This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.
Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.
Målet med cryoEM är att få elektronmikroskopiska bilder av makromolekyler i sitt hemland hydratiserat tillstånd. Genom att bädda makromolekylen i förglasat vatten, kan en frusen-hydratiserade provet införas direkt och visualiseras i TEM instrumentet. Förglasning, uppnås genom flash frysning (10.000 ° C / sek), fryser provet utan vatten kristallisation och ser till att molekylära omflyttningar under frysning är obetydliga. Överskottet av elektron spridning av provet med avseende på den omgivande bufferten ger en liten men tillräcklig kontrast för att se makromolekylen i frånvaro av någon fläck 1. Datoriserad bildbehandling kan sedan användas för att återskapa den makromolekyl s 3D-strukturen. Stora makromolekyler i ~ 500 kDa- multi MDa sortimentet är idealiska prover för cryoEM (som representerar över 80% av elektronmikroskopi Data Bank (EMDB) poster); dessa inkluderar proteiner, proteinkomplex, protein-nukleinsyra complexes och membranproteiner inbäddade i ett dubbelskikt. Dessa makromolekyler är mindre troligt att kristalliseras (med mindre än 2% går i databasen PBF) men det är ofta så att mindre bitar lösas genom röntgenkristallografi eller NMR-kan dockas i 3D kuvertet skapas av cryoEM. Å andra sidan, några av de största strukturerna lösas genom cryoEM kan identifieras inom den fullständiga cellen genom tunnsektionen TEM 2. Således cryoEM överbryggar effektivt storleken och upplösningen klyftan mellan subcellulära och atomstrukturer.
CryoEM återspeglar bättre makromolekylen s nativa strukturen än den mer klassiska metoden för negativ färgning (NS), där makromolekylen är dehydratiseras och omgiven av ett skikt av tungmetall fläck varvid regionen av fläck utslagning skapar ett kraftigt kontraste "negativ" bild 3. I båda fallen ger elektronstrålen 2D projektion bilder av makromolekyler, som kallas partiklar, där sHAPE beror på orienteringen av makromolekylen med avseende på den elektronstråle. Många partiklar, åtminstone ~ 1000 och med ingen övre gräns, kan analyseras på datorn med "enda partikel analys" (SPA) programvara för att öka signalbrusförhållande (SNR) men medelvärdes samt hitta partikelns spatiala orienteringsparametrar behövs för att återskapa makromolekyl 3D struktur genom baksidan projektion 4-7. NS, med högre SNR, används för preliminär prov karakterisering och generera en de novo 3D rekonstruktion; sin resolution sällan överstiger 20 Å, vilken tas ut av uttorkning och storlek tungmetall säd. I allmänhet, för cryoEM 3D strukturbestämning, en lågupplöst 3D rekonstruktion först erhållits från NS och sedan cryoEM används för att förfina denna lågupplöst initiala karta för att ytterligare studera makromolekyl i sitt ursprungliga hydratiserat tillstånd, för att se dess interna struktur, och för att öka sin resolution. Ingente att om NS modellen förvrängd (det vanligaste exemplet är att platta till följd av uttorkning 8) och cryoEM partiklarna hade låg SNR, då distorsionen kunde bära in i cryoEM modellen (modell-partiskhet artefakt, vilket är vanligt i låg SNR dataset 9). Strukturell distorsion skulle resultera i obalans mellan det nationella systemet och cryoEM råa partiklar och mellan rå cryoEM partiklarna och motsvarande prognoser för 3D-modellen vinkelrätt mot plattriktningen. Modell partiskhet kan lösa sig själv som 3D-modellen genomgår successiva förfining cykler. Om detta inte inträffar, vilket skulle upptäckas som brist på överensstämmelse mellan rå cryoEM partiklar och motsvarande prognoser från 3D-modellen, sedan en de novo modell bör byggas från cryoEM uppgifterna. En bra strategi skulle kunna vara att använda vinkel beredning algoritmen 10, vilket kan ge flera möjliga 3D volymer, och sedan använda NS 3D-modell för att välja den bästa möjliga cryoEM modellsom kommer att förfinas ytterligare 11. En ännu bättre strategi är att öka SNR för den cryoEM dataset (se särskilt avsnitt i diskussions).
Den biokemiska kvaliteten av den renade makromolekyl har en yttersta inflytande på det slutgiltiga resultatet. Den makromolekyl, som renats från vävnad eller uttrycks i heterologa system, måste ha en hög grad av renhet och vara strukturellt intakt. Det ska varken bilda aggregat bör inte heller dela upp. För att definiera en viss konforma bör villkoren förberedelse främja en enhetlig konforma tillstånd. Att studera komplex, är det optimalt att deras k D är i nM-området, annars fixativ har med framgång använts för att stabilisera lägre affinitetsinteraktioner 12,13.
Obearbetade cryoEM bilder ger värdefull information om dimensioner, allmän översikt, aggregationstillstånd / multimerise, homogenitet och interna struktur macromolecule. Trots potentialen för tekniken är vida förbättrad med bildbehandling. En 3D-struktur avslöjar makromolekyl övergripande arkitektur, 3D läge av ligander och subenheter, konformationsförändringar, och möjliggör dockning av atomstrukturer bestäms av röntgenkristallografi eller NMR. Mängden information av en 3D-rekonstruktion ökar stegvis när upplösningen ökar: i allmänhet 15-20 Å upplösning medger entydig dockning av atomstrukturer, vid 9-10 Å alfahelixar syns som stavar, vid 5 Å är det möjligt att urskilja beta ark, och en upplösning på 3,5 Å och bättre är det möjligt att bygga en atommodell 14.
Möjligheten att få informativa bilder och en 3D-rekonstruktion med SPA från relativt små mängder av provet gör cryoEM en attraktiv teknik, som 3-5 pl av minst 0,05 mg / ml är tillräckligt för att förbereda en TEM galler. Minimiinstrumentkravför cryoEM är en hemmagjord eller kommersiell Cryo-kolv, ett elektronmikroskop med ultrahög vakuum, bildinspelningsmedia och lågdos-kit, en kryo-hållare med sin pumpstation, en glimurladdning apparat, och en förångare. Icke-väsentliga men längre önskvärda funktioner på TEM är CCD-kamera (finns i alla moderna TEM) eller en direkt elektrondetektor, fältemission pistol (FEG), energifiltrering, och hög kapacitet datainsamling programvara. Denna programvara i princip möjliggör insamling tiotusentals partiklar i en enda cryoEM session 15, men de ökade behoven datalagring och efterföljande övervakad efterbearbetning tiden behov att beaktas. FEG kombinerat med kontrastöverföringsfunktionen (CTF) korrigering ligger bakom de flesta 3D-rekonstruktioner som nådde upplösningen är tillräcklig för att visualisera alfahelixar. Vid denna tidpunkt, är också provberoende nivå på upplösning: nå 10 Å upplösningen är mindre vanligt att membranproteiner medan omhög grad av symmetri är närvarande då atomär upplösning är mer genomförbart. Den senaste tidens utveckling av direkta elektrondetektorer har möjlig atomär upplösning även för makromolekyler med låg (4x) eller ingen symmetri, där kvaliteten på cryoEM elektrondensitetskartorna matchar dessa härrör från röntgen diffraktionsdata 16,17.
Praktiska exempel illustrerar funktionerna i tekniken finns här i fyra viktiga typer av makromolekyler där cryoEM har ett långsiktigt chefsroll i deras strukturbestämning. (I) Med deras ikosahedra symmetri som ökar datamängden med 60-faldigt och sin storlek som medger trofast och reproducerbar inriktning, har strukturerna för flera ikosaedriska virus lösts till nära-atomär upplösning av cryoEM följt av SPA 18. Vi visar ett exempel på en klass av ikosaedriska virus, de adenoassocierade virus (AAV), för vilka nästan atomstrukturer av cryoEM och genom cryoEM / röntgen hybrid metoder finns 19,20. (Ii) makromolekyler med spiralstruktur inkluderar mikrotubuli, trådar och virus. Deras repetitiva enheter längs spiralaxeln kan analyseras med en mer komplex version av SPA anpassas till den spiralformade geometrin 21. I exemplet visar vi tobaksmosaikvirus (TMV), ett RNA-virus som har lösts till atomär upplösning av cryoEM 22. (Iii) Stora lösliga proteiner har mer än väl studerat. Bland dessa, makromolekyler som bildar symmetriska multi cylindrar utgör en återkommande arkitektur ofta lösas på subnanometer upplösning 23,24. Här visar vi bilder av KLH, en ryggradslös syrebärare, där en hybrid molekylär modell skapades från cryoEM / röntgenkristallografi hybridmetoder 25. (Iv) Membranproteiner är en viktig klass av proteiner; de utgör ca 3/1 av proteinerna som kodas av det humana genomet, men de är svåra att karakterisera strukturellt grund komplikationer i samband med stansmembrane stabilisering domän 26, som utgör mindre än 1,5% av de strukturer som löses genom någon strukturell teknik kombineras. Roll cryoEM och 3D-rekonstruktion i sin strukturbestämning exemplifieras med ryanodinreceptorn (Ryr), en stor eukaryot intracellulär Ca2 + kanal viktigt muskelsammandragning och hjärnan signalering. De högsta upplösningen cryoEM strukturer hittills, med 10 Å upplösning, avslöjar sekundära strukturen 27.
TEM följt av SPA har bidragit många makromolekylära 3D strukturer, närmar 2.000 poster i EMDB i mitten 2014. I allmänhet för en given makromolekyl, är en lågupplöst 3D-struktur bestäms först från NS uppgifter, som kan följas av en med högre upplösning cryoEM 3D-struktur. Den höga kontrasten av de molekylära gränser tillhandahålls av NS, vilket underlättar den första 3D-rekonstruktion, senare förfinats av cryoEM med dess förmåga att kartlägga den interna strukturen av makromolekylen i dess helt hydratiserade tillståndet, och möjligheten att uppnå mycket högre upplösning. En annan fördel med cryoEM är elimineringen av uttorkning stress som kan leda till kollaps av makromolekylen. Dessutom finns möjligheten att utelämna stöd kol, vilket eliminerar möjliga yta absorptionseffekter och visar konforma att makromolekylen antar i lösning. Cryo-negativ färgning, en kombination av cryoEM och NS, ger hög kontrast i en helt hydbetygsatt prov och kan också leda till 3D-rekonstruktion med SPA, men det har sällan använts, med mindre än 10 EMDB poster, delvis eftersom fläcken själv kan störa integritet makromolekylens 31. Två andra TEM tekniker som bidrar till 3D-rekonstruktion är 2D elektronkristallografi och elektron tomografi. 2D elektronkristallografi kräver en plan eller tubulär kristall; kristallens elektrondiffraktion används för 3D-rekonstruktion kan leda till atomär upplösning 32. I elektron tomografi av förglasat eller traditionellt fasta prover, är en makromolekyl eller sub-cellulära komponent roteras inne i TEM för efterföljande tomografisk rekonstruktion 33, med den fördelen att singulära objekt kan rekonstrueras; Men i dagsläget denna teknik har en gräns upplösning mellan 40 till 20 A 34,35. Bland alla dessa molekylära TEM tekniker, har SPA i NS och cryoEM uppgifter varit den mestanvändas. Protokollet illustrerade här är tillägnad få cryoEM bilder lämpliga för SPA-analys; ändå de flesta av protokollet är också tillämplig på cryoEM 2D kristaller och tomografiska prover.
En framgångsrik cryoEM session beror på den kombinerade framgången för många viktiga steg; viktiga aspekter att tänka på, förklaring av gemensamt cryoEM artefakter och hur man undviker dem beskrivs i följande stycken. Detta avsnitt beskriver också riktlinjer för datainsamling för att med hög kvalitet 3D rekonstruktioner med hjälp av SPA-metoden.
Undvik övergången till kristallin is. En central aspekt är att provet behöver bo i glaskroppen tillstånd från det ögonblick Cryo-störta hela TEM observation. Sålunda efter störta provet i flytande etan alla efterföljande steg utförs vid flytande kväve (-196 ° C) eller flytande helium (-269 ° C) temperaturer. Värmer till över -135 ° C omvandlar glaskroppen vatten itill kristallint vatten; då makromolekylära omdisponeringar kan ske och vattenkristaller dominerar bilden (Figur 3A); provet ska kasseras. Oavsiktlig prov uppvärmning kan hända om Cryo-nedmatning, överföring av frysta galler mellan containrar (även om skyddade av en gridbox), och / eller Cryo hållare insättning i TEM är för långsam, eller om hanterings pincett var otillräckligt för- kyls. Betydande vakuum försämring av TEM vid kryo-överföring (kalla provfällor varmare inkommande luft) kan också värma upp provet. Slutligen över bestrålning av provet kan också leda övergången till kristallint isen.
Minimera is kontamination. Med tanke på den lilla provvolym (3-5 l) appliceras på TEM galler, kunde avdunstning koncentrera buffertkomponenter (salt, tvättmedel) och därmed påverka makromolekylära integritet inklusive förlust av multi tillstånd. En hög relativ fuktighet (RH) mikromiljö eller kammare kringgås detta problem. Alternativt kryo-nedmatning kan göras på ett tillräckligt ventilerat miljö kylrummet. Efter kryo-störta RH bör vara så låg som möjligt för att förhindra is förorening, eller kondensering av omgivande luftfuktighet på Cryo-grid, som Cryo-grid själv fungerar som en köldfälla. Ice förorening består av partiklar med hög kontrast och ingen underkonstruktion med storlekar på mellan ~ 5 nm och flera mikrometer som stör eller helt blockera bilden. Undvik luftdrag, prata / andas mot Cryo-grid under luftöverföring, och minska relativ luftfuktighet. Öppna vätskebehållare kväve med kondensvatten (syns som vita svävande partiklar) bör också kasseras.
Maximera makromolekylära oriente / åsikter. För prov support, är ett val göras mellan sanna holey nät och tunna kol över holey galler. Detta beror på (i) hur provet sprids över kolfilm kontra kol hål, (ii) tillgängligt prov concentration, så kala hål kan kräva en koncentration 100X högre än stöd kol för en liknande partikeldensitet på bilden (från ~ 0,02-2 M), och (iii) hur slump är fördelningen av makromolekylorienteringar. Notera att glimurladdning, vilket gör kolet hydrofil, kommer att ha en viktig effekt i samtliga tre aspekter, och att detta kommer att vara prov beroende. När det gäller orientering makromolekyl, medan en återkommande uppfattning är önskvärd för den inledande strukturbestämning av slumpmässig koniska rekonstruktion, är slumpmässighet av makromolekylära vyer önskvärt när förfina 3D-rekonstruktion till högre upplösningar. I vårt exempel, RyR1 interagerar med kolet med en favorit "fyrfaldigt" view (Figur 2D) och kräver holey galler för slumpmässighet av oriente och högre upplösning 36.
Maximera SNR. Den bästa strategin för att öka SNR är att minska bakgrundsbullerkällor. Överdriven istjocklek och (om den finns) kol filmtjocklek än vad som behövs för att stödja och bädda proteinet kommer att lägga extra buller. Istjocklek bör alltså reduceras till det minimum som krävs genom att styra läsk tid, tryck, RH, och filterpapperskvalitet. För support kol, är en tunn (~ 5 nm) kolfilm lager över den tjockare holey kolfilmen: den tjocka holey kolet ger mekanisk motstånds medan provet avbildas över den tunna kol-täckt hålet. Å andra sidan, observera att extremt tunna is och / eller kol kan resultera i en lätt bryts stöd som kan förvandlas till en bana (figur 3D). För att maximera SNR bör onödiga buffertkomponenter undvikas. För membranproteiner, tar diskmedel en betydande vägtull på kontrasten (se figur 2D, högra panelen). Dessutom genom att reducera ytspänningen tvättmedel ändrar det sätt på vilket provet sprids på stödet. Vissa membranproteiner kräver närvaro av lipid utöver DETergent, vilket ytterligare reducerar kontrasten. För att övervinna detta kan provet spädas i en buffert med lägre koncentration detergent och utan lipid precis innan kryo-störta 37. Nya alternativa detergenter 16 och användningen av nanodisks 38 för att stabilisera den transmembrana domänen komponenten verkar vara framgångsrika tillvägagångssätt för avbildning membranproteiner från cryoEM.
Sträva efter högkvalitativa bilder och förbereda för CTF korrigering. Förglasat exemplar kräver höga minskad fokus värden för att generera tillräcklig bild (fas) kontrast där CTF, den funktion som relaterar intensitet till frekvensen, har flera noll övergångar, som peka det inte finns någon information. Medan CTF korrigering är inte nödvändig för lågupplöst 3D rekonstruktion, då siktar på högre upplösning, för att återvinna en korrekt representation av 3D-objekt, bilder med olika defoci behöver samlas så att beräknings CTF korrigering kan göras.CTF beslutsamhet och korrigering ingår i de stora SPA programpaket 4-7; detaljer kan hittas någon annanstans 39. För optimal CTF korrigering, använd en rad defoci. En bra strategi är att alternera mellan 3-4 minskad fokus värden. Värdena är beroende på storleken av makromolekylen (större storlekar kräver mindre defokusering), tjockleken is / kol (tunnare provet kräver mindre defokusering), och spänningen (lägre spänning kräver mindre defokusering). För 200 kV, är en bra utgångspunkt intervall av värden 2,5, 3, 3,5 och 4 um minskad fokus. CTF manifesterar som alternerande ringar av hög och låg intensitet (Thon ringar 40) i det ömsesidiga rymden representationen, effektspektrum. Visning av effektspektrum kommer att avslöja potentialen för upplösning; frekvensen hos den bredaste synliga Thon ringen ligger närmast en priori uppskattning av den uppnåeliga upplösningen. Effekt spektrum bör kontrolleras regelbundet, och astigmatiska (icke cirkulära) Thon ringar (Figur 3C) bör korrigeras med målet stigmator. Thon ringar bör vara synlig åtminstone upp till upplösningen önskas.
En cryoEM dataset erhållits med hjälp av detta protokoll kan bearbetas direkt av SPA för att generera en 3D-rekonstruktion. Även med en perfekt prov, kommer kvaliteten på 3D-rekonstruktion beroende av utvecklingen och specifikationer av TEM utrustning, och på bildbehandling. Med de fortsatta förbättringar i båda dessa fronter, och med särskilt omnämnande till de nyligen utvecklade direkta elektrondetektorer, möjligheten skaffa 3D rekonstruktioner på atomär upplösning mer konsekvent är närmare än den någonsin har varit.
The authors have nothing to disclose.
We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |