Abstract
Parmi les autres modifications physiopathologiques, l'exposition chronique à la fumée de cigarette provoque une inflammation et une suppression immunitaire, qui ont été liés à une sensibilité accrue des fumeurs à des infections microbiennes et l'incidence des tumeurs. Ex vivo suppression des réponses immunitaires médiés par les récepteurs dans les cellules mononucléaires périphériques humaines du sang (PBMC) traité avec constituants de la fumée est une approche intéressante pour étudier les mécanismes et d'évaluer les effets probables à long terme de l'exposition aux produits du tabac. Ici, nous avons optimisé méthodes pour effectuer des dosages ex vivo en utilisant des PBMC stimulés par un lipopolysaccharide bactérien, un récepteur de ligand-4 de type Toll. Les effets de milieu de la fumée conditionné ensemble (WS-CM), une préparation de produits du tabac combustible (TPP), et la nicotine ont été étudiés sur la sécrétion de cytokines et de destruction des cellules cible par les PBMC dans les tests ex vivo. Nous montrons que des cytokines sécrétées IFN-γ, le TNF, l'IL-10, IL-6 et IL-8 et des cytokines intracellulaires IFN47 ;, TNF-α, MIP-1α et ont été supprimées dans les CMSP WS-CM-exposées. La fonction cytolytique des PBMC effectrices, telle que déterminée par un dosage de cellules cibles K562 tuant a également été réduite par exposition à WS-CM; la nicotine est très peu efficace dans ces essais. En résumé, nous présentons un ensemble de tests améliorés pour évaluer les effets du PPT en essais ex vivo, et ces méthodes pourraient être facilement adaptés pour tester d'autres produits d'intérêt.
Introduction
Un ensemble considérable de points de connaissances sur les effets néfastes sur la santé du tabagisme chronique, notamment les maladies cardiovasculaires (MCV), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et le cancer 1,2. Chronique tabagisme a été connu pour causer l'inflammation et l'immunosuppression, et ces modifications sont signalés à contribuer à un risque accru d'infection microbienne et le cancer chez les fumeurs 3. In vitro et ex vivo techniques sont utiles pour élucider la base moléculaire des effets physiopathologiques de la fumée de cigarette 4-9 (tableau 1) et sont reconnus comme des outils importants pour guider la réglementation émergent de différents produits du tabac 10,11.
Par exemple, nous avons démontré que les préparatifs combustibles de produits du tabac (PPT) comme milieu complet de fumée conditionné (WS-CM) et la matière particulaire totale (TPM) sont beaucoup plus cytotoxique et dommageable pourADN que PPT non combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l'ouvrage publié, il a été récemment rapporté que PPT combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l'ouvrage publié, nous avons récemment signalé que PPT combustibles causés immunosuppression marquée. Ceci a été démontré par la suppression de Toll Like Receptor (TLR) -ligands, stimulé la sécrétion de cytokines, et la cellule ciblée (K562) tuer par les PBMC dans un modèle ex vivo 14. Étant donné l'importance de l'inflammation dans les processus de la maladie induite fumée cigarettes, poursuite de l'optimisation des conditions d'essai pour évaluer les effets immunomodulateurs de la fumée de cigarette est présenté dans ce rapport.
Les essais ex vivo typiquement mesurés et intracellulaire des cytokines ainsi que la fonction cytolytique de cellules NK et T cytotoxiques dans la cellule K562 tuant des dosages 14 sécrétées. Les dosages impliqués pré-incubation avec WS-CM et la nicotine et la stimulation ultérieure de PBMCs avec agonistes de TLR pendant une période de 3 jours; les lectures finales sont effectuées en utilisant des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) et / ou la cytométrie de flux. Nous avons utilisé le lipopolysaccharide bactérien (LPS), qui se lie à des récepteurs TLR-4 stimule les PBMC et conduisant à la production de cytokines intracellulaires et la sécrétion de cytokines. En plus de l'optimisation des différentes étapes essai pour l'évaluation des effets immunomodulateurs de PPT, nous avons également présents procédés pour isoler les PBMC, des dosages de mort cellulaire et de l'IL-8 quantification. Ces méthodes peuvent être appliquées pour aborder d'autres questions de recherche et affinés pour évaluer les produits du tabac dans le contexte réglementaire.
Tableau 1. Publié rapports de in vitro et ex vivo méthodes utilisées pour étudier les effets physiopathologiques Varilux de préparations de produits du tabac CS, le milieu de la fumée de cigarette. SCC, la fumée de cigarette condensat; CST, cigarette extrait de fumée; ELISA, enzyme dosage immunoenzymatique; GADPH, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; qPCR, réaction quantitative en chaîne par polymérase; RT en temps réel réaction en chaîne par polymérase quantitative; TS, la fumée de tabac.
| Auteur (Année de l'étude) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Les cellules utilisées | Cellules bronchiques humaines de l'endothélium (BEAS-2B), les neutrophiles humains | Cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549) | Les cellules musculaires lisses des voies respiratoires humaines (HASMC) | Cellules U937 prémonocytique humaines, des monocytes humains | Alvéolaires de type II cellules épithéliales (ATII) | Monocytaire humainelignée cellulaire (THP-1), les macrophages pulmonaires humaines |
| TPP utilisé | CST | SCC | CST | TS | CST | CS |
| Méthode utilisée | ELISA, qPCR, la migration, l'électromobilité changement | Immuno-chimie, électrophorèse, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, PCR quantitative, l'électrophorèse | Gel-décalage de mobilité | La microscopie optique, la microscopie électronique, l'électrophorèse, ELISA | qPCR, ELISA, kit E-TOXATE (Sigma), plaque de p65 dosage (TransAM), électrophorèse, diverses trousses d'immunoessais |
| Mesure | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migration | histones acétyltransférases, les histones désacétylases, NF-kB, IL-8, pI-kB α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, l'éotaxine | Heat Shock / protéines de stress (HSP / Hsp70), HF facteur de transcription NF-kB,TNF-α | Protéine tensioactif (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, le TNF-α, IL-1β, l'IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, α-MIP1, GRO-α, MAPK / JNK / phosphorylation de ERK, cJun: liaison à l'ADN, le glutathion, p65: liaison à l'ADN |
| Résultat final | CST régule à la baisse la production de cytokines par la suppression de l'AP-1 activation. | H 2 O 2 et SCC améliorer acétylation des histones, diminuer l'activité histone déacétylase, différentielle régulent la libération de cytokines pro-inflammatoires. | La fumée de cigarette peut causer la libération d'IL-8 de HASMC, renforcée par le TNF-α, 20% moins CST IL-8 libération, inhibition de l'éotaxine et RANTES par la fumée de cigarette. | TS HF activés facteur de transcription qui a été associée à la surexpression de la Hsp70 et l'inhibition de l'activité NFkB et de TNF-α libération de liaison. | Réduction ATII niveaux de chimiokines dérivées de cellules compromis alveolar réparation, contribuant à la cigarette induit fumée lésions alvéolaires et l'emphysème. | Données fournissent explication mécaniste pour les infections respiratoires pourquoi les fumeurs ont augmenté. Suppression de la réponse innée se accompagne d'une augmentation de l'IL-8. |
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Protocol
NOTE: le consentement éclairé de faire cette étude a été obtenue à une unité clinique locale de recherche sous approbation de l'IRB, par les bonnes pratiques cliniques. Traitement du sang, l'isolement des PBMC et d'autres expériences de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles, l'utilisation de consommables et réactifs microbiologiquement stérile.
1. Préparation WS-CM
- Générer WS-CM comme décrit précédemment 12.
- Préparer WS-CM en passant la fumée de quatre 3R4F cigarettes de référence grâce à Roswell Park Institute Memorial (RPMI) 1640 milieu sans rouge de phénol, avec un schéma de fumer suivante: 35-60-2, volume de bouffée en ml, intervalle entre chaque bouffée en sec, et la durée feuilletée en sec, respectivement. Chaque préparation génère un échantillon de 20 ml.
- tube (s) de l'étiquette avec la date, l'heure d'achèvement, et le nom et le numéro de cigarette. Conserver les 500 ul aliquotes à -80 ° C immédiatement après le tabagisme est terminée.
- Analyser aliquotes de WS congelés-CM Pour déterminer les niveaux de nicotine, les nitrosamines spécifiques du tabac, et les hydrocarbures aromatiques polycycliques comme décrit précédemment 12.
2. Isolement de PBMC
- Prélever le sang frais provenant de donneurs sains (qui sont des non-consommateurs de produits du tabac) Isoler PBMC de sang frais comme décrit ci-dessous sous une approbation distincte du Wake Forest Baptist Health CISR 15.
- Avant l'arrivée de la poche de sang, une bouteille de 500 ml, des ciseaux, un tampon d'isolement et tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (DPBS) (RT) prêt à un niveau de biosécurité 2 (BSL-2) culture de cellules capot. tampon d'isolement doit être protégé de la lumière.
- Tenir le sac de sang à l'envers et couper le tube juste au-dessous où il a été serré laissant au moins 3 cm de tube.
- Retirez le bouchon de la bouteille de 500 ml et de maintenir le tube dessus de l'ouverture de la bouteille. Ramassez le sac de sang et l'inverser pour permettre au sang de circuler librement dans le sac dans til bouteille jusqu'à ce que le sac est vide. Laisser le sang de circuler sur le mur intérieur de la bouteille vers le bas par rapport à éviter la formation de bulles.
- Verser le tampon d'isolement dans la bouteille à un rapport de 1: 5 de tampon d'isolement de sang. Boucher le flacon et inverser doucement, fin-over-end, 10 fois. Laisser le flacon dans la hotte de culture de cellules à incuber avec des lumières, pour une heure à température ambiante.
- Une couche de lumière, couleur paille va construire au-dessus du sang. Enlever cette couche à l'aide d'un 25 ml pipette sérologique dans 50 ml tubes coniques. Le montant perçu peut varier de 50 à 300 ml, en fonction du sujet qui a fait don de sang.
- Centrifuger les tubes à 200 xg pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant translucide, laissant le sang-pastille de couleur sombre. Le culot sera en vrac, mais visqueux.
- Pipette 3 ml de tampon d'isolement dans 15 ml tubes coniques.
- Pour remettre en suspension le culot, ajouter 20 ml de DPBS pour tous les 50 ml de liquide de couleur paille recueillies dans sTep 2.1.5. Vortex pour bien mélanger, et de consolider le liquide remis en suspension à partir de tubes multiples. Ce liquide contient en suspension des cellules sanguines.
- Avec une pipette de transfert, le transfert de 5 ml de globules en suspension sur 3 ml de tampon d'isolement dans l'étape 2.1.8. Incliner le tube conique de 15 ml contenant la suspension de cellules doucement et lentement pour créer deux couches séparées. Centrifuger les tubes à 400 xg pendant 40 min à température ambiante avec une accélération minimale et sans frein.
- Utilisez une pipette de transfert pour enlever la couche résultant trouble du milieu (buffy coat) contenant PBMC dans un tube conique de 50 ml. Éviter de tirer d'autres couches claires en dessous. Transfert pas plus de 25 ml dans chaque 50 ml tube conique.
- Ajouter 25 ml de tampon froide (ou plus pour remplir la totalité du volume restant de la 50 ml tube conique) pour laver les cellules. Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Reprendre le culot avec 10 ml de tampon en cours d'exécution. Celui-ci contient des PBMC. Compter les cellules et utiliser immédiatement ou placer sur la glace pour la congélation.
3. congélation et la décongélation de la CMSP
- Centrifugeuse les PBMC qui ont été recueillies à l'étape 2.1.13 pendant 10 min à 400 x g.
- Remplir le récipient de congélation avec de l'alcool isopropylique selon les instructions du fabricant. ATTENTION: L'alcool isopropylique est inflammable et très toxique.
- Remettre en suspension le culot avec du milieu RPMI 1640 (4 ° C) contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS) et 10% de sulfoxyde de diméthyle (DMSO). Ce est un milieu RPMI 1640 de congélation. Reprendre le culot avec une quantité de milieu de congélation qui se traduira par une suspension ayant environ 5 x 10 7 cellules / ml. Le nombre de cellules disponibles pour la congélation peut varier.
- Distribuer des aliquotes de 1 ml de suspension de cellules dans des cryotubes de 2 ml et placer les cryotubes dans le récipient de congélation. Placer le récipient de congélation avec cryotubes dans un congélateur à -80 ° C pour stocker O / N puis retirez les cryotubes et transfert à stocker dans unCongélateur cryogénique entre -150 ° C à -190 ° C.
- Retirer le cryotube de stockage cryogénique et décongeler rapidement sous agitation douce dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Transférer immédiatement les PBMC décongelées dans le cryotube dans un tube conique de 15 ml avec 10 ml du milieu RPMI 1640 complet (4 ° C) contenant 10% de FBS, 1% de Pen / Strep et 1% de L-glutamine. Le contenu du cryotube décongelés doivent être transférés dès que possible pour obtenir la viabilité cellulaire maximale 15.
- Centrifuger les PBMC à 400 xg pendant 10 min.
- Reprendre le culot avec 5 ml du milieu RPMI 1640 complet et compter les cellules.
- Mesurer la viabilité des cellules par des méthodes établies, telles que la méthode d'exclusion au bleu trypan. Généralement, la viabilité des cellules avec cette méthode est d'environ 90 - 95%. Les PBMC sont maintenant prêts à utiliser dans des expériences.
Mort cellulaire 4. Détermination
NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette study. Les dilutions peuvent être modifiés en conséquence.
- Diluer WS-CM nicotine ou dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits, comme indiqué ci-dessous.
- Diluer WS-CM aux concentrations suivantes: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, et 5 pg / ml d'unités d'équi-nicotine (sur la base de la teneur en nicotine dans WS-CM) 12.
- Diluer nicotine dans du milieu RPMI aux concentrations suivantes: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, et 3000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l'environnement.
- Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à chaque puits à une concentration de 1 x 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits.
- Aux fins de cette étude, préparer deux jeux de plaques comme ci-dessus. Couvrir les plaques et incuber une plaque pendant 24 heures et une plaque pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Ajuster les points de temps que nécessaire. Laver les cellules à la température ambiante par centrifugation à 300 g pendant 3 min, l'aspiration du surnageant, vortexer le fond de la plaque à plaque recouverte et finalement remise en suspension les cellules avec 200 ul de tampon de migration du froid de la glace, et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
- Ajouter 95 ul de tampon suivie par 5 ul de 7-aminoactinomycine D (7AAD) à chaque puits pour un volume total de 100 ul / puits en cours d'exécution. Incuber la plaque à l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter 100 pi de tampon pour courir tubes de munitions. Transférer tout le volume de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à tubes de munitions et d'acquérir les échantillons sur cytomètre de flux.
- Déterminer le pourcentage de cellules 7AAD positif en utilisant la cytométrie de flux logiciel d'analyse.
5. CE 50 Détermination
- Les valeurs de CE 50 de WS-CM et la nicotine sont déterminées par 7AAD-coloration positive des PBMC.
- La valeur EC 50 est définie comme la concntration à laquelle 50% des cellules ne était plus viable dans un dosage de 24 heures, et les valeurs sont exprimées en pg d'équi-nicotine unités / ml.
- Pour les fins de cette étude, les valeurs CE 50 ont été jugées 1,56 pg / ml et 1 650 pg / ml pour WS-CM et la nicotine, respectivement.
6. cytokines sécrétées
NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustés en conséquence.
- Diluer WS-CM dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 ug / ml d'unités d'équi-nicotine.
- Diluer nicotine pour les concentrations suivantes: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, et 3000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l'environnement.
- Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à chaque puits à une concentration de 1 x 10 6 cellules / puits.Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits.
- Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Laver les cellules par centrifugation à la température ambiante à 300 x g pendant 3 min, aspiration du surnageant, le vortex inférieure de la plaque à plaque recouverte et finalement les cellules en suspension avec 200 ul de la glace froide courante tampon et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
- Ajouter 200 ul de milieu RPMI complet, et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
- Ajouter 200 ul de 10 ug / ml de LPS milieu à chaque puits.
- Couvrir la plaque et incuber pendant 4 h, 24 h, 48 h, 72 h ou à 37 ° C et 5% de CO 2. Régler des temps d'incubation nécessaire.
- Centrifuger la plaque à 300 g pendant 3 min.
- Prenez 175 pi de surnageant de chaque puits et de stocker dans un congélateur à -80 ° C pour effectuer les tests dans les étapes 7 et 8.
7. cytométrie Bead Assay tableau
<ol>8. ELISA IL-8
- Décongeler les surnageants de cellules de l'étape 6.10 et l'utilisation dans l'IL-8 ELISA. Effectuer le test ELISA selon les instructions du fabricant.
9. intracellulaire coloration et cytométrie de flux
NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustés en conséquence.
- Diluer WS-CM dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 ug / ml d'unités d'équi-nicotine.
- De la même plaque, diluer la nicotine aux concentrations suivantes: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, et 4000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et Hazar environnementdous.
- Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à une concentration de 1 × 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits.
- Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Laver les cellules à la température ambiante par centrifugation à 300 x g pendant 3 min, l'aspiration du surnageant, vortexer le fond de la plaque à plaque recouverte et finalement remise en suspension les cellules avec 200 ul de tampon de migration du froid de la glace, et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
- Ajouter 200 pi de milieu RPMI complet à la plaque, et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
- Préparer les concentrations de travail de 2 ul / ml GolgiPlug et 10 ug / ml de LPS en utilisant un milieu RPMI complet et ajouter 200 ul dans chaque puits.
- Incuber la plaque pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- A la fin de l'étape 9.8, laver les cellules avec un tampon en cours d'exécution (4 ° C) et tournant à 300g pendant 3 min à 4 ° C.
- Ajouter 100 ul de Cytofix à chaque puits et incuber pendant 20 min à 4 ° C.
- Laver les cellules trois fois comme décrit dans l'étape 9.9 avec 1x Permwash (4 ° C) à 300 g pendant 3 min à 4 ° C.
- Ajouter 45 ul de 1 x Cytoperm à chaque puits suivi par 5 ul de chacun de l'un des anticorps suivants dans chaque puits: TNF-α-Alexa Fluor 488, l'IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incuber à 4 ° C pendant 30 min.
- Laver les cellules deux fois comme décrit à l'étape 9.9 avec 1x Permwash (4 ° C) et une fois avec du tampon (4 ° C) fonctionnant à 300 x g pendant 3 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules avec 200 pi de paraformaldehyde à 2% (4 ° C). Transférer les cellules dans 12 × 75 mm tubes, et analyser les échantillons sur cytomètre de flux. ATTENTION: Paraformaldéhyde est corrosive, très toxique et dangereux pour la santé.
10. K562 Assay Tuer
REMARQUE: les cellules K562 doivent être cultivéesen culture à 37 ° C et 5% de CO 2 avec un milieu RPMI complet jusqu'à ce qu'elles atteignent 80% de confluence avant l'essai.
- Préparer une solution 5 mM carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) du stock en ajoutant 18 pi de DMSO dans le flacon.
- Diluer WS-CM nicotine ou dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits pour atteindre les unités d'équi-nicotine ou les concentrations souhaitées de nicotine pour chaque puits. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l'environnement.
- Ajouter 100 ul de PBMC dans un milieu RPMI complet à une concentration de 1,5 x 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules avec ou WS-CM nicotine sera de 200 pl / puits.
- Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Laver les cellules K562 en ajoutant 10 ml de DPBS et centrifuger à 400 g pendant 8 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de DPBS et compter les cellules K562.
- Préparer CFSE working solution en ajoutant 1 pl de CFSE solution stock à 1 ml DPBS.
- Ajouter 1 ml de la solution de travail CFSE à 1 ml de la suspension de cellules K562 contenant 1 à 2 x 10 7 cellules. Vortexer et incuber pendant exactement 2 minutes à température ambiante.
- Immédiatement ajouter 200 pi de FBS. Vortexer et incuber pendant exactement 2 minutes à température ambiante.
- Ajouter 10 ml de milieu RPMI complet et centrifuger le tube à 400 g pendant 8 min à température ambiante.
- Eliminer le surnageant RPMI et de briser le culot et remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu RPMI complet et compter les cellules K562 CFSE-étiquetés.
- Laver les PBMC par centrifugation de la plaque à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant par décantation le liquide. Replacer le couvercle et Vortex bas de la plaque. Ajouter 200 ul de milieu RPMI complet et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
- Ajouter des cellules K562 marquées au CFSE dans un rapport de 1:15 (100,000 K562s: 1,5 x 10 6 CMSP) à chaque puits d'échantillon de la plaque et en outre i PBMCncubate pendant 5 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Laver le mélange de cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant en éliminant le liquide. Placer le couvercle et vortexer le bas de la plaque.
- Ajouter 200 ul de tampon de migration et répéter l'étape de lavage décrit dans l'étape 10,14 une fois de plus.
- Ajouter 95 ul de tampon de migration suivi par 5 ul de 7AAD à chaque puits pour un volume total de 100 pl / puits. Incuber la plaque à l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter 100 ul de tampon en cours d'exécution à chaque puits et transférer la totalité du volume de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à tubes de munitions et d'acquérir les échantillons sur cytomètre de flux.
- Déterminer le pourcentage de cellules positives et 7AAD CFSE-positifs en utilisant la cytométrie de flux logiciel d'analyse.
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Representative Results
Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (quatre échantillons de donneurs). T-test de Student entre les échantillons de contrôle traités et non traités a été réalisée en utilisant le logiciel Excel ainsi que des comparaisons t-test pour tous les traitements avec leurs contrôles correspondants. La signification statistique est indiquée par: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
Pour mesurer l'effet de l'exposition à WS-CM et la nicotine, les CMSP ont été traitées avec différentes concentrations de WS-CM et la nicotine pour 3 h ou 24 h. La mort cellulaire a été mesurée par la méthode 7AAD coloration robuste et fiable, que se intercale 7AAD dans des acides nucléiques double brin et peut pénétrer les membranes cellulaires de cellules mourantes ou mortes 16. Une augmentation dose-dépendante de la mort cellulaire a été observée avec WS-CM à 24 h, avec une mort cellulaire de 80% à près de quatre détecté pg / ml d'unités d'équi-nicotine (figure 1A). Un degré comparable de la mort cellulaire étaitnoté seulement à 3,000 ug / ml de nicotine (figure 1B). Depuis que nous avons exposés PBMC pendant 3 heures avec WS-CM et la nicotine afin d'évaluer leur effet de l'induction de cytokines et la capacité de tuer les cellules cibles, il était nécessaire de déterminer si WS-CM provoque une cytotoxicité significative suivante 3 traitement h. PBMC traités avec 5 ug / ml d'unités de WS-CM equi-nicotine n'a pas connu une toxicité significative (<5%; Figure 1A). Le traitement par la nicotine pendant 3 heures a causé la mort mesurable (8%) de cellules seulement à 2000 pg / ml (figure 1B). Ainsi, l'exposition à WS-CM ou de la nicotine aux doses indiquées et périodes de traitement n'a pas entraîné une cytotoxicité significative dans les conditions expérimentales.
Pour mesurer les effets immunomodulateurs, CMSP ont été stimulées avec LPS pour des périodes différentes, et les cytokines sécrétées ont été mesurées par le dosage de l'ABC. Pour optimiser le temps de stimulation LPS, nous avons exposé PBMC au LPS stimulation pendant 4 heures, 24 h, 48 h et 72 h, et les cytokines sécrétées ont été mesurés. Par exemple, stimulation par le LPS pendant 24 heures a donné une sécrétion maximale des cytokines IL-6 et IL-8 (figure 2), et des périodes de temps prolongées n'a pas abouti à de nouvelles augmentations (IL-6) ou diminutions (IL-8) en cytokine sécrétion. Des résultats similaires ont été obtenus avec d'autres cytokines sécrétées telles que IL-10, IL-1β et TNF-α (données non présentées).
Les expériences pilotes cours du temps suggéré que la production maximale de cytokines dans les réponses au TLR-4 stimulation par LPS se produit par 24 heures, et donc, cytokines sécrétées ont été mesurées à 24 h dans toutes les expériences ultérieures. Le traitement avec WS-CM et de la nicotine, suivie par la stimulation des récepteurs TLR-4 avec LPS, a entraîné une diminution dose-dépendante de cytokines sécrétées (figure 3). Le traitement avec WS-CM a entraîné une diminution profondes de l'IFN-γ (Figure 3A), du TNF (figure 3B), l'IL-10 (Figure 3C </ Strong>) et IL-6 (Figure 3D) dans les unités de nicotine equi-bas (1,56 ug / ml). Suppression de cytokines était également évident avec la nicotine. Cependant, la suppression de cytokines avec la nicotine se est produite à des doses significativement plus élevés, et le degré de suppression variait cytokines individuelles. Par exemple, l'IFN-γ a semblé être significativement supprimée par la nicotine à 50 ug / ml, alors que l'IL-6 a été supprimée à la concentration la plus élevée (4 mg / ml) testé (Figurie 3D). Ensuite, nous avons mesuré les niveaux d'IL-8 dans les mêmes échantillons en utilisant un dosage ELISA. IL-8 a été effectivement supprimé la sécrétion dans les CMSP WS-CM-exposées; tandis que les effets suppresseurs de la nicotine étaient significatives à 2 mg / ml (Figure 4).
Les niveaux de cytokines intracellulaires ont été quantifiés dans WS-CM et les cellules de nicotine traités lors de la stimulation par le LPS. Auparavant, nous CMSP stimulées pendant 3 jours et ajouté Golgiplug au cours de la dernière 6 heures d'incubation à mesurercytokines intracellulaires 14. Nous maintenant réduit significativement la période d'incubation en combinant la stimulation avec LPS et bouchon de Golgi à un total de six heures et mesuré cellules de cytokines-positives intracellulaires (figure 5). La figure 5 illustre une réduction dose-dépendante pour cent dans les cellules IFN-γ-positive ( La figure 5A), les cellules (figure 5b) à la fois dans Nicotine et WS-CM- TNF-α-positif exposée PBMC, tandis qu'un pour cent de réduction dose-dépendante dans les cellules MIP-1α-positif (figure 5C) a été observée dans WS-CM CMSP -exposed. Dans cet essai, nous avons observé une diminution du nombre de cellules productrices de cytokines intracellulaires positif après exposition à WS-CM à la nicotine equi-unités inférieures (1,56 ug / ml). Les deux cytokine sécrétée et les dosages de cytokines intracellulaires ont montré des résultats similaires en termes de taux d'IFN-γ ou IFN-γ cellules positif.
À titre de mesure fonctionnelle, la capacité de WS-CM- et NicotineLes PBMC traitées à tuer les cellules K562 cibles a été déterminée. La figure 6A représente cytométrie en flux représentant les données brutes de coloration 7AAD positif de cible (CFSE marqué K562) la destruction des cellules par le contrôle, WS-CM-exposée, et des PBMC de nicotine-traitée. Numéros dans la boîte représentent les cellules K562 pour cent 7AAD positif CFSE-étiquetés. L'exposition à 1,56 ug / ml de CM-WS réduit de façon significative la capacité à tuer des cellules effectrices PBMC en comparaison avec le témoin et les doses plus faibles. Traitement à la nicotine à des doses faibles et élevées ne interfère pas avec la mort de la cellule. La figure 6B montre une diminution dose-dépendante de la cellule K562 pour cent tuer de plusieurs bailleurs de fonds en une seule expérience.
Figure 1. La mort cellulaire des PBMC après exposition à des concentrations d'unités de WS-CM (pg / ml) et la nicotine (pg / ml) équi-nicotine augmente. (A) et avec de la nicotine pendant 3 h et 24 h (B). La mort cellulaire a été mesurée par 7AAD coloration. Chaque point représente les barres moyenne ± d'erreur de quatre donateurs d'une expérience représentative. La signification statistique est indiquée par: * P <0,05; ** P <0,005, *** p <0,0005.
Figure 2. La sécrétion d'IL-6 et IL-8 par des PBMC stimulées par LPS à différents points dans le temps. PBMC ont été stimulées avec LPS pendant 4 h, 24 h, 48 h et 72 h. Les taux d'IL-6 et IL-8 cytokines dans les surnageants de culture de cellules ont été déterminés par l'homme de cytokines inflammatoires Kit (kit ABC) et la cytométrie de flux. Ces données représentent les moyennes ± SD barres d'erreur à partir de l'une des deux expériences indépendantes en utilisant des PBMC provenant de trois donneurs différents. Le SI statistiquesgnificance est indiquée par: * P <0,05; ** P <0,005.
Figure 3. Réduction de la sécrétion de cytokines par les PBMC traitées avec des concentrations d'unités de WS-CM (pg / ml) et la nicotine (pg / ml) équi-nicotine suivantes stimulation par le LPS croissante. PBMC ont été exposées à différentes concentrations de WS-CM et la nicotine pendant 3 heures et stimulées avec LPS pendant 24 heures. Les niveaux d'IFN-γ (A), TNF (B), l'IL-10 (C), et l'IL-6 (D) des cytokines dans les surnageants de culture cellulaire ont été déterminées en utilisant un dosage de type Th1 / Th2 ABC et cytométrie de flux. Ces données représentent les moyennes ± SD barres d'erreur de l'une des trois expériences indépendantes en utilisant des PBMC provenant de quatre donneurs différents. La signification statistique est indiquée par: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Con supérieur centrations de WS-CM étaient également statistiquement significative avec *** P <0,0005.
Figure 4. L'atténuation de la sécrétion de IL-8 par les PBMC traitées avec des concentrations d'unités de WS-CM (pg / ml) et la nicotine (pg / ml) équi-nicotine après stimulation par le LPS croissante. PBMC ont été exposés à WS-CM et la nicotine, stimulées avec du LPS pendant 24 heures, et l'IL-8 sécrétée a été mesurée par ELISA. Ces données représentent les moyennes ± SD barres d'erreur à partir de l'une des trois expériences indépendantes en utilisant des PBMC provenant de quatre donneurs différents. La signification statistique est indiquée par: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Des concentrations plus élevées de WS-CM étaient également statistiquement significative avec *** P <0,0005.
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Figure 5. La réduction des cellules productrices de cytokines intracellulaires positif dans les PBMC traitées avec des concentrations d'unités de WS-CM (pg / ml) et la nicotine (pg / ml) équi-nicotine augmente. PBMC ont été exposées à des concentrations variables de WS-CM et la nicotine pendant 3 heures et stimulées avec LPS et Golgiplug pendant 6 heures. La commande de véhicule pour WS-CM et la nicotine était un milieu RPMI complet. Intracellulaire (C) MIP-1α cellules positives IFN-γ-positive (A), le TNF-α-positif (B), et ont été quantifiés par cytométrie en flux. Ces données représentent les moyennes ± SD barres d'erreur à partir de l'un des quatre expériences indépendantes en utilisant des PBMC provenant de quatre donneurs différents. La signification statistique est indiquée par: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Des concentrations plus élevées de WS-CM étaient également statistiquement significative avec *** P <0,0005.
Figure 6. La réduction de la capacité de tuer des PBMC cibles avec exposition à des concentrations d'unités de WS-CM (pg / ml) et la nicotine (pg / ml) équi-nicotine augmente. PBMC ont été traitées avec les concentrations indiquées de WS-CM et de 3 nicotine h, et des cellules K562 marquées au CFSE ont été ensuite ajoutées comme cellules cibles et incubées pendant encore 5 heures. Les cellules ont été colorées avec 7AAD et cytométrie de flux a été utilisée pour évaluer la capacité de tuer. La figure 6A montre le flux représentant cytométrie résultats avec pour cent assassinat montré dans les boîtes gated. La flèche indique réduit pour cent meurtre à 1,56 pg / ml exposés WS-CM. La figure 6B montre représentatives barres moyenne ± d'erreur de quatre expériences indépendantes utilisant PBMC de quatre donneurs différents. La signification statistique est indiquée par: ** P <0,005; *** P <0,0005. Des concentrations plus élevées de WS-CM étaient également statistiquement significative esprith *** P <0,0005.
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Discussion
Nous et d'autres avons précédemment démontré que le traitement des PBMC avec PPT inhibe plusieurs réponses, y compris l'expression et la sécrétion de cytokines et les mesures fonctionnelles telles que la cellule cible 14 tuant. Les méthodes expérimentales décrites dans l'ouvrage précédent nécessitent des périodes d'incubation plus longues et ont été modestes en amplitude 14. Étant donné les applications potentielles de cette jolie modèle ex vivo pour la recherche fondamentale et appliquée, nous avons examiné si l'un des paramètres de dosage dans ces essais biologiques en plusieurs étapes pourrait être optimisée. Ici, nous présentons simplifié méthodes pour mesurer les réponses immunitaires médiée par un TLR au moyen d'un modèle ex vivo PBMC TPP-traitée.
Isolement de PBMC viable est une condition essentielle pour ces tests ex vivo. Compte tenu de la variabilité individuelle et l'état physiologique chez les donneurs potentiels, il est idéal pour obtenir PBMC qui répondent. Aux fins de la présente étude, nous isolonsCMSP d de sujets adultes généralement en bonne santé en utilisant une méthode déjà publié 15. En outre, dans cette étude pour minimiser la variabilité entre les donateurs, nous avons exclu les personnes souffrant d'allergies, infections, ou qui sont de prendre des ordonnances ou sur les médicaments en vente libre comme l'aspirine. En outre, l'isolement des PBMC à partir de sang fraîchement prélevé est souhaitable, car elle assure la viabilité et la fonctionnalité optimale des cellules dans des expériences ultérieures.
Les procédés antérieurs utilisés stimulation par des agonistes de TLR pour 67 à 72 h pour mesurer les cytokines intracellulaires et 14 cytokines sécrétées. Un temps-cours de la sécrétion de cytokines dans les cellules stimulées TLR (dans des conditions de contrôle sans WS-CM ou de la nicotine) a suggéré que la sécrétion maximale se est produite à 24 h. En outre, nous avons combiné l'incubation avec des agonistes TLR et Golgiplug et réduit le temps d'incubation à un total de 6 h pour mesurer cytokines intracellulaires. Bien que cela exige un dosage séparé pour mesurercellules de cytokines-positives, les données sont plus robustes par rapport à la méthode précédente 14. En accord avec les résultats précédents, WS-CM fortement supprimée l'induction de cytokines intracellulaires et sécrétées. Ainsi, ces modifications ont conduit à une réduction substantielle des temps de dosage et ont donné des résultats très similaires à celles décrites dans la littérature. Alors que nous avons utilisé la cytométrie en flux et méthodes ELISA pour évaluer les niveaux de cytokines, d'autres techniques telles que la réaction en temps réel en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR) peuvent également être utilisés comme une technique complémentaire.
Historiquement, la destruction des cellules cibles par effectrices PBMC méthodes utilisées radiomarqués (par exemple, 51 Cr-release dosage). La méthode décrite dans ce rapport permet d'éliminer l'utilisation de la radioactivité et emploie des cellules de chargement avec un colorant fluorescent, dont la présence pourrait être surveillée par cytométrie de flux. Un autre avantage du procédé décrit ici est qu'il est relativement rapide et peut être ADAPTEd pour tests à haut rendement. Étant donné que la période d'incubation des cellules effectrices et cibles est 5 h, cette analyse peut être achevée en 8 heures. Cela contraste avec d'autres méthodes publiées, qui sont plus impliqués car ils nécessitent l'isolement de sous-types de PBMC et de l'activation / stimulation sur une période de plusieurs jours, ou l'analyse des cellules NK et des cellules K562 conjugués de contrôler la cytotoxicité 17,18. Un autre avantage de la méthode actuelle est qu'elle utilise des PBMC cryopréservées directement comme cellules effectrices, laquelle offre une plus grande flexibilité.
En résumé, nous avons décrit plusieurs essais pour déterminer l'effet de la réponse immunitaire médiée par un TLR dans les PBMC traitées TPP-combustibles, qui peut être aisément appliqué pour tester différents composés. L'utilisation de composants cryoconservés permet une flexibilité importante, et avec des techniques établies telles que la cytométrie de flux, les dosages de l'ABC, et ELISA, robuste et des résultats cohérents pourraient être obtenus rapidement à travers laboratoire différentoratoires.
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Acknowledgments
Ce travail est financé par RJ Reynolds Tobacco Company (de RJRT) en vertu d'un accord de collaboration de recherche avec l'École de médecine Wake Forest University. GL Prasad est un employé à temps plein de la RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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