Summary
Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.
Abstract
Menschliche Krankheit spezifischen neuronalen Kulturen sind für die Erzeugung von in-vitro-Modellen für neurologische Erkrankungen des Menschen. Der fehlende Zugang zu primären humanen adulten neuralen Kulturen wirft jedoch einzigartige Herausforderungen. Die jüngsten Entwicklungen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) bietet einen alternativen Ansatz zur neuronalen Kulturen aus Hautfibroblasten durch patientenspezifische iPS ableiten, aber dieser Prozess ist arbeitsintensiv, erfordert spezielles Know-how und große Mengen an Ressourcen und kann mehrere Monate dauern. Dies verhindert, dass die breite Anwendung dieser Technologie auf die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen. Um einige dieser Probleme zu überwinden, haben wir eine Methode, um neurale Stammzellen direkt aus menschlichen adulten peripheren Blut abgeleitet entwickelt, unter Umgehung der iPSC Ableitungsprozesses. Hämatopoetischen Vorläuferzellen aus humanen adulten peripheren Blut angereichert wurden in vitro kultiviert und mit Sendai-Virus-Vektoren, die Transkriptionsfaktoren Sox2, Oktober transfiziert3/4, Klf4 und c-Myc. Die Transfektionsergebnisse in morphologischen Veränderungen in den Zellen, die unter Verwendung von humanen neuralen Vorläufer Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) weiterhin ausgewählt sind. Die resultierenden Zellen werden durch die Expression neuronaler Stammzellenmarker wie Nestin und SOX2 gekennzeichnet. Diese Nervenstammzellen könnte weiter zu Neuronen, Astroglia und Oligodendrozyten in bestimmten Differenzierungsmedien unterschieden werden. Mit leicht zugänglichen menschlichen peripheren Blut-Proben, könnte diese Methode verwendet werden, um neurale Stammzellen zur weiteren Differenzierung zu Nervenzellen für In-vitro-Modellierung von neurologischen Störungen abgeleitet werden und können Studien zur Pathogenese und Behandlung dieser Krankheiten zu fördern.
Introduction
In vitro haben neuronalen Kulturen als ein grundlegendes Instrument für die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen eingesetzt. Primäre tierische (meist Nagetier) neuronalen Kulturen 1, 2 und humanen neuralen Zelllinien aus Gliomen und anderen Tumore abgeleitet sind die am häufigsten verwendete in solchen Studien. Jedoch wurde erkannt, dass es signifikante Unterschiede zwischen Nager- und menschliche Zellen. Viele Erkenntnisse basierend auf Nagetiere können nicht auf den Menschen übertragen werden. Darüber hinaus mit der rasanten Entwicklung bei der Analyse von Massen genomischer Informationen und die relativ einfach Gen Bearbeitung und Sequenzierung ganzer Genome, geht der Trend immer mehr darauf ausgerichtet, die Entdeckung Krankheit anfällig Gene und die Abgrenzung ihrer Funktionen und Rollen in bestimmten Krankheiten, die die wenigen menschlichen neuronalen macht Zelllinien sind nur begrenzt Gebrauch. Theoretisch humanen primären neuronalen Kulturen aus Proben von Patienten Nervensystem abgeleitet werden, sind die beste Wahl, aber sie unmöglich zu erhalten sind; daher alternative meththoden notwendig. In den letzten Jahren haben einige Ansätze verfolgt, mit zwei die unterscheidbar. Nach der Entwicklung der Technik der Erzeugung von pluripotenten Stammzellen (iPS) unter Verwendung der Maus und menschliche Körperzellen 3, 4, Nervenzellen weiter differenziert daraus 5-7 sein könnte. Allerdings Erzeugung und Charakterisierung iPSC verlangt intensive Arbeit, Techniken und Zeitaufwand, manchmal sogar unerschwinglich. Kurze Zeit später wurde ein anderer Ansatz entwickelt, um direkt zu verwandeln neuronalen Zellen aus somatischen Zellen 8, 9. Die resultierenden Neuronen nichtproliferativer schränkt sie ihre Anwendung in intensive Studien und Wirkstoff-Screening, die eine große Menge an Zellen benötigt. Um die Vorteile beider Techniken, direkte Ableitung von neuralen Stammzellen nehmen / Vorläuferzellen aus Körperzellen wurde von mehreren Gruppen von 10 bis 12, das die mühsame Prozess der iPSC Herstellung und Charakterisierung, aber immer noch provi umgeht erforschtdes eine anständige Anzahl von neuralen Stammzellen für spätere neuronalen Differenzierung. Wir haben zuvor gezeigt, dass nach der Einführung der Yamanaka Transkriptionsfaktoren in hämatopoetische Vorläuferzellen, neurale Stammzellen können direkt mit einer neuralen Vorläuferzelle-Auswählschaltung Medium 13 erzeugt werden. Hier berichten wir über die Verfahren im Einzelnen.
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Protocol
1. Anreicherung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Vollblut Erwachsene
HINWEIS: Hämatopoetische Vorläuferzellen oder CD34 + Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus einer Vielzahl von Quellen einschließlich Nabelschnurblut, Leukapherese Material und Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation basieren Verfahren abgeleitet, gereinigt werden. Die hier aufgeführte Methode verwendet Vollblut als Beispiel.
- Isolierung von PBMCs aus Vollblut:
- Hinzufügen 4,5 ml der Lymphozytentrennmedium zum SepMate Rohr pipettiert es durch die zentrale Bohrung des Einsatzes ist.
- Verdünne die Blutprobe mit einem gleichen Volumen an steriler DPBS mit 2% Humanserum (v / v). B. 5 ml der Probe mit 5 ml DPBS + 2% Humanserum.
- Fügen Sie die verdünnte Probe durch Pipettieren sie an der Seite des Rohres. Achten Sie darauf, die Probe direkt durch die zentrale Öffnung zu gießen.
- Zentrifuge bei 1.200 xg für 10 min bei RT.
- Den Überstand über dem PMBC Schicht vorsichtig entfernen.
- Sammeln Sie die PBMC Schicht (bewölkt) in ein neues Röhrchen.
- 15 ml von Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit 2% menschlichem Serum in das Röhrchen und zentrifugiert bei 150 g für 10 min bei RT mit der Bremse aus.
- Den Überstand verwerfen und das Pellet in 15 ml DPBS mit 2% Humanserum. Zählen die Anzahl von Zellen.
- Zentrifuge bei 690 × g für 10 min bei RT. Entfernen all des Überstandes aus der Röhre.
- Die Zellen in 1 x 10 7 Zellen pro 15 ml Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), das 1% Antibiotika (v / v) und 10% menschlichem Serum (v / v).
- Vor Isolierung von CD34 + Zellen, die Zellen O / N bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.
- Positive Selektion von CD34 + Zellen aus PBMCs mit CD34 Multisort Kit:
HINWEIS: schnell arbeiten und vorgekühlten Lösungen für Zellen machen kalt und zu verhindern Deckelungvon Antikörpern auf der Zelloberfläche und nicht-spezifische Markierung von Zellen pro Bausatz Instruktion.- Sammeln Sie alle PMBCs in einem 50-ml-Tube und zählen die Anzahl der gesamten Zellen in dem Medium.
- Zentrifugiere die Zellen bei 300 g für 10 min. Entfernen Sie alle überstehenden komplett.
- Resuspendieren bis 10 8 Zellen pro 300 ul in Perlenpuffer (DPBS, das 0,5% Humanserum (v / v) und 2 mM EDTA).
- 100 l FcR Blocking-Reagenz und fügen Sie 100 ul von CD34 MultiSortMicroBeads.
- Gut mischen und inkubieren für 30 Minuten in den Kühlschrank (2 - 8 ° C).
- Wash-Zellen durch Zugabe von 2 ml Puffer pro Wulst 10 8 Zellen und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei RT. Überstand entfernen vollständig.
- Resuspendieren bis zu 10 & sup8; Zellen in 500 ul Puffer.
- Platzieren MACS LS Säule im Magnetfeld einer MACS Separator und bereiten Säule durch Waschen mit 3 ml Wulst Puffer.
- Bewerben Zellsuspension auf die center der Kolonne. Unmarkierten Zellen fließen, durch die dann erhoben, wenn bevorzugt.
- Waschkolonne dreimal mit 3 ml Puffer Wulst.
- Entfernen Sie die Säule aus dem Abscheider und legen Sie sie auf einem 15-ml-Tube.
- 5 ml Bead-Puffer auf die Säule und sofort spülen die magnetisch markierten Zellen, indem Sie den Kolben in die Spalte.
- Mit 20 ul Multisort Freisetzungsmittel pro 1 ml Zellsuspension. Gut mischen und inkubieren für 10 Minuten in den Kühlschrank (2 - 8 ° C).
- Hinzufügen 1-2 ml Wulst Puffer pro 10 7 Zellen und Zentrifugieren der Zellen bei 300 g für 10 min bei RT. Überstand entfernen vollständig.
- Zellen in 50 ul Kügelchen Puffer pro 10 7 Zellen.
- In 30 ul Multisort Stopp-Reagenz pro 10 7 Zellen und Inkubation für 15 Minuten in den Kühlschrank stellen.
- 5 ml Kügelchen Puffer und Zentrifugieren der Zellen bei 300 g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen.
2. Herleitung der induzierten neuralen Stammzellen aus CD34 + Zellen
- CD34 + Zellen Kultur:
HINWEIS: Frisch zubereitete Medium sollte innerhalb von 7 Tagen verwendet werden, wenn im Kühlschrank gelagert werden. Signifikante CD34 Zellen Verlust konnte nach 24 Stunden beobachtet werden, aber die eine signifikante Proliferation von Zellen sollte erkennbar sein, insbesondere für Tag 5. Wenn die Anzahl von Zellen kontinuierlich abnimmt oder keine Proliferation entweder schlechte Qualität des Mediums oder CD34-Zellen und die Zellen impliziert dies, nicht für den nächsten Schritt verwendet werden.- Resuspendieren und Kultur CD34 + Zellen in CD34 beibehalten Medium (StemSpan SFEM mittlerer menschlicher Thrombopoetin enthaltenden (TPO, 100 ng / ml), fms-ähnliche Tyrosinkinase 3 (Flt-3) Ligand (100 ng / ml) und Stammzellfaktor (SCF, 100 ng / ml), Interleukin-6 (IL-6, 20 ng / ml) und Interleukin-7 (IL-7, 20 ng / ml)) in einer 24-Well-Platte (bis zu 3 x 10 5 / Vertiefung in 1 ml Medium pro Vertiefung) bei 37ºC in 5% CO 2 -Inkubator.
- After 24 Stunden, sammeln Sie die schwimmenden Zellen und Zentrifugieren der Zellen bei 110 × g bei RT zu der alle angeschlossenen Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 1 ml frischem Medium und CD34 beibehalten Saatgut in eine neue Platte mit 24 Vertiefungen (bis zu 1 x 10 5 / Vertiefung) bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator für weitere 5 Tage.
- Ersetzen der Hälfte des Mediums alle neulich durch vorsichtiges Ansaugen der oberen Hälfte des Überstandes während die CD34 + Zellen werden auf dem Boden der Vertiefungen (1A) schweben.
- Sendai-Virus-Transfektion:
- Am Tag 5 sammeln CD34 Zellen und Zentrifugieren der Zellen bei 170 g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen.
- Resuspendieren der Zellen in frischem Medium bei 1 x 10 5 / Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen in 1 ml Medium.
- Tauen Sie eine cytotune-iPS Sendai Umprogrammierung Satz von ersten Eintauchen der Boden der Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Sekunden und dann vollständig auftauen eint RT. Kurz zentrifugieren die Rohre und legte sie auf Eis. Bereiten Sie das Sendai-Virus-Mischung durch Mischen der empfohlenen Volumen jedes Virus auf dem Analysenzertifikat (COA) für die entsprechende Menge enthalten sind. MOI 15 wird empfohlen.
- Hinzufügen Sendaivirus Mischung in jede Vertiefung der CD34-Zellen. Mischen Sie die Wells durch leichtes Schütteln. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.
- Beachten Sie die Transfektionseffizienz nach 24 Stunden. Beachten Sie, daß Zellaggregate und Kugelbildung sind Indikatoren für eine erfolgreiche Transfektion (1B).
- Ändern Sie die Hälfte des Mediums durch vorsichtiges Übertragung der oberen Hälfte des Medium in ein anderes auch. Wenn es Zellkugeln in der neuen gut, mit der gleichen Menge an frischem Medium.
- Ändern Sie jedes Medium den anderen Tag, indem Sie Schritt 2.2.6.
- Neuronale Stammzellen Induktion:
HINWEIS: Je nach Zellenbedingungen, etwa 5 oder 7 Tage nach der Transfektion Mono anhaftenden Zellen wird 30 zu erreichen -50% Konfluenz (Abbildung 1C).- Entfernen der Überstände, die schwimmende Zellen und Kugeln und dann 1 ml der neuralen Vorläufermedium (Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12), das 1 × N2 Ergänzung, 0,1% (w / v) Rinderserumalbumin ( BSA), 1% (v / v) Antibiotika, 20 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und 20 ng / ml des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF)) in die anhaftenden Zellen.
- Optional distanzieren die Zellkugeln durch vorsichtiges Pipettieren und Zentrifugieren der Zellen bei 170 g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 1 ml der neuralen Vorläufer Medium in einem neuen 24-Well-Platte mit Matrigel pro Befehl als Backup beschichtet.
- Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen zu erreichen 60-80% konfluent, in der Regel nach 1 Woche.
- Überstand verwerfen und fügen Sie in 1 ml der neuronalen Stammzellmedium (serumfreies Medium, NSC SFM). Distanzieren die Zellen mit einem Zellschaber, gefolgtdurch sehr vorsichtiges Pipettieren.
- Entfernen der Zellen und Samen alle von ihnen in eine Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Fügen Sie eine weitere 1 ml neurale Stammzellmedium auf 2 ml Medium für jeden gut zu machen. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.
- Ändern Sie jedes Medium den anderen Tag.
- Wenn Zellen erreicht 60% Zusammenfluss, distanzieren und Ausstrich der Zellen bei 1: 3-Verhältnis wie im Abschnitt 2.3.4 und 2.3.6.
- Einfrieren von neuralen Stammzellen:
- Bereiten neuralen Stammzellengefriermedium durch Zugabe von 20% Dimethylsulfoxid (DMSO) in die neuronale Stammzellmedium. Halten Sie das Gefriermedium auf Eis.
- Distanzieren die Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen, mit Zellschaber, gefolgt durch vorsichtiges Pipettieren. Zählen Sie die Zellen. Zentrifugiere die Zellen bei 170 g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen.
- Die Zellen in neuralen Stammzellenmedium bei 1 x 10 6 / ml. Das gleiche Volumen der Gefriermedium zu den Zellen.
- 1 ml (5 x 10 5 Zellen insgesamt) von Zellen in einem Kryoröhrchen. Frieren Sie die Zellen unter Verwendung eines Mr. Froster Gefrierbehälter nach der Anweisung.
3. Neuronale Zelldifferenzierung
- Neuronalen Zellen Differenzierung:
- Wenn Nervenstammzellen 80% Konfluenz erreichen, nehmen Sie die neurale Stammzellen mit einem Gummiwischer und dann durch vorsichtiges Pipettieren distanzieren.
- Zählen Sie die Zellen und stellen die Konzentration auf 1 x 10 5 / ml in der neuralen Stammzellmedium.
- Für die neuronale Differenzierung, Platte die Zellen auf Poly-D-Lysin / Laminin-Deckgläser in 24-Well-Platten mit 1 x 10 5 / Vertiefung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.
- Ersetzen Sie das Medium mit neuronalen Differenzierungsmedium (DMEM / F12 aus 1x N2 zu ergänzen, 1x B27 ergänzen, zu 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM Vitamin C, 10 ng / ml Gehirn derived neurotrophic factor (BDNF) und 10 ng / ml Gliazellen abgeleitet neurotrophic factor (GDNF)) after 24 Stunden. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.
- Ändern neuronalen Differenzierungsmedium zweimal pro Woche für 2 Wochen.
- Astroglia-Differenzierung:
- Distanzieren die neuralen Stammzellen durch Pipettieren.
- Zählen Sie die Zellen und Einstellen der Zellkonzentration auf 5 × 10 4 Zellen / ml. Samen der Zellen auf 24-Well-Platten. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.
- Ersetzen des Mediums mit DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator.
- Ändern Medium zweimal pro Woche für 2 Wochen. Wenn Zellen erreichen Fluss vor 2 Wochen, Ausstrich die Zellen folgenden Schritte 3.2.1 und 3.2.2.
- Oligodendrozyten-Differenzierung:
- Distanzieren die neuralen Stammzellen durch Pipettieren.
- Zählen Sie die Zellen und seed 1 x 10 5 Zellen auf Poly-L-Ornithin-beschichteten Platten mit 24 Vertiefungen in 1 ml Oligodendrozyten differentiation Medium bestehend aus DMEM / F12, enthaltend N2 ergänzen, 10 ng / ml von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml von Neurotrophin-3 (NT-3), 2 ng / ml sonic hedgehog ( Shh) und 3 nM Triiodthyronin (T3). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator.
- Ändern Medium zweimal pro Woche für 2 Wochen.
- Ersetzen des Mediums mit DMEM / F12 mit 1xN2 Ergänzung und 3 nM T3 und Kultur werden die Zellen für eine weitere Woche für basisches Myelinprotein (MBP) Produktion.
4. Immunfluoreszenzfärbungen
- Tauschen Sie Medien mit 4% Paraformaldehyd (PFA). Inkubieren für 10 min bei RT.
- Verwerfen PFA und waschen mit PBS, das 0,1% Triton X-100 (PBS-T) 3-mal, jeweils 5 min.
- Permeabilisieren Zellen mit PBS, enthaltend 0,5% Triton X-100 für 10 min bei RT.
- Blockieren der Zellen mit PBS-T, enthaltend 4% Ziegenserum für 20 min bei RT.
- Die Zellen mit entsprechenden primären Antibo inkubierenMatrizen in PBS-T, enthaltend 0,1% BSA für 2 Stunden bei RT oder O / N in Kälteraum verdünnt.
- Die Zellen werden 3 Mal mit PBS-T, je 5 min. Inkubieren der Zellen mit der entsprechenden sekundären Antikörper gekoppelt mit einem Fluorochrom mit 1: 400-Verdünnung in PBS-T, enthaltend 0,1% BSA für 1 h auf einem Rüttler in der Dunkelheit.
- Die Zellen mit PBS-T, enthaltend 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 10 min bei RT waschen.
- Für jede 5 min bei RT Waschen der Zellen zweimal mit PBS-T.
- Beachten Sie die markierten Zellen mit einem Mikroskop und fotografieren (Abbildung 3).
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Representative Results
Die Qualität der CD34-Zellen ist kritisch für den Erfolg der neuronalen Stammzellübertragung. Hochwertige CD34-Zellen vermehren sich während der ersten paar Tage der Kultur und erscheinen als nicht haftende, homogene Rundzellen, Schwimm knapp über dem Boden der Kulturgefäße (Abbildung 1A). Die erfolgreiche Infektion führt zu Zellaggregaten, die im Laufe der Zeit (Abbildung 1B) erweitert, während unspezifische Zellaggregate können während der Zellkultur auf, die sich ausdehnen und den Verbänden sind locker. Adhärente Zellen etwa drei bis fünf Tage nach der Transfektion treten in der Regel; sie sind meist bipolar und sich vermehren, um Monoschichten (1C) zu machen. Nach einer Selektion mit neuralen Vorläuferzellmedium meisten der anhaftenden Zellen Nestin und SOX2 positive aber OCT4 negativ (Abbildung 2). Die induzierten neuronalen Stammzellen können weiter differenziert zu Neuronen und Gliazellen (Abbildung 3).
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Abbildung 1. Morphologische Veränderungen der CD34-Zellen nach Sendaivirus Transfektion. (A) Signifikante Zahl der CD34-Zellen können zum Zeitpunkt der Transfektion beobachtet werden. (B) Sphere wie Zellaggregate können 24 h nach der Transfektion Sendai-Virus, die während der Zeit erweitert beachten. (C) Teil bipolaren anhaftenden Zellen erschienen nach 5 Tagen der Transfektion. (D und E) Typische Morphologien neuraler Stammzellen nach Induktion mit neuralen Vorläufermedium und Expansion gezeigt. Maßstab:. 200 & mgr; m für (A) und (B), 400 um für die anderen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. induzierte neurale Stammzellen zum Ausdruck neuralen Stammzellmarker. Neurale Stammzellen zum Ausdruck Nestin und SOX2 aber nicht OCT4. Maßstab:. 200 & mgr; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Neurale Stammzellen Differenzierung. Die neuralen Stammzellen, Zellen mit neuronalen Marker (A), Astroglia Marker GFAP (B) und Oligodendrozyten-Marker unterschieden werden O4 (C). Maßstab:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Ein detailliertes Protokoll, um direkt zu generieren neuralen Stammzellen aus dem peripheren hämatopoetischen Vorläuferzellen ist.
Im Vergleich zu Fibroblasten, ist menschlichem peripheren Blut leichter zugänglich. Verwendung des vorgestellten Protokoll, mehr als 1 x 10 5 hämatopoetischen Vorläuferzellen oder CD34-positiven Zellen aus 10 ml Vollblut angereichert werden. Obwohl Kontamination mit Blutplättchen ist normalerweise nicht vermeidbar, kann es leicht durch Niederalkyl Zentrifugation reduziert werden, und es nicht mit neuralen Stammzellenerzeugung stören. Jedoch wird die Qualität und Anzahl von CD34 Zellen, die die endgültige Produktion von neuralen Stammzellen zu bestimmen. Die Qualität der CD34-Zellen etwa um ihre Reaktion auf CD34 Kulturmedium beurteilt. Eine positive Antwort, schnelle Vermehrung von CD34-Zellen bedeutet mittelfristig, ist entscheidend für die spätere erfolgreiche Transformation. Wenn CD34-Zellen konnte nicht vermehren oder sogar zu unterziehen signifikanten Zellverlust, dann ist der Traformation wird schwierig, was zu einer geringeren proliferativen Zellen. So wird vorgeschlagen, nur starten Transformation mit guter Qualität CD34-Zellen. Obwohl 1 x 10 5 Zellen CD34 sind genug für einen erfahrenen Forscher, kann 3 x 10 5 Zellen für Starter verwendet werden.
Sendai-Virus verwenden ein Nicht-Integration, sehr effiziente und bequeme Weise, Transkriptionsfaktoren in die Zielzellen 14, 15 einzuführen. Ursprünglich zur Erzeugung von iPS verwendet wurden Yamanaka Faktoren auch erfolgreich eingesetzt, um neurale Stammzellen direkt aus Fibroblasten 11 zu generieren. In einem früheren Bericht unter Verwendung des vorgestellten Protokoll könnte Sendaivirus Yamanaka Faktoren enthält auch verwendet, um neurale Stammzellen aus Nabelschnurblut oder erwachsenen peripheren hämatopoetischen Blutzellen zu erzeugen. Im Vergleich mit Hautbiopsie für die Kultivierung von Fibroblasten, Blut ist einfacher und bequemer zu machen. Außerdem wird berichtet, daß hämatopoetische VorläuferZellen bestimmte neurale spezifische Marker 16 drücken auch, dass es eine bessere Wahl für die Erzeugung neuralen Stammzellen. In der Tat, nach dem Sendai-Virus-Infektion, die meisten der beigefügten Monozellen exprimiert Nestin, eine neuronale Stammzellmarker, mit Ausnahme der aggregierteren kompakte Kolonien, von denen einige möglicherweise Anlass zu iPSC zu einem späteren Zeitpunkt zu geben. Somit ist die beigefügten Monoschicht von Zellen werden gesammelt und weiter in neuralen Vorläuferzellmedium, die weit in primären neuronalen Vorläuferzellkultur verwendet wurde, um die neuronale Stammzellschicksals der Zellen zu erleichtern inkubiert.
Es besteht ein empfindliches Gleichgewicht der Aufrechterhaltung der neuralen Stammzellen. Einerseits ist es bevorzugt, dass die Zellen zu einer besseren proliferierenden Fähigkeit zu haben und so oft wie möglich agiert werden. Andererseits ist auch die Leichtigkeit der Differen sie Neuronen kritisch. Zwei verschiedenen Medien verwendet werden, um dieses Gleichgewicht zu erreichen. Die weit verbreitete neuralen Vorläufermedium für die n ausgewähltenEURAL Stammzellidentität Induktion / Auswahl, die der kritische Prozess in erster Linie ist. Es kann auch in späteren Durchgängen verwendet, um die neuronale Differenzierung Fähigkeiten zu verstärken. Jedoch sind die neuralen Stammzellen sehr zerbrechlich und empfindlich, so daß längere Einwirkung von neuralen Vorläuferzellmedium kann stark die Zellproliferation hemmen und führen zu hohen Differenzierung. So neuralen Stammzellmedium dient zur Wiederherstellung von Zellen zu helfen und Zellexpansion erleichtern. Die neuralen Vorläufermedium für neurale Induktion bei Passage 1 verwendet, wenn die Zellen konfluent werden. Wenn übermäßige Hemmung der Zellproliferation und der Toxizität festgestellt wird, ist es notwendig, das Medium mit frühen neuralen Stammzellen Medium ersetzen. Jedoch ist neuronale Stammzellmedium weniger wirksam bei neuronalen Selektion; somit im Laufe der Zeit, vor allem bei Über konfluenten neuralen Stammzellen oder verzögerte Passagierung Kontamination mit nicht-neuronalen Zellen oder Fehlen von neuronalen Differenzierung auftreten könnte. Daher müssen die Zellen brauchen, umregelmässig passagiert werden, wenn weniger als 60% konfluent waren, und mindestens einmal pro Woche. Neural Auswahl mit neuralen Vorläuferzellmedium stehen in späteren Passagen, um die neuronalen Identität wieder herzustellen. Ein weiterer Faktor, der die stemness der neuralen Stammzellen beeinflußt, ist die Beschichtung der Gewebekulturplatten. Beschichtung mit Matrigel oder Poly-D-Lysin Zellanheftung zunächst helfen, falls die Zellen sind schwierig während replating befestigen. Aber langfristige Belastung durch die Beschichtung führt zu weniger Durchgangszahlen. Dies ist, weil die Beschichtung verbessert die Zelldifferenzierungsprozesses und kann in mehr Schaden an den Zellen während der Dissoziation führen.
Als Zusammenfassung verwendet dieses Protokoll Sendai Virus, Yamanaka Faktoren menschliche neurale Stammzellen direkt abzuleiten in 3 - 4 Wochen ab erwachsenen hämatopoetischen Vorläuferzellen aus zugänglich peripheren Blutproben erhalten. Die neuralen Stammzellen weiter differenzierten Neuronen und Gliazellen sein könnte. Diese Methode umgehtdie langwierig und kompliziert iPSC Erzeugungsprozesse aktuell verwendet und kann für die in vitro Zellkulturmodelle für verschiedene neurologische Störungen, die besser darstellen können genetische Unterschiede in bestimmten Erkrankungen, insbesondere von einzelnen Patientenproben verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte separation medium | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Human serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1x |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1,000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μg/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
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