Abstract
除其他病理生理改变，长期暴露于香烟烟雾导致炎症和免疫抑制，它已与吸烟者微生物感染和肿瘤发生率的增加的易感性。 体外抑制人外周血单核细胞中的受体介导的免疫应答（PBMCs）中与烟气成分处理是研究的机制和评估暴露于烟草制品的可能的长期影响的有吸引力的方法。在这里，我们的优化方法来执行体外使用的PBMC通过细菌脂多糖，Toll样受体4配体刺激的测定。整体烟条件培养基（WS-CM）的影响，可燃烟草制品的制备（TPP），和尼古丁通过在体外测定法的PBMC研究对细胞因子分泌和靶细胞杀伤。我们表明，分泌的细胞因子IFN-γ，TNF，IL-10，IL-6和IL-8和细胞内细胞因子IFN-47 ;, TNF-α和MIP-1α被压制在WS-CM-暴露的PBMC。效应器的PBMC的细胞毒性作用，如通过对K562靶细胞的杀伤测定法测定也减少通过暴露于WS-CM;尼古丁是效果最差的，这些检测。总之，我们提出了一组改进的测定法来评估的TPP的在体外测定法的影响，并且这些方法可容易地适用于测试其他感兴趣的产品。
Introduction
知识点大幅身体的慢性吸烟的健康的不利影响，包括心血管疾病（CVD），慢性阻塞性肺疾病（COPD）和癌症1,2。慢性吸烟已经知道，引起炎症和免疫抑制，并且这些改变被报告给有助于微生物感染和癌症中的吸烟者3的危险性增加。 在体外和离体技术是有用在阐明的病理生理作用的分子基础香烟烟雾4-9（ 表1）和被认为是用于引导各种烟草制品10,11新兴调控的重要工具。
例如，我们已经表明，可燃烟草产品制剂（的TPP）如全烟雾条件培养基（WS-CM）和总颗粒物质（TPM）远远更多的细胞毒性和损害DNA比非易燃的TPP或尼古丁12,13。一贯以发表的作品，这是最近报道，可燃的TPP或尼古丁12,13。一贯以发表的作品，我们最近报道说，可燃的TPP造成显着的免疫抑制。这是证明了抑制长话样受体（TLR）-ligands，刺激细胞因子的分泌，并有针对性的细胞（K562）的体外模型14杀了外周血单个核细胞。鉴于炎症在香烟烟雾诱导的疾病过程的重要性，对测定条件进一步优化以评价香烟烟雾的免疫调节作用，提出本报告中。
体外测定法通常测量胞内和分泌的细胞因子，以及细胞毒性T细胞和NK细胞对K562细胞的细胞溶解作用杀伤测定法14。该试验涉及预孵化与WS-CM和尼古丁和PBMC的后续刺激s的TLR激动剂历时3天;最终读数是使用酶联免疫测定（ELISA）和/或流式细胞术进行。我们利用细菌脂多糖（LPS），其结合到TLR-4受体，并刺激的PBMC导致产生细胞内细胞因子和细胞因子的分泌。除了各测定步骤的优化，用于评估的TPP，我们还本方法分离的PBMC，细胞死亡测定法，和IL-8的量化的免疫调节作用。这些方法可应用于解决其他研究问题，并进一步细化，以评估烟草制品中的调节上下文。
表1.出版的体外报告和离体方法用于研究烟草产品制剂varilus病理生理作用的CS，香烟烟雾介质。 CSC，香烟烟雾冷凝水; CSE，香烟烟雾提取物; ELISA，酶联免疫吸附测定; GADPH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶;定量PCR，定量聚合酶链反应; RT，实时定量聚合酶链式反应; TS，烟草烟雾。
| 作者（研究年） | Laan 等人（2004） | 穆迪等人（2004） | 奥尔特曼斯等人（2005） | Vayssier（1998年） | Witherden 等人（2004） | 比勒尔等人（2008） |
| 使用电池 | 人支气管内皮细胞（BEAS-2B），人中性粒细胞 | 人肺泡上皮细胞（A549） | 人体气道平滑肌细胞（HASMC） | 人类premonocytic U937细胞，人单核细胞 | II型肺泡上皮细胞（ATII） | 人单核细胞系（THP-1），人肺巨噬细胞 |
| TPP使用 | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| 使用方法 | ELISA，定量PCR，迁移，电动汽车转变 | 免疫组织化学，电泳，Arrayscan试剂盒，RT-PCR法，酶联免疫吸附 | ELISA法，RT-PCR，定量PCR，电泳 | 凝胶迁移率 | 光显微镜，电子显微镜，电泳，ELISA | 定量PCR，ELISA，E-toxate试剂盒（Sigma），P65平板试验（TRANSAM），电泳，各种免疫试剂盒 |
| 措施 | IL-8，GM-CF，AP-1，NF-κB，迁移 | 组蛋白乙酰转移酶，组蛋白脱乙酰酶，NF-κB，IL-8，等电点κB-α，GADPH | HO-1，GADPH，RANTES，IL-8，趋化因子 | 热休克/应激蛋白（HSP / HSP70），HF转录因子NF-κB，TNF-α的 | 表面活性蛋白（SP-A，SP-C），IL-8，MCP-1，GRO-α，TNF-α，IL-1β，IFN-γ的 | IL-8，IL-1β，IL-6，TNF-α，MIP1-α，GRO-α，MAPK / JNK / ERK磷酸化，cJUN：DNA结合，谷胱甘肽，P65：DNA结合 |
| 最终的结果 | CSE通过抑制AP-1的活化下调细胞因子的产生。 | 的 H 2 O 2与CSC提高组蛋白的乙酰化，减少组蛋白脱乙酰酶活性，差异调节促炎细胞因子的释放。 | 香烟烟雾可能引起的IL-8从HASMC释放，增强由TNF-α，20％CSE更少的IL-8释放，趋化因子的抑制作用和RANTES由香烟烟雾。 | TS激活的HF的转录因子，其用的Hsp70过表达和抑制的NFkB的结合活性和TNF-α的释放相关联。 | 减压ATII细胞衍生趋化因子水平的折衷肺泡拉尔修理，有助于香烟烟雾诱导的肺泡损伤和肺气肿。 | 数据提供机械解释为什么吸烟者增加呼吸道感染。抑制先天应答的伴随增加的IL-8。 |
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Protocol
注：书面知情同意做这项研究在当地的临床研究单位根据IRB批准获得，每良好的临床实践。血液处理中，在无菌条件下执行PBMC和其它细胞培养实验的隔离，使用微生物的无菌用品和试剂。
1，WS-CM准备
- 产生的WS-CM如前所述12。
- 准备WS-CM由四个3R4F参考香烟通过罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基无酚红用下面的吸烟方案通过烟：35-60-2，在毫升抽吸量，以秒为单位的时间间隔粉扑，粉扑和持续时间以秒为单位，分别为。每种制剂产生20ml的样品。
- 标签管（S）与日期，时间完成，香烟名称和编号。存储500微升等分在-80℃吸烟后立即完成。
- 分析冷冻WS等分-CM确定尼古丁，烟草特异性亚硝胺，和多环芳香烃的含量如前所述12。
2.分离外周血单个核细胞
- 收集来自健康捐赠者（谁是非消费者对烟草制品）新鲜血液隔离从新鲜血液的外周血单个核细胞在维克森林浸礼会教友健康IRB 15一个独立的审批如下所述。
- 在此之前的血袋的到来，具有的500毫升瓶中，剪刀，隔离缓冲器，和Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（RT）准备在生物安全级别2（BSL-2）的细胞培养罩。隔离缓冲器必须避光。
- 握住血袋颠倒并削减略低于它已被夹住造成至少3厘米管的管中。
- 取下一瓶500毫升的上限，按住瓶口上面管。拿起血袋并倒转，使血液从包成吨自由流动他直到瓶的袋子是空的。允许血液流到瓶与直下作为的内壁以避免产生气泡。
- 倾隔离缓冲器入瓶以1：5的比例的隔离缓冲器来的血液。瓶盖瓶口紧紧地，轻轻地颠倒了，最终在年底，10倍。离开瓶在细胞培养罩孵育与灯关闭，1小时，在室温。
- 光，稻草色层将上述血液中积聚。用25毫升血清吸管入50ml锥形管中取出这一层。所收集的量可以从50变化 - 300毫升，这取决于谁捐献的血液的主题。
- 离心管中，在200×g离心在室温10分钟。
- 吸出半透明的上清液，留下暗血色的沉淀。小球会松动，但粘性。
- 吸取3毫升隔离缓冲分成15毫升锥形管。
- 到重新悬浮颗粒，每50毫升浅黄色液体收集的Add20毫升的DPBSTEP 2.1.5。涡旋调匀，并整合来自多个管的悬浮液。该液体含有悬浮的血细胞。
- 用移液管，在步骤2.1.8转移将5ml悬浮的血细胞置于3mL的隔离缓冲器。倾斜的15毫升锥形管，其中包含的细胞悬浮液缓慢并轻轻以创建两个单独的层。离心管中，在400 XG 40分钟在室温以最小的加速和不带刹车。
- 使用移液管，以除去含有的PBMC所得到的混浊的中间层（血沉棕黄层）到50毫升锥形管中。避免绘图等层次分明下方。转移不超过25 ml接种入各50ml锥形管中。
- 加25毫升冷的运行缓冲液（或多种填充50ml锥形管的整个剩余体积）洗细胞。离心细胞，在400×g离心在4℃下10分钟。
- 重悬沉淀用运行缓冲液10毫升这包含外周血单个核细胞。计数细胞，并使用即时通讯的治疗中，或置于冰上冻结。
3.冷冻和解冻的外周血单个核细胞
- 离心收集在步骤2.1.13，对于以400×g的10分钟的PBMC。
- 填充冷冻集装箱，每个制造商的说明异丙醇。警告：异丙醇是易燃，剧毒。
- 重悬的RPMI 1640培养基（4℃）含有20％胎牛血清（FBS）和10％的二甲亚砜（DMSO）中的沉淀。这是RPMI 1640冷冻介质。悬浮颗粒与冷冻介质，这将导致在具有约5×10 7个细胞/ ml的悬浮液的量。可用于冷冻细胞的数量将有所不同。
- 分配1ml等分细胞悬浮于2ml冷冻管并放置冻存管在冷冻容器中。将冷冻容器冷冻管在冷冻在-80°C至存储O / N，然后取出冻存管，并转移到存储在-150℃的低温冷冻至-190℃。
- 除去从低温储藏的冻存管，并在37℃下温和搅拌迅速解冻它在水浴。
- 立即传送解冻的PBMC中冻存管入15ml锥形管中以含有10％FBS，1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺10毫升的RPMI 1640完全培养基（4℃）。解冻冻存管的内容，应尽快转移，以获得最大的细胞活力15。
- 离心的PBMC，在400×g离心10分钟。
- 悬浮用5ml RPMI 1640完全培养基中的小球，并计数细胞。
- 通过已建立的方法，如台盼蓝排除法测定细胞活力。通常用这种方法的细胞生存力为约90 - 95％。在外周血单个核细胞现在准备在实验中使用。
4.细胞死亡测定
注意：这里列出稀释该STU的目的DY。稀释液可以相应地改变。
- 用RPMI完全培养基至100μl的总体积稀释的WS-CM或尼古丁在一个96孔板/孔，如下所示。
- 稀的WS-CM以下列浓度：0.1，0.5，1,1.5，2，2.5，3，4，和5微克/毫升的相等烟碱单元（基于WS-CM中的尼古丁含量）12。
- 稀尼古丁在RPMI培养基中，以下列浓度：100，200，500，750，1000，2000和3000微克/毫升。注意：尼古丁是急性毒性和对环境有害。
- 加入100微升的PBMC悬浮于RPMI完全培养基中至每个孔1×10 6个细胞/孔的浓度。细胞加的WS-CM或尼古丁的总体积为200微升/孔。
- 本研究的目的，准备两套板如上。覆盖板并孵育一个板放置24小时和一个板3小时，在37℃和5％的CO 2。调整的时间点是必要的。 通过在300×g离心离心3分钟，吸取上清，涡旋板以板覆盖的底部，最后用200微升冰冷的缓冲液重新悬浮细胞洗细胞在RT，并重复该洗涤步骤一次。
- 添加95微升缓冲液，随后用5微升7氨基放线菌素D（7AAD）至每孔100微升的总体积/孔。孵育板在黑暗中在RT下15分钟。
- 加入100微升缓冲液，以集群管。从板到集群管的每个孔中转移细胞悬液的整个体积并采集样品上流式细胞仪。
- 确定使用流式细胞分析软件7AAD阳性细胞的百分比。
5. EC 50测定
- 对WS-CM和尼古丁的EC 50值由外周血单个核细胞的7AAD阳性染色确定。
- 的EC 50值被定义为浓entration在其中细胞的50％在24小时测定法不再可行，并且这些值被表示为相等尼古丁单位/毫升微克。
- 这项研究的目的，EC 50值确定为1.56微克/毫升和1650微克/毫升的WS-CM和尼古丁，分别。
6.分泌的细胞因子
注意：这里列出的稀释是本研究的目的。稀释液可以相应地调整。
- 用RPMI完全培养基中加入100μl/孔在的浓度的总体积稀释的WS-CM在一个96孔板0.3，1.56，图3和5微克/毫升的相等尼古丁单元。
- 稀释烟碱至下列浓度：100，200，500，750，1000，2000和3000微克/毫升。注意：尼古丁是急性毒性和对环境有害。
- 加入100微升的PBMC悬浮于RPMI完全培养基中至每个孔1×10 6个细胞/孔的浓度。细胞加的WS-CM或尼古丁的总体积为200微升/孔。
- 覆盖板并孵育在37℃，3小时，5％的CO 2。
- 通过在300×g离心离心3分钟，吸取上清，涡旋板以板覆盖的底部，最后悬浮细胞用运行缓冲液并重复洗涤步骤一次加入200μl冰冷的洗细胞在RT。
- 添加200μl的RPMI完全培养基中，并重复该洗涤步骤一次。
- 加入200μl10微克/毫升的LPS培养基到每个孔中。
- 覆盖板并孵育4小时，24小时，48小时，或72小时，在37℃和5％的CO 2。调整保温时间是必要的。
- 离心板在300×g下3分钟。
- 取175微升上清液从每孔中并储存在冰箱中在-80℃进行测定的步骤7和8。
7.式微球分析
<OL>8.的IL-8的ELISA
- 从步骤6.10和使用中的IL-8的ELISA解冻的细胞上清液。执行ELISA测定按照制造商的说明。
9.细胞内染色和流式细胞仪
注意：这里列出的稀释是本研究的目的。稀释液可以相应地调整。
- 用RPMI完全培养基中加入100μl/孔在的浓度的总体积稀释的WS-CM在一个96孔板0.3，1.56，图3和5微克/毫升的相等尼古丁单元。
- 在相同的板，稀释烟碱至下列浓度：2，10，50，100，500，2000和4000微克/毫升。注意：尼古丁是急性毒性和环境哈萨dous。
- 加入100微升的PBMC悬浮于RPMI完全培养基中以1×10 6个细胞/孔的浓度。细胞加的WS-CM或尼古丁的总体积为200微升/孔。
- 覆盖板孵育3小时，在37℃和5％的CO 2。
- 通过在300×g离心3分钟，吸取上清，涡旋板以板覆盖的底部，最后用200微升冰冷的缓冲液重新悬浮细胞洗细胞在RT，并重复该洗涤步骤一次。
- 添加200μl的RPMI完全培养基中至板，并重复洗涤步骤一次。
- 制备的2微升/毫升GolgiPlug使用RPMI完全培养基中的工作浓度和10微克/毫升的LPS和添加200μl的各孔中。
- 孵育板6小时，在37℃和5％的CO 2。
- 在步骤9.8的端部，用运行缓冲液（4℃）和纺丝，在300洗涤细胞XG为3分钟，在4℃。
- 添加100微升Cytofix的每个孔中，孵育20分钟，在4℃。
- 如在步骤9.9，在300×g离心在4℃下描述，带有1 Permwash（4℃）下进行3分钟洗细胞3次。
- 添加45微升1×Cytoperm向每个孔中，随后用5微升以下每个抗体中的一个，每孔：TNF-α的Alexa Fluor 488，IFN-γ的V500，MIP-1α的PE。孵育在4℃下进行30分钟。
- 如步骤9.9中所述，带有1 Permwash（4℃）和一个时间与运行缓冲液（4℃）在300×g离心3分钟，在4℃下洗涤细胞两次。
- 重悬的细胞用200μl的2％多聚甲醛（4℃）的。转移细胞到12×75毫米管，和血细胞计数分析样品上的流动。注意：多聚甲醛具有腐蚀性，剧毒和健康危害。
10. K562杀灭试验
注：K562细胞应培养在培养于37℃和5％的CO 2的RPMI完全培养基中直到他们达到在测定前80％汇合。
- 通过加入18微升的DMSO至小瓶制备5mM的羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）原液。
- 用RPMI完全培养基至100μl的总体积/孔以实现所需的等尼古丁单位或尼古丁浓度为每孔稀释的WS-CM或尼古丁在96孔板中。注意：尼古丁是急性毒性和对环境有害。
- 加入100微升的PBMC的进RPMI完全培养基中以1.5×10 6个细胞/孔的浓度。细胞与WS-CM或尼古丁的总体积为200微升/孔。
- 覆盖板孵育3小时，在37℃和5％的CO 2。
- 通过加入10ml的DPBS和离心机在400×g离心在RT 8分钟洗K562细胞。
- 将细胞重悬于10毫升的DPBS和计数的K562细胞。
- 准备CFSE worki纳克溶液中加入1微升的CFSE原液至1ml DPBS。
- 加入1毫升的CFSE工作溶液到1ml含1所述的K562细胞悬浮液- 2×10 7个细胞。涡和孵化正是在室温2分钟。
- 立即加入200μlFBS的。涡和孵化正是在室温2分钟。
- 加入10 mL RPMI完全培养基中，离心反应管，在400×g离心在RT 8分钟。
- 除去上清液的RPMI并打破颗粒和重悬细胞，用10ml RPMI完全培养基中，计数的CFSE标记的K562细胞。
- 通过离心板在300×g离心3分钟，在RT下洗涤的PBMC。通过倾析将液体吸出上清液。重新装上盖子，涡旋盘的底部。添加200μl的RPMI完全培养基中，并重复洗涤步骤一次。
- 添加CFSE标记的K562细胞以1:15的比率：向PBMC板和后续的i的每个样品井（100,000 K562s 1.5×10 6个PBMC中）ncubate 5小时，在37℃和5％的CO 2。
- 通过在300×g离心离心3分钟，在RT下洗涤细胞混合。通过丢弃该液体吸出上清液。放置在盖和旋涡振荡板的底部。
- 添加200μl的运行缓冲液，并重复在步骤10.14一次描述的洗涤步骤。
- 添加95微升缓冲液中，然后用5微升7AAD每孔100微升的总体积/孔。孵育板在黑暗中在RT下15分钟。
- 加入100微升缓冲液到每个孔中，并从板到集群管的每个孔中转移细胞悬浮液的整个体积，并获得对流动的样品仪。
- 确定使用流式细胞分析软件7AAD阳性和CFSE阳性细胞的百分比。
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Representative Results
结果以均数±标准平均（4供体样品）的错误。使用Excel软件以及t-检验对比进行与其对应的控制各处理，进行处理和未处理的对照样品之间的学生氏t检验。的统计学显着性指示的：*，P <0.05; **，P <0.005; *** P <0.0005。
来测量暴露于WS-CM和尼古丁的影响，外周血单个核细胞分别用不同浓度的WS-CM和尼古丁3小时或24小时。细胞死亡是由坚固和可靠的7AAD染色法测定，7AAD插层成双链核酸和能穿透垂死或死亡的细胞16的细胞膜。剂量依赖性增加的细胞死亡，观察使用WS-CM在24小时后，与在相等尼古丁单元（ 图1A）4微克/毫升检测到邻近的80％的细胞死亡。细胞死亡的可比度注意到仅在3000微克/ ml的烟碱（ 图1B）。由于我们暴露的PBMC 3小时使用WS-CM和尼古丁来评估细胞因子诱导和能力杀死靶细胞的作用，有必要确定的WS-CM是否导致以下3个小时的治疗显著细胞毒性。的PBMC用5微克/毫升的WS-CM相等尼古丁单位治疗没有经历显著毒性（<5％; 图1A）。治疗与烟碱3小时仅在2000微克/毫升（ 图1B）所引起可测量的（8％）的细胞死亡。因此，暴露于WS-CM或尼古丁在所指示的剂量和治疗周期未在实验条件下导致显著细胞毒性。
以测量的免疫调节作用，刺激PBMC用LPS对不同的时间段，并且分泌的细胞因子是由CBA测定法测量。为了优化LPS刺激的时候，我们接触到的PBMC LPS刺激4小时，24小时，48小时和72小时，并分泌细胞因子测定。例如，LPS刺激24小时，得到的细胞因子的IL-6和IL-8（ 图2）的最大分泌，和更长的时间内没有导致进一步增加（IL-6）或降低（IL-8）中的细胞因子分泌。类似的结果与其它分泌细胞因子如IL-10，IL-1β和TNF-α的获得（数据未显示）。
试验时间过程实验表明最大生产细胞因子的应答到TLR-4刺激脂多糖发生了24小时，并因此，分泌的细胞因子测定在24小时内所有后续实验。治疗使用WS-CM和尼古丁，随后的TLR-4受体LPS刺激，导致分泌的细胞因子（ 图3）的剂量依赖性降低。治疗使用WS-CM导致的IFN-γ深刻下降（ 图3A），肿瘤坏死因子（ 图3B），IL-10（图3C </强>）和IL-6（ 图3D），在低的等尼古丁单元（1.56微克/毫升）。抑制细胞因子也很明显与尼古丁。然而，细胞因子与尼古丁的抑制发生在显著较高剂量，而抑制的程度不同个体的细胞因子之一。例如，IFN-γ的似乎是显著与尼古丁在50微克/ ml的抑制，而IL-6被压制在最高浓度（4毫克/毫升）测试（Figurie 3D）。下一步，我们测量的IL-8水平用ELISA测定相同样品中。 IL-8的分泌有效的WS-CM-暴露的PBMC抑制;而尼古丁的抑制效应显著为2毫克/毫升（ 图4）。
在刺激后的细胞内细胞因子的水平进行定量的WS-CM-和尼古丁处理的细胞用LPS。先前我们刺激的PBMC 3天，最后6小时温育的过程中加入Golgiplug测量细胞内细胞因子14。我们现在显著减少潜伏期通过结合LPS刺激和高尔基插头共6小时，并测量细胞内细胞因子阳性细胞（ 图5）。图5示出的IFN-γ阳性细胞的剂量依赖性降低百分比（ 图5A），TNF-α阳性两种尼古丁和WS-CM-细胞（ 图5B）暴露的PBMC，而在MIP-1α阳性细胞以剂量依赖的减少百分比（ 图5C）溶液中观察到的WS-CM -exposed外周血单个核细胞。在该测定中，我们观察到的暴露的WS-CM在较低的等尼古丁单元（1.56微克/毫升）后在细胞内细胞因子阳性细胞的数目减少。既分泌细胞因子和细胞内细胞因子分析表明在IFN-γ的水平或IFN-γ阳性细胞的条件相似的结果。
作为功能的措施，对WS-CM-和烟碱的能力治疗外周血单个核细胞，以杀伤靶细胞K562确定。 图6A描绘了代表流式细胞仪的原始的目标7AAD阳性染色数据（CFSE标记的K562）细胞杀伤了控制，WS-CM-曝光，烟碱治疗外周血单个核细胞。在框中的数字表示百分之7AAD阳性CFSE标记的K562细胞。暴露于1.56微克/毫升的WS-CM显著降低的效应细胞的杀伤能力中的PBMC与控制和更低的剂量进行比较。在低和高剂量的烟碱治疗不干扰的细胞杀死。 图6B示出以剂量依赖性降低百分比的K562细胞中的单个实验中杀死来自多个供体。
的PBMC暴露于增加的WS-CM（微克/毫升）和烟碱（微克/毫升）的相等单位尼古丁浓度之后，图1，细胞死亡。 （A）和与尼古丁3小时和24小时（B）。细胞死亡是由7AAD染色测量。各点代表4供体的代表性实验的平均值±标准差误差线。统计显着性由表示：* P <0.05; ** P <0.005，*** P <0.0005。
图2.分泌的IL-6和IL-8的由PBMC中在不同时间点用LPS刺激。刺激PBMC用LPS进行4小时，24小时，48小时和72小时。使用IL-6和IL-8的细胞因子的细胞培养物上清液的水平进行了测定人类炎性细胞因子试剂盒（CBA试剂盒）和流式细胞术。这些数据代表从使用来自三个不同供体的PBMC的两个独立实验中的一个的平均值±标准差误差线。统计SIgnificance以表示：* P <0.05; ** P <0.005。
通过用增加的WS-CM（微克/毫升）和烟碱（微克/毫升）的等尼古丁单位以下LPS刺激浓度处理的PBMC图3.减少细胞因子的分泌。PBMC中暴露于不同浓度的WS-CM和尼古丁3小时，用LPS刺激24小时。 IFN-γ（A） 的水平，肿瘤坏死因子（B）中，IL-10（C）和IL-6（D）的细胞因子的细胞培养物上清液用Th1 / Th2细胞CBA测定和流式细胞仪进行了测定。这个数据代表使用来自四个不同供体的PBMC的三个独立实验中的一个的平均值±标准差误差线。统计显着性由表示：* P <0.05; ** P <0.005; *** P <0.0005。高CON的WS-CM centrations也与*** P <0.0005统计学显著。
图4.衰减的IL-8分泌的由PBMC中与增加的WS-CM（微克/毫升）和烟碱（微克/毫升）的等尼古丁单位以下LPS刺激的浓度进行处理。将PBMC暴露于WS-CM和尼古丁，用LPS刺激24小时，并分泌的IL-8用ELISA法测定。这些数据代表从使用来自四个不同供体的PBMC的三个独立实验中的一个的平均值±标准差误差线。统计显着性由表示：* P <0.05; ** P <0.005; *** P <0.0005。较高浓度的WS-CM也与*** P <0.0005统计学显著。
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图5.还原细胞内细胞因子阳性细胞的结合增加的WS-CM（微克/毫升）和烟碱（微克/毫升）的等尼古丁浓度的单位处理的PBMC。的PBMC暴露于不同浓度的WS-CM和尼古丁3小时，用LPS刺激和Golgiplug 6小时。为WS-CM和尼古丁的车辆控制是RPMI完全培养基。胞内IFN-γ阳性（A）中，TNF-α阳性（B）和MIP-1α阳性的（C）的细胞，通过流式细胞仪定量。这些数据代表从使用来自四个不同供体的PBMC的四个独立实验中的一个的平均值±标准差误差线。统计显着性由表示：* P <0.05; ** P <0.005; *** P <0.0005。较高浓度的WS-CM也与*** P <0.0005统计学显著。
图6.还原的PBMC靶的杀伤能力与暴露于增加的WS-CM（微克/毫升）和烟碱（微克/毫升）的等烟碱单位的浓度。将PBMC与WS-CM指定浓度和尼古丁为3处理小时，CFSE标记的K562细胞中，然后加入作为靶细胞，并孵育另外5小时。细胞用7AAD和流式细胞仪是用来衡量查杀能力。 图6A显示代表流式细胞仪门控箱所示％的杀灭效果。箭头表示减少百分之杀灭暴露1.56微克/毫升的WS-CM。 图6B示出了从使用来自四个不同供体的PBMC四个独立实验代表性的平均值±标准差误差线。统计意义是由表示：** P <0.005; *** P <0.0005。较高浓度的WS-CM也统计学显著机智^ h *** P <0.0005。
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Discussion
我们和其他人已经证实了外周血单个核细胞治疗用的TPP的抑制几种反应，包括表达和细胞因子和功能性的措施，如靶细胞杀死14的分泌。在以前的工作中描述的实验方法需要更长的潜伏期并且是温和的幅度14。鉴于这种诱人的体外模型的潜在应用基础研究和应用研究，我们调查是否有任何在这些多步生物分析测定的参数可以优化。在这里，我们提出了简化的方法来衡量使用TPP处理体外 PBMC模型TLR介导的免疫反应。
可行的外周血单个核细胞的分离是这些体外实验的关键要求。鉴于潜在的捐助者的个体差异和生理状态，它是理想的外周血单个核细胞获得是有求必应。这项研究的目的，我们孤立使用先前公布的方法，一般15健康成人受试者ð外周血单个核细胞。此外，在这项研究中，以尽量减少捐助者之间的变异，我们排除了那些有过敏，感染，或谁是服用任何处方或以上的处方药，如阿司匹林。另外，从新鲜收集的血液分离的PBMC的是理想的，因为它可以确保最佳活力和细胞在随后的实验中的功能性。
利用刺激TLR激动剂为67-72 h上的方法来测量细胞内细胞因子和分泌的细胞因子14。在TLR刺激的细胞的时间 - 过程的细胞因子的分泌（控制条件没有WS-CM或尼古丁下）建议最大分泌发生在24小时左右。此外，我们结合的TLR激动剂和Golgiplug孵育和孵化的时间减少到总共6小时测量细胞内细胞因子。而这需要一个单独的试验来测量细胞因子阳性细胞，与以前的方法相比，14的数据是更加健壮。一致与以前的结果，WS-CM强烈抑制细胞内和细胞分泌的细胞因子的诱导。因此，这些修改导致大幅减少分析时间，并取得了非常类似的结果与在文献中描述。虽然我们已经利用流式细胞仪和ELISA的方法来评估细胞因子的水平，例如实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR的）其他技术也可以用作互补技术。
从历史上看，靶细胞杀害利用放射性方法（ 例如 ，51铬释放法）效应外周血单个核细胞。本报告中所描述的方法避免了使用放射性的，并采用加载细胞用荧光染料，其存在可以通过流式细胞仪进行监测。本文所描述的方法的另一个优点是，它是相对快速并可能adapted可高通量检测。由于目标与效应细胞的潜伏期为5小时，此法可在8小时内完成。这在对比与其他公开的方法，因为它们需要PBMC和激活/刺激的亚型隔离一段数天，这是更复杂的，或NK细胞和K562细胞的结合物的分析以监测细胞毒性17,18。当前方法的另一个优点是，它直接使用冷冻保存的PBMC作为效应细胞，其能提供更大的灵活性。
总之，我们描述了几个试验，以确定在可燃TPP处理的PBMC的TLR介导的免疫反应，这可以容易地应用于用于测试不同的化合物的效果。使用冷冻保存的组件允许显著灵活性，并连同建立的技术，如流式细胞仪，CBA测定法，以及酶联免疫吸附，健壮和一致的结果，可以快速地在不同的实验室获得礼拜堂。
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Acknowledgments
这项工作是由雷诺烟草公司（RJRT）根据与维克森林大学医学院的合作研究协议投资。 GL Prasad是RJRT的全职员工。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
