Abstract
Onder andere pathofysiologische veranderingen, chronische blootstelling aan sigarettenrook veroorzaakt ontsteking en immuunonderdrukking, die zijn gekoppeld aan verhoogde gevoeligheid van rokers om microbiële infecties en tumoren. Ex vivo onderdrukking van receptor gemedieerde immuunresponsen in humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) behandeld met rookbestanddelen is een aantrekkelijke benadering van mechanismen bestuderen en de mogelijke lange termijn effecten van blootstelling aan tabaksproducten te evalueren. Hier hebben we optimale werkwijzen ex vivo assays met PBMC gestimuleerd door bacterieel lipopolysaccharide, een Toll-like receptor-ligand 4 uitvoeren. De effecten van de hele rook-geconditioneerd medium (WS-CM), een voorbereiding brandbare tabaksproduct (TPP), en nicotine werden onderzocht op cytokine secretie en doelcel doden door PBMCs in de ex vivo testen. We zien dat uitgescheiden cytokines IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 en IL-8 en intracellulaire cytokinen IFN47 ;, TNF-α en MIP-1α werden onderdrukt WS-CM-blootgestelde PBMC. De cytolytische functie van effector PBMCs, zoals bepaald met een K562 doelwitcel doden assay werd ook verminderd door blootstelling aan WS-CM; nicotine was minimaal effectief in deze assays. Samengevat presenteren we een reeks verbeterde tests om de effecten van TPPs in ex vivo assays te evalueren en deze werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast voor het testen van andere interessante producten.
Introduction
Een aanzienlijke hoeveelheid kennis wijst op de nadelige gevolgen voor de gezondheid van chronische roken van sigaretten, waaronder hart- en vaatziekten (HVZ), chronische obstructieve longziekte (COPD) en kanker 1,2. Chronische roken van sigaretten is bekend ontsteking en immuunsuppressie veroorzaken, en deze wijzigingen worden gerapporteerd bijdragen aan een verhoogd risico op microbiële infecties en kanker bij rokers 3. In vitro en ex vivo technieken bruikbaar in het ophelderen van de moleculaire basis van de pathofysiologische effecten van sigarettenrook 4-9 (tabel 1) en worden erkend als belangrijke instrumenten voor de geleiding van de opkomende regulering van verschillende tabaksproducten 10,11.
Zo hebben we aangetoond dat brandbare tabaksproduct preparaten (TPPs) zoals hele rook geconditioneerd medium (WS-CM) en totale deeltjes (TPM) zijn veel cytotoxische en schadelijkDNA dan niet-brandbare TPPs of nicotine 12,13. Consistent met de gepubliceerde werk, werd onlangs gemeld dat brandbare TPPs of nicotine 12,13. Consistent met de gepubliceerde werk, hebben we onlangs gemeld dat brandbare TPPs veroorzaakt gemarkeerde immunosuppressie. Dit werd bewezen door onderdrukking van Toll- like receptor (TLR) -ligands, gestimuleerd cytokine secretie, en gerichte cel (K562) doden door PBMCs in een ex vivo model 14. Gezien het belang van een ontsteking in sigarettenrook geïnduceerde ziekte processen, wordt een verdere optimalisatie van de testomstandigheden aan het immuunsysteem modulerende effecten van sigarettenrook te evalueren die in dit rapport.
De ex vivo assays meestal gemeten intracellulaire en uitgescheiden cytokinen alsook de cytolytische functie van cytotoxische T- en NK-cellen in K562 celdodingassays 14. De assays betrokken voorincubatie met WS-CM en nicotine en daaropvolgende stimulatie van PBMCs TLR-agonisten gedurende 3 dagen; de laatste uitlezingen worden uitgevoerd middels enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) en / of flowcytometrie. We gebruik bacterieel lipopolysaccharide (LPS), dat bindt aan TLR-4-receptoren en stimuleert PBMC resulterend in de productie van intracellulaire cytokinen en uitscheiding van cytokinen. Naast optimalisatie van de verschillende assaystappen voor evaluatie van de immunomodulerende effecten van TPPs presenteren we ook werkwijzen voor het isoleren PBMC, celdood assays en IL-8 kwantificering. Deze methoden kunnen worden toegepast op andere onderzoeksvragen te pakken en verder verfijnd om tabaksproducten te evalueren in het regelgevend kader.
Tabel 1. Gepubliceerde rapporten van in vitro en ex vivo methoden gebruikt om varilus pathofysiologische effecten van tabaksproducten voorbereidingen studeren CS, sigarettenrook medium.; CSC, sigarettenrook condensaat; CSE, sigarettenrook extract; ELISA, enzymgekoppelde immunosorbent assay; GADPH, glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase; qPCR, kwantitatieve polymerase kettingreactie; RT, real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie; TS, tabaksrook.
| Auteur (Jaar van de studie) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Cellen gebruikt | Menselijke bronchiale endotheel cellen (BEAS-2B), humane neutrofielen | Human alveolaire epitheelcellen (A549) | Human luchtweg gladde spiercellen (HASMC) | Menselijke premonocytische U937-cellen, humane monocyten | Alveolaire type II epitheelcellen (ATII) | Human monocytairecellijn (THP-1), menselijke long macrofagen |
| TPP gebruikt | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Gebruikte methode | ELISA, qPCR, migratie, elektromobiliteit shift | Immunohistochemische-chemie, elektroforese, Arrayscan kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforese | Gel-mobility shift | Lichtmicroscopie, elektronenmicroscopie, elektroforese, ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate kit (Sigma), p65 plaat assay (TransAM), elektroforese, verschillende immunoassay kits |
| Maatregel | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, migratie | Histon acetyltransferasen, histondeacetylasen, NF-KB, IL-8, pI KB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxine | Heat shock / stress-eiwitten (HSP / Hsp70), HF transcriptiefactor, NF-KB,TNF-α | Oppervlakteactieve eiwitten (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK fosforylatie cJun: DNA binding, glutathion, p65: DNA binding |
| Eindresultaat | CSE down-reguleert cytokine productie via onderdrukking van AP-1 activering. | H 2 O 2 en CSC verbeteren acetylering van histon-eiwitten, histondeacetylaseac activiteit te verminderen, differentieel reguleren pro-inflammatoire cytokine release. | Sigarettenrook kan de afgifte van IL-8 uit HASMC, versterkt door TNF-α, 20% CSE minder IL-8 release, Remming van eotaxine en RANTES door sigarettenrook veroorzaken. | TS HF geactiveerde transcriptiefactor, die werd geassocieerd met Hsp70 overexpressie en remming van NFkB bindingsactiviteit en TNF-α afgifte. | Verminderde ATII cel afkomstige chemokine niveaus compromis AlveoLAR reparatie, wat bijdraagt aan sigarettenrook geïnduceerde alveolaire schade en emfyseem. | Gegevens te verstrekken mechanistische verklaring voor waarom rokers zijn toegenomen infecties van de luchtwegen. Onderdrukking van de aangeboren respons gepaard gaat met een toename van IL-8. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: schriftelijk toestemming om deze studie te doen werd verkregen bij een lokale klinisch onderzoek eenheid onder IRB goedkeuring, per Good Clinical Practices. Verwerking van bloed, isolatie van PBMC en andere celcultuur experimenten uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een microbiologisch steriele voorraden en reagentia.
1. WS-CM Voorbereiding
- Genereer WS-CM zoals eerder beschreven 12.
- Bereid WS-CM door het passeren van de rook van vier 3R4F verwijzing sigaretten via Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium zonder fenol met behulp van de volgende roken regime rood: 35-60-2, bladerdeeg volume in ml, bladerdeeg interval in sec, en bladerdeeg duur in sec, respectievelijk. Elke bereiding genereert een 20 ml monster.
- Label tube (s) met datum, tijd voltooid, en de naam van sigaretten en het nummer. Bewaar de 500 pi aliquots bij -80 ° C onmiddellijk na het roken is voltooid.
- Analyseren monsters van bevroren WS-CM Het gehalte aan nicotine, tabak nitrosamines en polycyclische aromatische koolwaterstoffen bepaald zoals eerder beschreven 12.
2. Isolatie van PBMC
- Verzamel verse bloed van gezonde donoren (die niet-consumenten van tabaksproducten) Isoleer PBMCs van vers bloed zoals hieronder beschreven onder een afzonderlijke goedkeuring van Wake Forest Baptist Health IRB 15.
- Voorafgaand aan de komst van de bloedzak, een fles van 500 ml, schaar, isolatiebuffer en Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (RT) bereid in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) celkweek kap. Isolatie buffer moet worden beschermd tegen licht.
- Houd de bloedzak ondersteboven en snijd de buis net onder waar het is geklemd verlaten van ten minste 3 cm van de slang.
- Verwijder de dop van de fles van 500 ml en houd de buis boven de fles opening. Pak de bloedzak en keer het om het bloed vrij stromen uit de zak in tHij fles totdat de zak leeg is. Laat het bloed stromen op de binnenwand van de fles versus recht omlaag over voorkomen dat luchtbellen.
- Giet isolatiebuffer in de fles bij een 1: 5 verhouding isolatiebuffer bloed. Dop van de fles zorgvuldig en voorzichtig omkeren het, end-over-end, 10 keer. Laat de fles in de celkweek kap incuberen met licht uit, gedurende 1 uur bij KT.
- Een lichte, stro gekleurde laag zal opbouwen boven het bloed. Verwijder deze laag met een 25 ml serologische pipet in 50 ml conische buizen. Het verzamelde bedrag kan 50-300 ml, afhankelijk van het subject bloed donor.
- Centrifugeer de buizen bij 200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Zuig het doorschijnende bovendrijvende, waardoor de donkere bloed-gekleurde pellet. De pellet wordt los maar viskeuze zijn.
- Pipetteer 3 ml isolatiebuffer in 15 ml conische buizen.
- Om de resuspendeer pellet, voeg 20 ml DPBS voor elke 50 ml van stro-gekleurde vloeistof in 's verzameldTep 2.1.5. Vortex om goed te mengen, en consolideren van de geresuspendeerd vloeistof uit meerdere buisjes. Deze vloeistof bevat opgeschort bloedcellen.
- Bij een overdracht pipet, overdracht 5 ml van de gesuspendeerde bloedcellen op 3 ml isolatiebuffer in stap 2.1.8. Kantel de 15 ml conische buis die de cel suspensie langzaam en voorzichtig twee afzonderlijke lagen te creëren. Centrifugeer de buizen bij 400 xg gedurende 40 min bij kamertemperatuur met minimale acceleratie en zonder rem.
- Gebruik overdracht pipet om de resulterende troebele middenlaag (buffy coat) die PBMC in een 50 ml conische buis te verwijderen. Vermijden, andere duidelijke lagen eronder. Transfer niet meer dan 25 ml in elk 50 ml conische buis.
- Voeg 25 ml koude loopbuffer om de cellen te wassen (of meer om de gehele resterende volume van 50 ml conische buis te vullen). Centrifugeer de cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet met 10 ml loopbuffer. Deze bevat PBMCs. Tel de cellen en gebruiken immiddellijk of plaats op ijs voor het invriezen.
3. Het invriezen en ontdooien van de PBMCs
- Centrifugeer de PBMC die in stap 2.1.13 werden verzameld gedurende 10 min bij 400 x g.
- Vul het bevriezen houder met isopropylalcohol instructies van de fabrikant. LET OP: Isopropyl alcohol is brandbaar en acuut giftig.
- Resuspendeer de pellet met RPMI 1640 medium (4 ° C) bevattende 20% foetaal runderserum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Dit RPMI 1640 medium bevriezing. Resuspendeer de pellet met een hoeveelheid invriesmedium dat leidt tot een suspensie met ongeveer 5 x 10 7 cellen / ml. Het aantal cellen beschikbaar invriezen variëren.
- Verdeel 1 ml porties van celsuspensie in 2 ml cryotubes en plaats de cryotubes in de bevriezing container. Plaats de bevriezing container met cryobuizen in een vriezer bij -80 ° C op te slaan O / N en verwijder vervolgens de cryobuizen en over te dragen aan te slaan in eencryogene vriezer tussen -150 ° C tot -190 ° C.
- Verwijder de cryotube uit cryogene opslag en ontdooien het snel zacht schudden in een waterbad bij 37 ° C.
- Onmiddellijk over de ontdooide PBMCs in de cryotube in een 15 ml conische buis met 10 ml RPMI 1640 compleet medium (4 ° C) met 10% FBS, 1% Pen / Strep en 1% L-glutamine. De inhoud van de ontdooide cryotube moet zo snel mogelijk naar maximale cel levensvatbaarheid 15 verkrijgen.
- Centrifugeer de PBMC bij 400 xg gedurende 10 min.
- Resuspendeer de pellet met 5 ml RPMI 1640 compleet medium en tel de cellen.
- Meet cellevensvatbaarheid van gevestigde werkwijzen zoals trypan blauw exclusie werkwijze. Algemeen cellevensvatbaarheid met deze methode is ongeveer 90-95%. De PBMC's zijn nu klaar om te gebruiken in experimenten.
4. Cell Death Bepaling
OPMERKING: hier vermeld Verdunningen zijn voor het doel van deze study. De verdunningen kan dienovereenkomstig worden aangepast.
- Verdun WS-CM of nicotine in een plaat met 96 putjes met RPMI volledig medium tot een totaal volume van 100 ul / putje, zoals hieronder aangegeven.
- Verdun WS-CM aan de volgende concentraties: 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, en 5 ug / ml equi-nicotine eenheden (op basis van het nicotinegehalte in WS-CM) 12.
- Verdun nicotine in RPMI medium om de volgende concentraties: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 en 3000 ug / ml. WAARSCHUWING: Nicotine is acuut giftig en schadelijk voor het milieu.
- Voeg 100 ul van PBMC gesuspendeerd in RPMI compleet medium aan elk putje in een concentratie van 1 x 10 6 cellen / putje. De totale cellen plus WS-cm of nicotine 200 gl / putje zijn.
- Ten behoeve van deze studie bereiden twee platen zoals hierboven. Bedek de platen en incubeer een dienblad 24 uur en een dienblad 3 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Pas tijdstippen als dat nodig is. Was de cellen door centrifugeren bij kamertemperatuur bij 300 xg gedurende 3 min, afzuigen de supernatant, vortexen de bodem van de plaat met plaat bedekt en tenslotte resuspenderen cellen met 200 ul ijskoude loopbuffer, en herhaal de wasstap een keer.
- Voeg 95 ul van loopbuffer, gevolgd door 5 pl van 7-amino-actinomycine D (7AAD) aan elk putje voor een totaal volume van 100 ul / putje. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voeg 100 ul van lopende buffer om cluster buizen. Breng het gehele volume van de celsuspensie uit elk putje van de plaat om de cluster buizen en verwerven van de monsters op flowcytometer.
- Bepaal het percentage 7AAD-positieve cellen middels flowcytometrie analyse software.
5. EC 50 Bepaling
- De EC 50 -waarden van WS-CM en nicotine worden bepaald door 7AAD-positieve kleuring van PBMC.
- De EC50 wordt gedefinieerd als de concentration waarbij 50% van de cellen niet langer levensvatbaar een 24 uur test en de waarden worden uitgedrukt als ug equi-nicotine eenheden / ml.
- Ten behoeve van deze studie werden de EC50 waarden die respectievelijk 1,56 ug / ml en 1,650 ug / ml WS-CM en nicotine zijn.
6. Uitgescheiden Cytokines
OPMERKING: hier vermeld Verdunningen zijn voor het doel van deze studie. De verdunningen kan worden aangepast.
- Verdun WS-CM in een plaat met 96 putjes met RPMI volledig medium tot een totaal volume van 100 ul / putje bij een concentratie van 0,3, 1,56, 3 en 5 ug / ml equi-nicotine eenheden.
- Verdun nicotine aan de volgende concentraties: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 en 3000 ug / ml. WAARSCHUWING: Nicotine is acuut giftig en schadelijk voor het milieu.
- Voeg 100 ul van PBMC gesuspendeerd in RPMI compleet medium aan elk putje in een concentratie van 1 x 10 6 cellen / putje.De totale cellen plus WS-cm of nicotine 200 gl / putje zijn.
- Bedek de plaat en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Was de cellen door centrifugeren bij kamertemperatuur bij 300 xg gedurende 3 min, afzuigen de supernatant, vortexen de bodem van de plaat met plaat bedekt en tenslotte suspenderen cellen met 200 ul ijskoude loopbuffer en herhalen van de wasstap een keer.
- Voeg 200 ul van RPMI volledig medium, en herhaal de wasstap nog een keer.
- Voeg 200 ui 10 pg / ml LPS medium aan elk putje.
- Bedek de plaat en incubeer gedurende 4 uur, 24 uur, 48 uur of 72 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Pas incubatietijden nodig.
- Centrifugeer de plaat bij 300 xg gedurende 3 min.
- Neem 175 ul van supernatant uit elk putje en op te slaan in een vriezer bij -80 ° C tot de testen uit te voeren in de stappen 7 en 8.
7. Cytometrische Bead Array Assay
<ol>8. IL-8 ELISA
- Ontdooi de cel supernatanten uit stap 6.10 en gebruik in de IL-8 ELISA. Voer de ELISA-bepaling volgens de instructies van de fabrikant.
9. intracellulaire kleuring en flowcytometrie
OPMERKING: hier vermeld Verdunningen zijn voor het doel van deze studie. De verdunningen kan worden aangepast.
- Verdun WS-CM in een plaat met 96 putjes met RPMI volledig medium tot een totaal volume van 100 ul / putje bij een concentratie van 0,3, 1,56, 3 en 5 ug / ml equi-nicotine eenheden.
- In dezelfde plaat, verdunnen nicotine aan de volgende concentraties: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 en 4000 ug / ml. WAARSCHUWING: Nicotine is acuut giftig en milieuvriendelijk hazardous.
- Voeg 100 ul van PBMC gesuspendeerd in RPMI compleet medium bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / putje. De totale cellen plus WS-cm of nicotine 200 gl / putje zijn.
- Bedek de plaat en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Was de cellen bij kamertemperatuur door centrifugeren bij 300 x g gedurende 3 min, afzuigen de supernatant, vortexen de bodem van de plaat met plaat bedekt en tenslotte resuspenderen cellen met 200 ul ijskoude loopbuffer, en herhaal de wasstap een keer.
- Voeg 200 ul van RPMI compleet medium aan de plaat, en herhaal de wasstap nog een keer.
- Bereid de werkende concentraties van 2 pl / ml GolgiPlug en 10 ug / ml LPS met RPMI compleet medium en voeg 200 ul aan elk putje.
- Incubeer de plaat gedurende 6 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Aan het einde van stap 9.8, was de cellen met loopbuffer (4 ° C) en centrifugeren bij 300xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Voeg 100 ul van Cytofix aan elk putje en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen 3 keer beschreven in stap 9.9 met 1x Permwash (4 ° C) bij 300 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Voeg 45 ul van 1x Cytoperm aan elk putje gevolgd door 5 pl van elk van één van de volgende antilichamen aan elk putje: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min.
- Was de cellen tweemaal zoals beschreven in stap 9.9 met 1x Permwash (4 ° C) en eenmaal met lopende buffer (4 ° C) bij 300 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen met 200 ul van 2% paraformaldehyde (4 ° C). Breng de cellen in 12 × 75 mm buizen, en het analyseren van de monsters op flowcytometer. LET OP: Paraformaldehyde is corrosief, acuut giftig en schadelijk voor de gezondheid.
10. K562 Killing Assay
OPMERKING: K562-cellen worden gekweektin kweek bij 37 ° C en 5% CO2 met RPMI volledig medium tot ze bij 80% confluentie voordat de assay.
- Bereid een 5 mM carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) stock-oplossing door het toevoegen van 18 pl van DMSO aan de flacon.
- Verdun WS-CM of nicotine in een plaat met 96 putjes met RPMI volledig medium tot een totaal volume van 100 ul / putje aan de gewenste equi-nicotine eenheden of nicotine concentraties voor elke bereiken ook. WAARSCHUWING: Nicotine is acuut giftig en schadelijk voor het milieu.
- Voeg 100 ul van PBMCs in RPMI compleet medium bij een concentratie van 1,5 x 10 6 cellen / putje. De totale cellen met WS-cm of nicotine 200 pl / putje is.
- Bedek de plaat en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Was de K562 cellen door toevoeging van 10 ml DPBS en centrifugeer bij 400 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de cellen met 10 ml DPBS en tel de K562 cellen.
- Bereid CFSE working door toevoeging van 1 pi van CFSE voorraadoplossing tot 1 ml DPBS.
- Voeg 1 ml van de CFSE werkoplossing 1 ml van de K562 cel suspensie die 1-2 x 10 7 cellen. Vortex en incubeer gedurende precies 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg onmiddellijk 200 pl FBS. Vortex en incubeer gedurende precies 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 ml RPMI compleet medium en centrifugeer de buis bij 400 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant RPMI en breek de pellet en resuspendeer de cellen met 10 ml RPMI compleet medium en tel de CFSE-gelabelde K562 cellen.
- Was de PBMC door centrifugeren van de plaat bij 300 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant door decanteren van de vloeistof. Plaats het deksel en vortex de onderkant van de plaat. Voeg 200 ul RPMI compleet medium en herhaal wasstap keer.
- Voeg CFSE-gelabelde K562 cellen in een verhouding van 1:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) aan elk monster putje van de plaat PBMC en verder incubate gedurende 5 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Was de celmengsel door centrifugeren bij 300 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant door verwijderen van de vloeistof. Plaats het deksel en vortex de onderkant van de plaat.
- Voeg 200 gl loopbuffer en herhaal de wasstap in stap 10.14 een keer beschreven.
- Voeg 95 ul van loopbuffer, gevolgd door 5 pl van 7AAD aan elk putje voor een totaal volume van 100 ul / putje. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voeg 100 ul van loopbuffer aan elk putje en breng de volledige hoeveelheid celsuspensie uit elk putje van de plaat om de cluster buizen en verwerven van de monsters op flowcytometer.
- Bepaal het percentage 7AAD-positieve en CFSE-positieve cellen middels flowcytometrie analyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten werden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (vier donormonsters). De t-toets tussen behandelde en onbehandelde monsters werd uitgevoerd met Excel software en t-test vergelijkingen voor alle behandelingen met hun overeenkomstige controles. De statistische significantie werd aangegeven: *, p <0.05; **, P <0.005; ***, P <0,0005.
Om het effect van blootstelling aan WS-CM en nicotine meten, werden PBMC behandeld met verschillende concentraties van WS-CM en nicotine gedurende 3 uur of 24 uur. Celdood werd gemeten door de robuuste en betrouwbare 7AAD kleuring werkwijze zoals 7AAD intercalaten in dubbelstrengs nucleïnezuren en kunnen celmembranen van stervende of dode cellen 16 penetreren. Een dosis-afhankelijke toename in celdood waargenomen met WS-CM 24 uur, met een bijna 80% celdood gedetecteerd bij 4 pg / ml equi-nicotine eenheden (figuur 1A). Een vergelijkbaar niveau van celdoodalleen waargenomen bij 3.000 pg / ml nicotine (Figuur 1B). Aangezien we blootgesteld PBMC 3 uur met WS-CM nicotine en hun effect van de cytokine-inductie en het vermogen doelcellen te doden beoordelen, moest worden vastgesteld of WS-CM veroorzaakt significante cytotoxiciteit na 3 uur behandeling. PBMC behandeld met 5 ug / ml equi-nicotine eenheden WS-CM geen significante toxiciteit ondervonden (<5%; Figuur 1A). Behandeling met nicotine 3 uur veroorzaakte meetbare (8%) celdood alleen bij 2000 pg / ml (Figuur 1B). Aldus blootstelling aan WS-CM of nicotine bij de aangegeven doses en behandelingsperioden veroorzaakte geen significante cytotoxiciteit onder de experimentele condities.
De immunomodulerende effecten te meten, werden PBMC gestimuleerd met LPS voor verschillende perioden en het uitgescheiden cytokinen werden gemeten door het CBA assay. De LPS stimulatie te optimaliseren, we blootgesteld PBMC aan LPS stimulatie 4 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur, en uitgescheiden cytokines werden gemeten. Bijvoorbeeld, LPS stimulatie gedurende 24 uur leverde maximale secretie van de cytokines IL-6 en IL-8 (figuur 2), en langere perioden niet tot een verdere toename (IL-6) of verlaagt (IL-8) in cytokine secretie. Soortgelijke resultaten werden verkregen met andere uitgescheiden cytokinen zoals IL-10, IL-1β en TNF-α (gegevens niet getoond).
De piloot tijdsverloop experimenten gesuggereerd dat de maximale productie van cytokines in reacties op TLR-4 stimulatie door LPS gebeurt door 24 uur, en dus werden uitgescheiden cytokines gemeten op 24 uur in alle volgende experimenten. Behandeling met WS-CM en nicotine, gevolgd door stimulatie van TLR-4 receptor met LPS resulteerde in een dosis-afhankelijke afname van uitgescheiden cytokinen (figuur 3). Behandeling met WS-CM resulteerde in een aanzienlijke daling van IFN-γ (figuur 3A), TNF (figuur 3B), IL-10 (Figuur 3C </ Strong>) en IL-6 (Figuur 3D) met lage nicotine equi-eenheden (1,56 ug / ml). Onderdrukking van cytokines was ook duidelijk met nicotine. De onderdrukking van cytokinen met nicotine opgetreden tegen aanzienlijk hogere doses, en de mate van onderdrukking varieerden tussen individuele cytokinen. Bijvoorbeeld, IFN-γ bleek aanzienlijk onderdrukt nicotine bij 50 ug / ml, terwijl IL-6 werd onderdrukt getest de hoogste concentratie (4 mg / ml) (Figurie 3D). Vervolgens maten we IL-8 niveaus in dezelfde monsters met behulp van een ELISA-bepaling. IL-8 secretie werd effectief onderdrukt in WS-CM-blootgestelde PBMCs; terwijl onderdrukkende effecten van nicotine waren significant bij 2 mg / ml (Figuur 4).
De niveaus van intracellulaire cytokinen werden gekwantificeerd in WS-CM- en nicotine behandelde cellen na stimulatie met LPS. Eerder gestimuleerde PBMC we voor 3 dagen toegevoegd Golgiplug gedurende de laatste 6 uur van incubatie metenintracellulaire cytokinen 14. We hebben nu significant de incubatieperiode door het combineren LPS en Golgi stekker in totaal 6 uur en gemeten intracellulaire cytokine-positieve cellen (figuur 5). Figuur 5 toont een dosisafhankelijke procent reductie in IFN-γ-positieve cellen ( Figuur 5A), TNF-α-positieve cellen (figuur 5B) zowel nicotine- en WS-CM- blootgestelde PBMC, terwijl een dosisafhankelijke procent reductie van MIP-1α-positieve cellen (figuur 5C) waargenomen bij WS-CM -exposed PBMCs. In deze test zagen we een afname van het aantal intracellulaire cytokine-positieve cellen na blootstelling aan WS-CM lagere equi-nicotine eenheden (1,56 ug / ml). Zowel afgescheiden cytokine en intracellulaire cytokine assays toonde vergelijkbare resultaten in termen van IFN-γ levels of IFN-γ-positieve cellen.
Als functioneel maatregel, het vermogen van WS-CM- en nicotine-behandeld PBMC aan doelwit K562 cellen te doden werd bepaald. Figuur 6A geeft vertegenwoordiger stromingscytometrische ruwe data van 7AAD-positieve kleuring van target (CFSE-gelabelde K562) celdood door control, WS-CM-blootgesteld, en nicotine behandeld PBMC. Getallen in de doos vertegenwoordigen procent 7AAD-positieve CFSE-gelabelde K562 cellen. Blootstelling aan 1,56 ug / ml WS-CM verminderde significant het doden vermogen van de effectorcellen in PBMCs opzichte van controle en de lagere doses. Nicotine behandeling bij lage en hoge doses niet interfereren met de cel doden. Figuur 6B toont een dosisafhankelijke afname in percentage K562 celdodende van meerdere donoren in een enkel experiment.
Figuur 1. Celdood van PBMCs na blootstelling aan toenemende concentraties van equi-nicotine eenheden WS-CM (ug / ml) en nicotine (ug / ml). (A) en nicotine gedurende 3 uur en 24 uur (B). Celdood werd gemeten door 7AAD kleuring. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD foutbalken vier donoren van een representatief experiment. De statistische significantie wordt aangeduid met: * p <0,05; ** P <0,005, *** p <0,0005.
Figuur 2. Secretie van IL-6 en IL-8 door PBMC gestimuleerd met LPS op verschillende tijdstippen. PBMC werden gestimuleerd met LPS 4 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur. Niveaus van IL-6 en IL-8 cytokinen in de celkweek supernatanten werden bepaald met menselijk cytokine Kit (CBA kit) en flowcytometrie. Deze gegevens stellen het gemiddelde ± SD foutbalken uit één van de twee onafhankelijke experimenten met PBMC's van drie verschillende donoren. De statistische significance wordt aangegeven met: * p <0,05; ** P <0.005.
Figuur 3. Vermindering van cytokine secretie door PBMC behandeld met toenemende concentraties van equi-nicotine eenheden WS-CM (ug / ml) en nicotine (ug / ml) na LPS stimulatie. PBMC's werden blootgesteld aan verschillende concentraties van WS-CM en nicotine 3 uur en gestimuleerd met LPS 24 uur. Niveaus van IFN-γ (A), TNF (B), IL-10 (C), en IL-6 (D) cytokines in de cel kweeksupernatanten werden bepaald met een Th1 / Th2 CBA assay en flow cytometrie. Deze gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD foutbalken uit een van de drie onafhankelijke experimenten met PBMC van vier verschillende donoren. De statistische significantie wordt aangeduid met: * p <0,05; ** P <0.005; *** P <0,0005. Hogere con centraties van WS-CM waren ook statistisch significant met *** p <0,0005.
Figuur 4. Vermindering van IL-8 secretie door PBMC behandeld met toenemende concentraties van equi-nicotine eenheden WS-CM (ug / ml) en nicotine (ug / ml) na LPS stimulatie. PBMC werden blootgesteld aan WS-CM en nicotine, gestimuleerd met LPS 24 uur en uitgescheiden IL-8 werd gemeten met ELISA. Deze gegevens stellen het gemiddelde ± SD foutbalken uit een van de drie onafhankelijke experimenten met PBMC van vier verschillende donoren. De statistische significantie wordt aangeduid met: * p <0,05; ** P <0.005; *** P <0,0005. Hogere concentraties van WS-CM waren ook statistisch significant met *** p <0,0005.
.jpg "/>
Figuur 5. Reductie van intracellulaire cytokine-positieve cellen in PBMC behandeld met toenemende concentraties van equi-nicotine eenheden WS-CM (ug / ml) en nicotine (ug / ml). PBMC's werden blootgesteld aan verschillende concentraties van WS-CM en nicotine 3 uur en gestimuleerd met LPS en Golgiplug 6 uur. Het voertuig controle voor WS-CM en nicotine was RPMI volledig medium. Intracellulaire IFN-γ-positieve (A), TNF-α-positieve (B) en MIP-1α-positieve (C) cellen werden gekwantificeerd door flow cytometrie. Deze gegevens stellen het gemiddelde ± SD foutbalken uit één van de vier onafhankelijke experimenten met PBMC van vier verschillende donoren. De statistische significantie wordt aangeduid met: * p <0,05; ** P <0.005; *** P <0,0005. Hogere concentraties van WS-CM waren ook statistisch significant met *** p <0,0005.
Figuur 6. Reductie van PBMCs doel doden vermogen blootstelling aan toenemende concentraties van equi-nicotine eenheden WS-CM (ug / ml) en nicotine (ug / ml). PBMC's werden behandeld met aangegeven concentraties WS-CM en nicotine 3 hr en CFSE-gelabelde K562 cellen werden vervolgens toegevoegd als doelwitcellen en gedurende nog 5 uur. Cellen werden gekleurd met 7AAD en flowcytometrie werd gebruikt voor het doden vermogen meten. Figuur 6A toont de representatieve doorstroomcytometrie resultaten procent doden in de afgesloten dozen. De pijl geeft de verminderde procent doden in 1,56 ug / ml blootgesteld WS-CM. Figuur 6B toont representatieve gemiddelde ± SD fout bars van vier onafhankelijke experimenten met behulp van PBMC uit vier verschillende donoren. De statistische significantie wordt aangeduid met: ** P <0.005; *** P <0,0005. Hogere concentraties van WS-CM waren ook statistisch significant with *** P <0,0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat de behandeling van PBMCs met TPPs onderdrukt verschillende reacties, waaronder expressie en secretie van cytokines en functionele maatregelen zoals doelcel doden 14. De experimentele methoden in de vorige werk beschreven, vereisen een langere incubatietijd en waren bescheiden in omvang 14. Gezien de mogelijke toepassingen van dit aantrekkelijke ex vivo model voor fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben we onderzocht of een van de test parameters in deze multi-step biologische assays kunnen worden geoptimaliseerd. Hier presenteren we vereenvoudigde methoden om TLR-gemedieerde immuunreacties met behulp van een TPP-ex vivo behandeld PBMC model te meten.
Isolatie van levensvatbare PBMC's is een belangrijke voorwaarde voor deze ex vivo testen. Gezien de individuele variatie en fysiologische status potentiële donoren, is het ideaal om PBMC's die inspelen zijn te verkrijgen. Voor het doel van deze studie hebben we isolerend PBMCs van het algemeen gezonde volwassen proefpersonen met behulp van een eerder gepubliceerde methode 15. Verder in deze studie aan de variabiliteit tussen de donoren te minimaliseren, uitgesloten wij mensen met allergieën, infecties, of die waren het nemen van eventuele voorschriften of over the counter geneesmiddelen, zoals aspirine. Bovendien isolatie van PBMC uit vers verzamelde bloed wenselijk, omdat daardoor optimale levensvatbaarheid en functionaliteit van de cellen in opeenvolgende experimenten.
Vorige methoden gebruikt stimulatie met TLR-agonisten voor 67-72 uur tot intracellulaire cytokines en uitgescheiden cytokines 14 meten. Een tijdsverloop van cytokine secretie TLR-gestimuleerde cellen (onder controleomstandigheden zonder WS-CM of nicotine) suggereerde dat de maximale secretie plaatsgevonden op 24 uur. Verder combineerden we de incubatie met TLR-agonisten en Golgiplug verkleinde incubatietijd in totaal 6 uur voor het meten van intracellulaire cytokinen. Hoewel dit vereiste een afzonderlijke assay te metencytokine-positieve cellen, de gegevens robuuster dan de vorige methode 14. In overeenstemming met de vorige resultaten, WS-CM sterk onderdrukt de inductie van intracellulaire en uitgescheiden cytokinen. Aldus deze wijzigingen tot testtijden aanzienlijk verminderd en leverde bijna dezelfde resultaten als in de literatuur beschreven. Terwijl we flowcytometrie en ELISA werkwijzen gebruikt om cytokine niveaus te evalueren, kunnen andere technieken zoals real time kwantitatieve PCR (RT-qPCR) ook gebruikt als een aanvullende techniek.
Historisch doelcel doding door PBMC effector gebruikt radioactief gemerkt methoden (bijv 51Cr-afgifte assay). De werkwijze in dit rapport beschreven elimineert het gebruik van radioactiviteit en telt laden cellen met een fluorescerende kleurstof waarvan de aanwezigheid kan worden gecontroleerd door flowcytometrie. Een ander voordeel van de hierin beschreven werkwijze is dat het relatief snel en kunnen worden adapted om high-throughput testen. Aangezien de incubatietijd van target en effector cellen 5 uur, kan deze test in 8 uur voltooid. Dit in contrast met andere gepubliceerde methoden die zijn betrokken als ze isoleren van subtypes van PBMCs en activering / stimulering gedurende meerdere dagen vergen of analyse van NK cellen en K562 cellen conjugaten controleren cytotoxiciteit 17,18. Een ander voordeel van de huidige methode is dat het gecryopreserveerde PBMC direct als effectorcellen, die meer flexibiliteit biedt.
Samengevat beschrijven we verschillende assays om het effect van TLR-gemedieerde immuunrespons in brandbaar TPP behandelde PBMC, die gemakkelijk kunnen worden toegepast voor het testen van verschillende verbindingen vast te stellen. Het gebruik van gecryopreserveerde componenten kunnen aanzienlijke flexibiliteit, en samen met gevestigde technieken zoals flowcytometrie, CBA assays en ELISA, robuuste en consistente resultaten kunnen worden verkregen snel tussen verschillende labooratoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) in het kader van een gezamenlijk onderzoek overeenkomst met de Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad is een full-time medewerker van RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
