonjugerade antikroppar som skall användas som sekundära reagens. Dessa metoder samtidigt och oberoende utvecklat i Frankrike och USA 5,6. Idag erbjuder ett brett utbud av antikroppar oändliga möjligheter för immunohistokemi studier 7.
"> Det övergripande målet för denna korrespondens är att ge en kort introduktion till immunohistokemisk färgning, det är inte tänkt att vara en heltäckande och uttömmande genomgång av denna teknik i den metod som anges är immunohistokemiska tekniker för två antigener presenteras (markörer för mikroglia och. neuroner) för färgning av paraformaldehyd perfusion börjar sackaros kryoskyddad, cryosectioned råtthjärna. Immunohistokemisk färgning med blockerande ospecifik antigenbindning att minska bakgrundsfärgning. Därefter inkubation med primär antikropp gör det möjligt för bindning till ett specifikt antigen i vävnaden. Efter den primära antikroppen, en annan antikropp, benämnd sekundär antikropp, appliceras för att länka den primära antikroppen till ett konjugerat visualisering signal 8. Den sekundära antikroppen riktar sig immunoglobulin G (IgG) domän är specifik för de arter där den primära antikroppen togs upp. förstärker Den sekundära antikroppen signalen av den primära antikroppen, eftersom Fab-regionerna av tHan sekundär antikropp binder till flera webbplatser på IgG-domänen av den primära antikroppen. Antingen enzymer eller fluorescerande molekyler konjugerade till F c regioner i sekundär antikropp möjliggör visualisering. Till exempel är en kanin-anti-Iba1 primär antikropp en kanin-IgG-molekyl specifik för Iba1. När åsne-anti-kanin-IgG anbringas som en sekundär antikropp, kommer den att känna igen och binda till flera regioner av kanin-anti-Iba1 IgG (se figur 1). Åsnan antikropp kan visualiseras med olika metoder. Denna överensstämmelse är inriktad på detektering av en fluorofor konjugerad till den sekundära antikroppen, som igenkänner den primära antikroppen, för visualisering genom fluorescensmikroskopi. I fluorescerande immunohistokemi, kan en nukleär färgning såsom Hoechst eller DAPI användas för att visualisera alla kärnor.
Figur 1: SchEmatic representation av direkt kontra indirekt antikroppsmärkningstekniker. Antikroppar binder till antigenet av intresse och kan förstärkas genom sekundära antikroppar riktade mot arter av de primära antikropparna. Denna teknik kan utföras med användning av avidin-biotin-komplex (ABC) för amplifiering och DAB för visualisering (A), eller en direkt konjugerad fluorescerande sekundär antikropp (B). Alternativt kan primära antikroppar direkt konjugerad med många olika taggar, inklusive biotin eller en fluorofor (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En alternativ metod för visualisering av immunohistokemisk färgning använder 3,3'-diaminobensidin-tetrahydroklorid (DAB; se figurerna 1 och 2). Detta skiljer sig från fluorescens genom att använda en biotinylerad ellerpepparrotsperoxidas (HRP) konjugerad sekundär antikropp, som ger ett enzym för att omvandla DAB till en fällning som är synlig under ljusfältsmikroskopi. I de fall där en enda antigen är av intresse eller färgning krävs för att vara långvarig, kan DAB vara lämpligare än fluorescerande färgning. Emellertid DAB-färgning är inte väl lämpad för differentiering mellan flera markörer, särskilt om två nukleära antigener är av intresse. För information om DAB material och protokoll modifieringar, konsultera tabell 1. Alternativt kan nitroblå tetrazoliumklorid / 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (NBT / BCIP) användas för att visualisera en alkalisk fosfatas (AP) konjugerad sekundär antikropp.
Figur 2:. Bilderna är av nickel-förstärkt DAB enkelmärkta råtthjärnvävnadssnitt Rat hjärnan synsTGÄRDER som är märkta med nickel-förstärkt DAB för Iba1 (A) och Pan-neuronal (B) möjliggör långvarig analys av mikroglia eller nervceller ensam. Skala bar 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Man måste beakta det uppskattade överflöd av antigenet av intresse i den vävnad som analyseras. Indirekta metoder (såsom beskrivits ovan) är användbara för mål med låg förekomst. När antigenet av intresse är i hög överflöd, kan direkta metoder tillämpas. Direkta metoder innefattar en primär antikropp som är direkt konjugerad till en visualiseringssignal, och därmed ingen sekundär antikropp krävs. Denna metod förenklar färgningsprocessen, men eliminerar amplifieringen uppnås med indirekta metoder. Med användning av en direkt konjugerad primär antikropp också eliminerar korsreaktivitet av sekundära antikropparnär dubbel märkning.
Detta meddelande specificerar protokoll för dubbelmärkning med Iba1 och Pan-neuronala (detaljer i tabell 1). Iba1 fläckar mikroglia i många aktiverings stater, däribland förgrenat, hyper-förgrenad, aktiveras amöboid och stav. Pan-neuronala fläckar neuronala axoner, dendriter och Soma. Sedan Iba1 fläckar flesta mikroglia och Pan-neuronala mål neuron, är denna kombination av fläckar användbara i att få en bred förståelse för mikroglia-neuron interaktioner.
Sammanfattningsvis bygger immunhistokemisk färgning på noggrant urval av antikroppar. Som frågeställningen blir mer specifika, kan antikroppar riktade till alternativa antigener önska. Om du vill rikta en särskild microglial aktiveringstillstånd, kan man välja att använda CD45 eller CD68 antikroppar, snarare än Iba1. Vidare att arbeta med möss, får F4 / 80 ger de nödvändiga resultaten. På samma sätt kan neuronala element specifikt inriktade med antikroppar raserad mot kärnan, synapsen (före eller efter), axon, och tillväxten konen. Dessutom finns andra markörer som skiljer en ålder av neuron (Dubbel Cortin, NeuN) och neuronal regenerering (GAP-43).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla förfaranden genomfördes i enlighet med de institutionella Djurvård och användning kommittén (IACUC) vid University of Arizona. En lista över rekommenderade material och utrustning kan hittas i tabell 1.
1. Vävnadsberedning
- Perfusion
- Euthanize gnagare med en överdos av natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP) och BEGJUTA transkardiellt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tills den är helt tömdes på blod (3-5 min) vid en flödeshastighet av 8 ml / min. För fördjupad perfusion instruktioner, se Gage et al 2012 9.
- Omedelbart efter PBS-spolning, fixera vävnaden genom perfusion med 4% paraformaldehyd i PBS under 15 till 20 min vid en flödeshastighet av 8 ml / min.
- Avlägsna hjärna och placera i 4% paraformaldehyd under 24 timmar, följt av graderade sackaroslösningar (15%, 30%, 30%, i sekvens; framställd i Tris-buffrad saltlösning) vid 4 ° C. Överför hjärnan till den efterföljande sackaroslösning oara efter hjärnan har sjunkit i varje lösning. Obs! Vanligtvis är 5 dagar i varje lösning tillräckligt med tid för vävnad att sjunka.
- Vävnads Frysning och cryosectioning
- Placera hjärnan i inbäddningsmediet, såsom OCT-förening och dränka i isopentan vid en temperatur av -35 ° C. Låt hjärnan att frysa i minst 10 minuter, och sedan lagra vid -80 ° C. Problem kan uppstå om flit till temperatur inte följs; se diskussion för felsökningsinformation.
- Skär seriella koronala sektioner vid en tjocklek av 20 | j, m och en temperatur av -20 ° C. Samla vävnad på positivt laddade bilder. Hjärnsektioner kan placeras i ett bildspel box inlindad i folie i en zip-top väska och lagras på lång sikt vid -80 ° C. Denna metod för lagring skapar en dubbel gräns för att förhindra exponering för luft och frost.
2. Vävnadsbearbetning
OBS: Exempel utrustning och material rbligatoriskt för färgning visas i Figur 3. Det finns alternativ, men kommer dessa bilder hjälpa de nya till immunohistokemisk färgning för att visualisera lämpliga objekt innan du köper.
Figur 3: Exempel på varor för immunohistokemisk färgning Den svarta lådan som visas i (A) är en idealisk fuktkammare för immunofluorescens, som diabilder skyddas från ljus utan att behöva slå in rutan på folien.. Efter snittning, kan diabilder förvaras i en låda som den gula rutan som visas i (B). Inslagning rutan tätt i folie och placera i en zip-top väska innan frysen skyddar vävnadsprover från frysbränna. Ett exempel på objektglas ges i (C), med olika färgnings rätter avbildade i (D) och (E (F), dock 1,2 tjocka täck ger fina imaging resultat på de flesta stående och konfokala mikroskop. En penn såsom den som visas i (G) kan användas för att märka bilder. Permanenta markörer bör undvikas eftersom bläcket kan köra, vilket påverkar både färgning och förmåga att avgöra vad provet är. En mini pap penna såsom den som visas i (H) möjliggör en repellent gränsen dras på objektglas.
- Slide beredning
- Ta bort diabilder från frysen och tina vid rumstemperatur.
- Valfritt: Om avsnitt tidigare har flutit från diabilder, placera upptinade bilder i en ugn vid 60 ° C i högst 4 timmar för att förhindra vävnadssnitt från flytande av diabilder.
- Placera objektglasen i ett bildspel rack och motsvarande skålen.
- Tvätta objektglasen tre gånger i PBS under 5 min vardera, ändra lösning mellan tvättar. Från detta steg framåt, slippa avsons utan vätska under längre tidsperioder. Obs: Om delar torka ut, är bakgrundsfärgning ökat och meningsfulla uppgifter kan inte på ett tillförlitligt sätt erhållas.
- Ta bort diabilder från frysen och tina vid rumstemperatur.
- Vävnadsfärgning
- I en ljustät färgningsboxen, skapa en "fuktighetskammare" med luddfria vävnader indränkt med avjoniserat vatten.
- Torka kanterna på bilden med en luddfri trasa, använd en mini pap penna för att göra en vattenavstötande gränsen vid kanten av bilden, bort från vävnadssnitt. Denna gräns bör säkerställa gott om utrymme mellan menisken av vätskan och kanten av vävnaden så att ytspänningen inte påverkar färgning.
OBS: pap penna avvisande gränsen kan tillämpas före 2.1.3 om antikropparna av intresse inte kräver mikrovågsugn antigenåtervinning. Om pap pennan har applicerats före tvättning i PBS, måste integriteten för det vätskeavvisande gränsen kontrolleras vid detta steg. Använd en mini-pap penna för att fylla i eventuella luckor i rabatten. - Använd serum från samma art, där sekundär antikropp görs. Obs: I detta förfarande är de sekundära antikroppar görs i åsna, och därmed åsna serum används. Om sekundära antikroppar från två eller flera olika arter används inkluderar serum från varje art.
- Pipett primär antikropp på diabilder. Obs: Antikropps koncentrationer för färgning har optimerats på 1: 5000 och 1: 500 för Iba1 och Pan-neuronal resp. Dessa koncentrationer har visat sig visa meningsfull färgning med en frånvaro av bakgrundsfärgning.
- Späd blocket lösning på1% serum i PBS och till primära antikroppar. Pipettera 300 | il primär antikroppslösning i 1% serum per bild. Återigen, se till vätskan är till kanten av pap pennan. Inkubera över natten vid 4 ° C.
- Inkludera tre kontrollglas: en som innehåller varken Iba1 eller Pan-neuronala antikroppar, en med Iba1 utan Pan-neuronal antikropp, och en med Pan-neuronal antikropp utan Iba1. Fläck dessa glider i samma körning med samma lösningar emellertid utelämna de primära antikropparna att testa den icke-specifika bindningen av de sekundära antikropparna.
- Följande morgon, tvätta glider tre gånger i PBS i 5 minuter vardera, ändra lösning mellan tvättar.
- Fluorescerande antikroppar är ljuskänsliga, därför från detta steg framåt, minimera ljusexponering genom att tvätta behållare insvept i folie och hybridiserings lådor är antingen svart eller inkuberas i mörker. Pipett lämpliga sekundära antikroppar på alla diabilder och inkubera60 min vid rumstemperatur vid en koncentration av 1: 250 i blocklösning (se steg 2.2.3) i en ljustät "fuktighetskammare" (se steg 2.2.1).
- Använd sekundära antikroppar av olika våglängder. Här, för den primära antikroppen kanin anti-Iba1 använda åsna anti kanin 594 som lämplig sekundär antikropp. För den primära antikroppen mus-anti-Pan-neuronal använda åsna anti-mus 488 som lämplig sekundär antikropp. Alternativt kan du använda anti-kanin 488 och anti-mus 594.
- Tvätta objektglasen tre gånger i PBS under 5 min vardera.
- Tillval: utföra nukleär färgning.
- Placera i Hoechst (eller annan nukleär färgning) vid en koncentration av 0,03 | ig / ml i dubbeldestillerat H 2 0 för exakt 60 sek.
- Tvätta objektglasen tre gånger i PBS under 5 min vardera.
- Tvätta i DDH 2 0.
- Täckglasen med ett vattenhaltigt monteringsmedium, såsom Fluoromount-G eller ProlongGold. Var noga med att ta bort alla bubblor med en bomullspinne.
Obs: Andra monteringsmedel kan användas, har dock hög genomblödning mellan färgämnen noterats av vissa inom några dagar efter täck. - Använd genomskinligt nagellack för att täta kanterna, förhindrar sektionerna från att torka ut på grund av avdunstning. Tillåt nagellack torka i en ljustät behållare medan objektglasen förblir platt och vid rumstemperatur, och sedan lagra i en ljustät behållare inslagna i aluminiumfolie vid 4 ° C.
3. Imaging Stained Tissue
- Mikroskopi
- Låt nagellacket torka i minst en timme innan du börjar mikroskopi, vilket bör ske i ett mörkt rum.
- Förvärva mikrofotografier med en konfokala eller forskning mikroskop med en fluorescerande ljuskälla och en digitalkamera fäste. Med hjälp av medföljande programvara, ställa in exponeringen för varje våglängd - 405, 488, och 594 - separat. Obs: fördjupad avbildnings instruktioner bör finnas tillgängliga online från mikroskopet tillverkare.
- Förvärva fotomikrografier i varje kanal utan att flytta sektionerna eller justera fokus. Ta bilder i färg, eller alternativt i gråskala och konvertera till färg efteråt.
Obs: färg eller gråskalebilder från varje kanal kan samlas i efterbearbetning. - Se till att vävnadssektioner inte utsätts för omgivande ljus eller mikroskopisk ljus under långa tidsperioder, såsom foto-blekning av sektionerna kommer att inträffa. För att undvika detta, öka exponeringen tid snarare än att öka ljus / laser intensitet.
- Stäng inte av fluorescerande ljuskällan inom 30 minuter av att vara påslagen.
Obs: Val av källa på och av i snabb följd kan minska livslängden på lysrör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna färgningsprotokollet resulterar i råtthjärna vävnadssnitt som mikroglia har fluorescerande i 594 kanal (röd) och neuroner märkta i 488-kanalen (grön, se Figur 4). Om en nukleär fläcken har gjorts, kommer det att visa i 405 kanal (blå). Bilder kan tas i olika kanaler och överlagras för direkt jämförelse av de tre kanalerna, eller mellan vilka som helst två kanaler. Många digitala förvärvs programvara sviter har den här funktionen. Dubbel märkning med Iba1 och Pan-neuronal markör visas här visar oftast förgrenad mikroglia, med långa fina neuronala prognoser uppenbara över kortikala lager.
Figur 4:. Representativa konfokala fluorescerande bilder av Iba-1 / Pan-neuronala dubbel märkning Kolumn 1 visar mikroglia färgas med Iba1 (röd). Neuroner visas iandra kolumnen i grönt, med den överlagrade bilden av både röda och gröna kanaler i den tredje kolumnen. I den första raden, finns det en total brist på specifik färgning på grund av avsaknad av både primära antikroppar. Den andra raden visar specificitet av Pan-neuronal primär antikropp för neuronal färgning, medan den tredje raden visar specificitet Iba1 för mikroglia, med en total brist på korsreaktivitet i båda fallen. Den fjärde raden visar dubbel-märkning med en överlagring av de två kanalerna som visar både microglial och neuronal färgning. Skalstreck 50 um.
Dåliga färgningsresultat visas också (Figur 5), vilket framgår av bristen på klart definierade cellkroppar och fragmente microglial / neuronala processerna. Hög bakgrund indikerar dålig kvalitet färgning, och kan ses genom icke-specifik sam-lokalisering av antikroppar (se Figur 5). Dessutom, om signalen är svag, ett amplifieringssteg med fluorescerande bunden streptavidin kan införlivas. Istället för att använda ett direkt märkt fluorescerande sekundär antikropp i steg 2.2.6, en biotinylerad sekundär appliceras. Efter tvättning i PBS, streptavidin: är (1 1000 i PBS) inkuberades på objektglasen i en timme. Återgå till protokoll i steg 2.2.7 där glider sedan tvättas och doppas i en motfärg eller lock halkade.
Figur 5:. Representativa fluorescerande bilder av dålig vävnadskvalitet Här visas ett exempel på färgning i dålig vävnads vilket resulterar i en brist på klarhet microglial färgning (a) och total avsaknad av neuronal färgning (b). Denna neuronala färgningen är helt enkelt hög bakgrund. Den överlagrade bilden (c) är inte meningsfullt.
| Namn Material / Utrustning | Företaget | Katalognummer | Kommentarer / Beskrivning |
| Fishersuperfrost Plus objektglas av glas | Fisher Scientific | 22-034-979 | Används för vävnadsmontering (1.2.2) |
| Ugn | Thermo Scientific | 51028112 | Används för vävnadstorkning (2.1.1) |
| Mini Pap penna | Life Technologies | 00-8877 | Användes i steg 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek objektglasfärgskål | Fisher Scientific | 22-149-429 | Används för alla tvättningar under färgning (2,2), samt Hoechst steg (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Används för torkning diabilder (2,2) |
| Svart Färgning Box | Ted Pella | 21050 | Användas för att blockera och färgning steg (2,2) |
| Normalt Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Används för blocket och antikropps inkubation (2,2) |
| Mus α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Används för primär antikropp (2.2.4) |
| Kanin α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19.741 | Används för primär antikropp (2.2.4) |
| Donkey α-kanin 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Används för sekundär antikropp (2.2.6) |
| Donkey α-mus 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Används för sekundär antikropp (2.2.6) |
| Matleverantörer s folie | Någon | N / A | Används i steg 1.2.2 och 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Används för täckglas (2.2.8) |
| Täckglas | Fisher Scientific | 12544E | Används för täckglas (2.2.8) |
| Klart nagellack | Någon | N / A | Används för täckglas (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 och LSM 710 (laserskanning, konfokal) | Carl Zeiss | N / A | Används för avbildning (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N / A | Används för avbildning (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | För DAB-protokollet | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | För DAB-protokollet |
| DAB-peroxidas-kit | Vector Laboratories | SK-4100 | För DAB-protokollet |
| Biotinylerade häst α-kanin IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | För DAB-protokollet |
| Biotinylerade häst α-mus-IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | För DAB-protokollet |
| 30% väteperoxid | FisherScientific | H325-500 | För DAB-protokollet |
| Wheaton objektglasställ och färgning rätter | TedPella | 21043 | För DAB-protokollet |
| Master perfusion pump och slang | Cole-Parmer | Används för perfusion (1.1.1 och 1.1.2) | |
| Andwin vetenskapliga vävnads tek CRYO-OCT-förening (gäller 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Används för vävnads frysning (1.2.1) |
| Termometer (-50 till 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Används för vävnads frysning (1.2.1) |
| Kryostat | Leica | CM3500S | Används för vävnadssnitt (1.2.2) |
| Färgskål, plast med 2 Lock | Grale Scientific | 353 | För antigen retrival |
| 20 Place Färgning Rack, Slides Horisontell | Grale Scientific | 354 | För antigen retrival |
| Mikrovågsugn | Någon | N / A | För antigen retrival |
Tabell 1: Materiallista.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det övergripande målet med detta meddelande var att införa immunohistokemi förfaranden för läsaren. För detta, till exempel dubbel-märkning med Iba1 och Pan-neuronala antigener observera mikroglia och nervceller i paraformaldehyd perfusion, var sackaros kryoskyddad, cryosectioned råtthjärna används.
Denna teknik kan anpassas för att tjäna oändliga syften. En mängd olika antigener i en mängd olika typer, såsom men inte vävnads begränsat till hjärnan, lunga, lever, njurar och tarm kan visualiseras immunhistokemiskt med smärre justeringar av protokollet. Immunohistokemi möjliggör direkt jämförelse av multipla markörer och kan omfatta upp till fyra olika antikroppar i ett enda prov. Antalet antikroppar som används i ett prov är begränsad av genomblödning, som beskriver överlappning av fluorescerande våglängder. Det finns en begränsad fluorescerande ljusspektrum, som följaktligen begränsar färgnings kombinationer inom somingle prov (se figur 6).
När dubbel märkning, är det bäst att välja primära antikroppar som gjorts i olika arter, eftersom båda antikroppar kan tillämpas samtidigt. Dubbel märkning med två antikroppar från samma art är möjligt, även om tekniskt svårt. När båda primära antikroppar görs i samma art, måste färgning göras sekventiellt, genom att fylla i färgning för ett antigen före den andra. Färre problem kommer att uppstå om de primära antikropparna från samma art har olika Ig klasser (dvs mus-IgG och mus IgM eller olika underklasser IgG1 och IgG2a). För mer information kontakta ytterligare referenser 10,11. Detta protokoll använder kanin-anti-Iba1 och mus anti-Pan-neuronal. Det är också nödvändigt att inkludera lämpliga negativa kontroller. För dubbelmärkning med Iba1 och Pan-neuronal, innehåller en bild några primära antikroppar, innehåller en bild endast och en bild innehåller anti-Pan-neuronal enda anti-Iba1 (se Figur 4). Dessa negativa kontroller bekräftar en avsaknad av korsreaktivitet och falsk färgning. Alla andra bilder innehåller både primära antikroppar. Det är också viktigt att undvika att använda sekundära antikroppar som kan korsreagera. Exempelvis med användning av åsne-anti-kanin 594 och kanin-anti-mus-488 skulle resultera i åsna anti-kanin 594 binder till både kanin-anti-Iba1 primär antikropp och åsne-anti-kanin 594 anti-mus 488 sekundär antikropp. Detta skulle skapa falska co-märkning. Antikroppar för ett särskilt protein (antigen) är inte alltid densamma. Till exempel är vissa antikroppar framtagna mot antigener som är närvarande i fryst vävnad, medan andra kommer att känna igen ett antigen som har förändrats under paraffininbäddning processen. Av denna anledning bör ägnas särskild uppmärksamhet till than antikroppsspecifikationsbladet före köp. Om den avsedda tillämpningen för antikroppen inte är listad, kan felsökning vara tvungen att skaffa färgning, eller färgning kanske inte fungerar alls. Dessutom kan tidigare publicerade data ger "knep" för att få fläckar. Av betydelse att notera är att subtila skillnader kan ses i olika satser av antikroppar; smärre ändringar kan behöva göras med varje nytt beslut av en antikropp. De flesta antikroppar är bra för 12 månader från dagen för mottagandet. Var noga med att ange ankomstdagen på produktblad. Om antikroppar färgning inte följs, kan antikroppen vara för gammal eller lagras felaktigt. Det är därför också viktigt att kontrollera varje antikropp specifikation blad för korrekt förvaring. Dessutom, för många antikroppar, olika kloner finns tillgängliga. Olika kloner känner igen olika delar av antigenet av intresse. ENgiven klon kan vara bättre för vävnad utsätts för olika bearbetningsmetoder (vax inbäddade / fryst), rikta vävnadstyp, eller djurslag. Var särskilt uppmärksam på de arter där antikroppen upp. När antikroppen höjs i samma art som den vävnad för analys, kan hög bakgrund observeras. För att bekämpa detta ytterligare blockering med kommersiellt tillgängliga kit, såsom en mus på mus-kit, kan erfordras för färgning. Denna teknik kan även anpassas till cellkultur. Fixering av celler, klon och specificitet måste kontrolleras på specifikationsblad för applikationer. Fixering med paraformaldehyd tvär länkar proteiner, som kan dölja antigenbindningsställen i vissa förhållanden. Antigenåtervinning kan bryta protein tvärbindningar och exponera bindningsställen. Om antigenåtervinning krävs sätter följande protokoll efter steg 2.1.3: med hjälp av en plastfärgskål och sätt in (se tabell 1), mikrovågsugn diabilderi citratbuffert på en låg effektinställning för 10 minuter, var noga med att inte låta lösningen koka rigoröst (specifika effektnivåer som inte ingår beror på variabiliteten i inställningarna mellan mikrovågor). Alternativt, ta citratbuffert till 80 ° C i en glasfärgskål i en ugn, lägg sedan till diabilder i 10 minuter. Dålig vävnadskvalitet kan också orsaka problem med färgning (se figur 5). Det finns ett antal försiktighetsåtgärder man kan vidta för att undvika att äventyra vävnadskvalitet. Först ha tålamod och flitig med sackaros förändringar i syfte att noggrant förflytta vatten i vävnaden före frysning. När frysning, hålla temperaturen konstant. Om vävnaden fryser för långsamt, kommer vattenmolekyler expandera som de fryser, vilket skapar hål i vävnaden. Alternativt kommer frysning vid alltför låg temperatur bringa vävnaden att spricka. Protokoll varierar något för varje antikropp av intresse. Vid mottagande av en ny antikropp, måste man väljaimize protokollet därefter. Om bakgrunds är hög (Figur 5), försök blockering under en längre tidsperiod. Alternativt, öka serumkoncentrationen av blocklösning eller lägg serum från flera olika arter t.ex. get och kaninserum. Dessutom kan kasein användas för att reducera icke-specifik bindning. Skummjölk (gjord från torrt pulver) innehåller kasein och kan användas i ett intervall av koncentrationer (typiskt 1-5% vikt / volym). Mjölk kan användas ensamma eller tillsammans med serum. Om ett antigen av intresse är en intracellulär markör, kan detergenter såsom vid TritonX-100 eller Tween-20 tillsättas till blockeringslösningen för att permeabilisera cellmembranen. Tjockare vävnadssnitt kan behandlas på samma sätt genom att flytande vävnadssnitt i brunnar i stället för att montera dem på bilderna. Paraffininbäddade vävnaden kan också bearbetas på liknande sätt, men kräver en de-vaxning steg före blockering. Feldengut et al. 12 adresser båda dessa metoder. En annan faktor att ta hänsyn till med DAB färgning är att celler sträcker sig över flera lager av vävnad. Det är därför svårt att få tydliga bilder av celler såsom mikroglia som har spänner processer. För att lösa detta problem, vissa forskare sänka sina sektioner tunnare vid 8-12 pm. Avbildning av fluorescensmärkt vävnad uppnås bäst på en konfokalmikroskop. Konfokala mikroskop eliminera diset normalt sett med en forsknings fluorescerande mikroskop genom att isolera och fånga en enda plan av fokus i provet. Med konfokalmikroskopi, finare detaljerna är skarpare och genomblödning mellan fluorescerande färger minskas. Tjockare sampel kan avbildas ett plan i taget (z-stack) för att demonstrera riktig samlokalisering. När tillgång till ett konfokalmikroskop inte är tillgänglig, kan avbildning på en forskning mikroskop, men exponeringstiden och ljusintensiteten behöver vara locked mellan bilderna. 
Figur 6:. Färgspektrumdiagram Varje fluoroforen avger en specifik våglängd av ljus när den exciteras av en särskild laser eller filter. För att effektivt producera flermärkt vävnad, bör det finnas minimal överlappning mellan specifika fluoroforer konjugerade till antikropparna. Även om det finns åtminstone 10 olika fluoroforer som finns på marknaden, är det inte möjligt att erhålla tydliga resultat om alla 10 används. Till exempel skulle trippel-märkning med våglängds utsläpp vid 405, 488 och 594 (A) ger tydlig märkning eftersom det är minimal överlappning, i förekommande fall, mellan dessa våglängder. Men om våglängds utsläpp vid 488, 514 och 555 användes, färgningen skulle inte vara lätt tolkas som varje antikropp kan exciteras av lasern eller filter avsedd för den andra (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
References
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. Immunohistochemistry. , Wiley. (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. Junqueira's basic histology : text and atlas. , Thirteenth edition / edn, (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
