Abstract
Bland annat patofysiologiska förändringar, kronisk exponering för cigarettrök orsakar inflammation och immunsuppression, vilket har kopplats till ökad mottaglighet för rökare till mikrobiella infektioner och tumörincidens. Ex vivo suppression av receptormedierade immunsvar hos humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) behandlas med rökbeståndsdelar är en attraktiv metod för att studera mekanismer och bedöma de troliga långsiktiga effekterna av exponering för tobaksprodukter. Här, vi optimerade metoder för att utföra ex vivo-analyser som använder PBMC stimuleras av bakteriell lipopolysackarid, ett Toll-like receptor-4-ligand. Effekterna av hela rök-medium (WS-CM), var en brännbar tobaksprodukt beredning (TPP), och nikotin undersökts på cytokinutsöndring och målcellen dödande av PBMC i ex vivo-analyser. Vi visar att utsöndrade cytokiner IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 och IL-8 och intracellulära cytokiner IFN47 ;, TNF-α, och MIP-1α undertrycktes i WS-CM-exponerade PBMC. Den cytolytiska funktion effektorceller PBMC, som bestäms av en K562 mål celldödande analysen också minskas genom exponering för WS-CM; nikotin var minimalt effektiva i dessa analyser. Sammanfattningsvis presenterar vi en rad förbättrade analyser för att utvärdera effekterna av TPPS i ex vivo-analyser, och dessa metoder kan lätt anpassas för att testa andra produkter av intresse.
Introduction
En avsevärd mängd kunskap punkter för att de negativa hälsoeffekterna av kronisk rökning, inklusive hjärt-kärlsjukdom (CVD), kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) och cancer 1,2. Kronisk cigarettrökning har varit känt för att orsaka inflammation och immunsuppression, och dessa förändringar rapporteras att bidra till ökad risk för mikrobiell infektion och cancer hos rökare 3. In vitro och ex vivo tekniker är användbara för att belysa den molekylära grunden för de patofysiologiska effekterna av cigarettrök 4-9 (tabell 1) och redovisas som viktiga verktyg för att styra den framväxande regleringen av olika tobaksprodukter 10,11.
Till exempel har vi visat att brännbara produkt tobak (varje ny) såsom helhet rök-medium (WS-CM) och total partiklar (TPM) är långt mer cytotoxiska och skadarDNA än icke brännbara TPPS eller nikotin 12,13. I överensstämmelse med den publicerade arbete var det rapporterade nyligen att brännbara TPPS eller nikotin 12,13. I överensstämmelse med den publicerade arbeten, nyligen rapporterade vi att brännbara TPPS orsakat markant immunsuppression. Detta framgick av undertryckande av Toll- som receptor (TLR) -ligands, stimulerad cytokinutsöndring och målinriktad cell (K562) dödande av PBMC i en ex vivo-modell 14. Med tanke på betydelsen av inflammation i cigarettrök-inducerad sjukdomsprocesser, ytterligare optimering av analysförhållanden för att utvärdera de immunmodulerande effekter av cigarettrök som presenteras i denna rapport.
Ex vivo-analyser typiskt uppmätt intracellulära och utsöndrade cytokiner liksom den cytolytiska funktion av cytotoxiska T- och NK-celler i K562 celldödande analyser 14. Analyserna inblandade förinkubation med WS-CM och nikotin och efterföljande stimulering av PBMCs med TLR agonister under en period av 3 dagar; de slutliga avläsningar utförs med användning av enzymlänkade immunsorbentanalyser (ELISA) och / eller flödescytometri. Vi utnyttjade bakteriell lipopolysackarid (LPS), som binder till TLR-4-receptorer och stimulerar PBMC resulterande i produktion av intracellulära cytokiner och utsöndring av cytokiner. Utöver optimering av de olika analysstegen för utvärdering av de immunmodulerande effekterna av varje ny redovisar vi också förfaranden för isolering av PBMC, celldödsanalyser och IL-8 kvantifiering. Dessa metoder kan tillämpas för att ta itu med andra forskningsfrågor och ytterligare förfinas för att utvärdera tobaksvaror i regelverket.
Tabell 1. Publicerad rapporter om in vitro och ex vivo-metoder som används för att studera varilus patofysiologiska effekterna av förberedelser produkt tobak CS, cigarettrök mediet. CSC, cigarettrök kondensat; CSE, cigarettrök extrakt; ELISA, enzymkopplad immunabsorberande analys; GADPH, glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas; qPCR, kvantitativ polymeras kedjereaktion; RT, realtid kvantitativ polymeraskedjereaktion; TS, tobaksrök.
| Författare (Läses år) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Celler som används | Mänskliga bronkial endotelceller (BEAS-2B), humana neutrofiler | Mänskliga alveolära epitelceller (A549) | Mänskliga luftvägarnas glatta muskelceller (HASMC) | Mänskliga premonocytic U937-celler, humana monocyter | Alveolär typ II epitelceller (ATII) | Humant monocytiskcellinje (THP-1), humana lungmakrofager |
| TPP används | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Använd metod | ELISA, qPCR, migration, elektromobilitet skift | Immunohisto-kemi, elektrofores, Arrayscan kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elektrofores | Gel-mobility shift | Ljusmikroskopi, elektronmikroskopi, elektrofores, ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate kit (Sigma), p65 plattanalys (TRANSAM), elektrofores, olika immunanalyssatser |
| Åtgärd | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, migrering | Histon acetyltransferaser, histondeacetylaser, NF-kB, IL-8, pI KB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin | Värme chock / stressproteiner (HSP / Hsp70), HF transkriptionsfaktor, NF-kB,TNF-α | Tensidprotein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK-fosforylering, cJun: DNA-bindning, glutation, p65: DNA-bindning |
| Slutresultat | CSE nedreglerar cytokin produktion via undertryckande av AP-1-aktivering. | H2O 2 och CSC öka acetylering av histonproteiner, minskar histondeacetylasaktivitet, differentiellt reglera proinflammatoriska cytokiner release. | Cigarettrök kan orsaka utsläpp av IL-8 från HASMC, förstärks av TNF-α, 20% CSE mindre IL-8 release, Hämning av eotaxin och RANTES av cigarettrök. | TS aktiverad HF transkriptionsfaktor, som var förknippad med Hsp70 överuttryck och inhibering av NFkB-bindningsaktivitet och TNF-α frisättning. | Minskad ATII-cellerna kemokina nivåer kompromiss Alveolar reparation, bidrar till cigarettrök-inducerad alveolär skada och emfysem. | Data ger mekanistisk förklaring till varför rökare har ökat luftvägsinfektioner. Dämpning av den medfödda svar åtföljs av en ökning av IL-8. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: skriftligt informerat samtycke att göra denna studie erhölls vid en lokal klinisk forskningsenhet i IRB godkännande, per Good Clinical Practices. Bearbetning av blod, är isolering av PBMC och andra cellodlingsexperiment utförs under sterila förhållanden, med hjälp av mikrobiologiskt sterila leveranser och reagenser.
1. WS-CM Förberedelse
- Generera WS-CM som tidigare beskrivits 12.
- Förbered WS-CM genom att rök från fyra 3R4F referens cigaretter via Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium utan fenolrött med följande röka regim: 35-60-2, puff volym i ml, puff intervallet i sekunder, och puff varaktighet i sek, respektive. Varje preparat genererar en 20 ml prov.
- Etikett röret (s) med datum, tid klar, och cigarett namn och nummer. Lagra de 500 | il alikvoter vid -80 ° C omedelbart efter rökning är avslutad.
- Analysera portioner av frysta WS-CM Att bestämma nivåer av nikotin, tobaksspecifika nitrosaminer, och polycykliska aromatiska kolväten som tidigare beskrivits 12.
2. Isolering av PBMC
- Samla färskt blod från friska donatorer (som är icke-konsumenter av tobaksprodukter) Isolera PBMC från färskt blod som beskrivs nedan under ett separat godkännande från Wake Forest Baptist Health IRB 15.
- Före ankomsten av blodpåsen, har en 500 ml flaska, sax, isoleringsbuffert, och Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) (RT) redo i en skyddsnivå 2 (BSL-2) cellodling huven. Isolering buffert måste skyddas från ljus.
- Håll blodpåsen upp och ned och kapa röret strax under där det har fastklämd lämnar åtminstone 3 cm av slangen.
- Ta av locket från 500 ml flaska och håll röret ovanför flasköppningen. Plocka upp blodpåsen och vänd den så att blodet flöda fritt från påsen till than flaskan tills påsen är tom. Låt blodet att strömma på insidan väggen av flaskan kontra rakt ned för att inte skapa bubblor.
- Häll isolering buffert i flaskan på en 1: 5-förhållande av isolering buffert till blod. Cap flaskan ordentligt och vänd försiktigt det, end-over-end, 10 gånger. Lämna flaskan i cellodlings huven inkubera med belysningen, under 1 h vid RT.
- En lätt, halmfärgade lagret kommer att bygga upp ovanför blodet. Ta bort detta skikt med hjälp av en 25 ml serologisk pipett i 50 ml koniska rör. Den insamlade beloppet kan variera från 50 till 300 ml, beroende på motivet som donerat blod.
- Centrifugera rören vid 200 xg under 10 min vid RT.
- Aspirera genomskinliga supematanten, lämnar mörkt blod-färgad pellet. Pelleten blir lös men viskös.
- Pipettera 3 ml isoleringsbuffert till 15 ml koniska rör.
- Till återsuspendera pelleten, tillsätt 20 ml DPBS för varje 50 ml av halmfärgad vätska som samlats i sTEP 2.1.5. Vortex att blanda väl, och konsolidera omblandade injektionsvätskan från flera tuber. Denna vätska innehåller suspenderade blodkroppar.
- Med en överföring pipett över 5 ml av de suspenderade blodkropparna på 3 ml isoleringsbuffert i steg 2.1.8. Luta 15 ml koniska röret som innehåller cellsuspensionen långsamt och försiktigt för att skapa två separata lager. Centrifugera rören vid 400 xg under 40 min vid RT med minimal acceleration och utan broms.
- Använd en överföringspipett att avlägsna den resulterande grumliga mellanskiktet (buffy coat) innehållande PBMC i en 50 ml koniska rör. Undvik att dra andra tydliga skikt under den. Överlåta högst 25 ml i varje 50 ml koniska rör.
- Tillsätt 25 ml kallt rinnande buffert (eller mer för att fylla hela den återstående volymen av 50 ml koniska rör) för att tvätta cellerna. Centrifugera cellerna vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Resuspendera pelleten med 10 ml löpbufferten. Detta innehåller PBMC. Räkna celler och använda imdelbart eller plats på is för infrysning.
3. nedfrysning och upptining av PBMC
- Centrifugera PBMC som samlades in i steg 2.1.13 under 10 min vid 400 x g.
- Fyll frysning behållaren med isopropylalkohol enligt tillverkarens instruktioner. VARNING: Isopropylalkohol är brandfarligt och akut giftig.
- Resuspendera pelleten med RPMI 1640-medium (4 ° C) innehållande 20% fetalt bovint serum (FBS) och 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Detta är RPMI 1640 frysmedium. Resuspendera pelleten med en mängd av frysmedium som kommer att resultera i en suspension med ca 5 x 10 7 celler / ml. Antalet celler tillgängliga för frysning varierar.
- Fördela 1 ml portioner av cellsuspension i 2 ml kryorör och placera cryotubes i frysbehållaren. Placera frysbehållaren med cryotubes i en frys vid -80 ° C för att lagra O / N och sedan ta bort cryotubes och överföra att förvara i enkryogen frys mellan -150 ° C till -190 ° C.
- Avlägsna cryotube från kryogen lagring och tina den snabbt under försiktig omrörning i ett vattenbad vid 37 ° C.
- Överför omedelbart de tinade PBMC i cryotube in i en 15 ml koniskt rör med 10 ml RPMI 1640 komplett medium (4 ° C) innehållande 10% FBS, 1% Pen / Strep och 1% L-glutamin. Innehållet i den tinade cryotube bör överföras så snart som möjligt för att erhålla maximal cellviabilitet 15.
- Centrifugera PBMC vid 400 xg under 10 min.
- Resuspendera pelleten med 5 ml RPMI 1640 komplett medium och räkna cellerna.
- Mät cellviabiliteten genom etablerade metoder såsom trypanblått uteslutningsmetoden. Generellt cellviabiliteten med denna metod är omkring 90 till 95%. De PBMC är nu redo att använda i experiment.
4. Celldöd Fastställande
OBS: Späd anges här är för att denna study. De späd kan ändras i enlighet därmed.
- Späd WS-CM eller nikotin i en 96-brunnars platta med användning av RPMI komplett medium till en total volym av 100 | il / brunn, såsom anges nedan.
- Späd WS-CM till följande koncentrationer: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, och 5 | ig / ml equi-nikotin enheter (baserat på nikotininnehållet i WS-CM) 12.
- Späd nikotin i RPMI-medium till följande koncentrationer: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, och 3000 pg / ml. VARNING: Nikotin är akut giftigt och miljöfarligt.
- Lägg 100 pl av PBMC suspenderade i RPMI fullständigt medium till varje brunn vid en koncentration av 1 x 10 6 celler / brunn. Den totala volymen av celler plus WS-CM eller nikotin blir 200 | il / brunn.
- För ändamålet med denna studie, förbereda två uppsättningar av plattor som ovan. Täck plattorna och inkubera en platta under 24 h och en platta för 3 h vid 37 ° C och 5% CO2. Justera tidpunkter efter behov. Tvätta cellerna vid RT genom centrifugering vid 300 xg under 3 min, aspirera supernatanten, vortexa botten av plattan med glasskiva och slutligen återsuspendering celler med 200 | il iskall rinnande buffert, och upprepa tvättsteget en gång till.
- Lägg 95 pl av löpbufferten följt av 5 pl av 7-aminoactinomycin D (7AAD) till varje brunn för en total volym av 100 | il / brunn. Inkubera plattan i mörker vid RT i 15 min.
- Lägg 100 pl av löpbufferten till kluster rör. Överför hela volymen av cellsuspension från varje brunn i plattan till klustret rören och förvärva proverna på flödescytometer.
- Bestäm andelen 7AAD-positiva celler med användning av flödescytometri analysprogram.
5. EG 50 Fastställande
- De EG 50 värdena för WS-CM och nikotin bestäms av 7AAD-positiv färgning av PBMC.
- EC 50 värdet definieras som koncentration vid vilken 50% av cellerna var inte längre livsduglig i en 24 tim-analys, och värdena uttryckes som pg av equi-nikotin enheter / ml.
- Vid tillämpningen av denna studie, var EC 50 -värden bestämdes till 1,56 ng / ml och 1650 ng / ml för WS-CM och nikotin, respektive.
6. Utsöndrade Cytokiner
OBS: Späd anges här är för ändamålet med denna studie. De späd kan justeras i enlighet därmed.
- Späd WS-CM i en 96-brunnars platta med användning av RPMI komplett medium till en total volym av 100 ul / brunn vid en koncentration av 0,3, 1,56, 3, och 5 pg / ml equi-nikotin enheter.
- Späd nikotin till följande koncentrationer: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, och 3000 pg / ml. VARNING: Nikotin är akut giftigt och miljöfarligt.
- Lägg 100 pl av PBMC suspenderade i RPMI fullständigt medium till varje brunn vid en koncentration av 1 x 10 6 celler / brunn.Den totala volymen av celler plus WS-CM eller nikotin blir 200 | il / brunn.
- Täck plattan och inkubera i 3 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tvätta cellerna vid RT genom centrifugering vid 300 xg under 3 min, aspirera supernatanten, vortexa botten av plattan med glasskiva och slutligen suspendera cellerna med 200 | il iskall rinnande buffert och upprepning av tvättningssteget en gång till.
- Lägg 200 | il RPMI fullständigt medium, och upprepa tvättsteget en gång till.
- Lägg 200 pl av 10 pg / ml LPS-medium till varje brunn.
- Täck plattan och inkubera under 4 h, 24 h, 48 h, eller 72 h vid 37 ° C och 5% CO2. Justera inkubationstider behov.
- Centrifugera plattan vid 300 x g under 3 min.
- Ta 175 pl supernatant från varje brunn och förvara i en frys vid -80 ° C för att utföra analyserna i steg 7 och 8.
7. cytometrisk Bead Array Assay
<ol>8. IL-8-ELISA
- Tina cellsupernatanterna från steg 6,10 och användning i IL-8-ELISA. Utför ELISA-analys enligt tillverkarens instruktioner.
9. intracellulär färgning och flödescytometri
OBS: Späd anges här är för ändamålet med denna studie. De späd kan justeras i enlighet därmed.
- Späd WS-CM i en 96-brunnars platta med användning av RPMI komplett medium till en total volym av 100 ul / brunn vid en koncentration av 0,3, 1,56, 3, och 5 pg / ml equi-nikotin enheter.
- I samma platta, späd nikotin till följande koncentrationer: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, och 4000 pg / ml. VARNING: Nikotin är akut giftigt och miljö Hazarbelt.
- Lägg 100 pl av PBMC suspenderade i RPMI fullständigt medium vid en koncentration av 1 x 10 6 celler / brunn. Den totala volymen av celler plus WS-CM eller nikotin blir 200 | il / brunn.
- Täck plattan och inkubera i 3 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tvätta cellerna vid RT genom centrifugering vid 300 x g under 3 min, aspirera supernatanten, vortexa botten av plattan med glasskiva och slutligen återsuspendering celler med 200 | il iskall rinnande buffert, och upprepa tvättsteget en gång till.
- Lägg 200 | il RPMI fullständigt medium till plattan, och upprepa tvättsteget en gång till.
- Förbered verksamt koncentrationer av 2 ul / ml GolgiPlug och 10 | ig / ml LPS som använder RPMI komplett medium och tillsätt 200 | il till varje brunn.
- Inkubera plattan under 6 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Vid slutet av steg 9,8, tvätta cellerna med rinnande buffert (4 ° C) och centrifugering vid 300xg under 3 min vid 4 ° C.
- Lägg 100 pl av Cytofix till varje brunn och inkubera under 20 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna tre gånger såsom beskrivits i steg 9.9 med 1x Permwash (4 ° C) vid 300 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Lägg 45 mikroliter av 1x Cytoperm till varje brunn följt av 5 pl av var och en av en av följande antikroppar till varje brunn: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MlP-1α PE. Inkubera vid 4 ° C under 30 minuter.
- Tvätta cellerna två gånger såsom beskrivits i steg 9.9 med 1x Permwash (4 ° C) och en gång med rinnande buffert (4 ° C) vid 300 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Resuspendera cellerna med 200 ul av 2% paraformaldehyd (4 ° C). Överför celler till 12 × 75 mm rör, och proverna analyseras flödescytometer. VARNING: Paraformaldehyd är frätande, akut giftig och hälsovådlig.
10. K562 Killing analysen
OBS: K562-celler bör odlasi kultur vid 37 ° C och 5% CO2 med RPMI fullständigt medium tills de når 80% konfluens före analysen.
- Förbered en 5 mM karboxifluoresceindiacetat succinimidylester (CFSE) stamlösning genom att tillsätta 18 pl DMSO till flaskan.
- Späd WS-CM eller nikotin i en 96-brunnars platta med användning av RPMI komplett medium till en total volym av 100 pl / brunn för att uppnå de önskade equi-nikotin enheter eller nikotinkoncentrationer för varje brunn. VARNING: Nikotin är akut giftigt och miljöfarligt.
- Lägg 100 pl av PBMC in RPMI fullständigt medium vid en koncentration av 1,5 x 10 6 celler / brunn. Den totala volymen av celler med WS-CM eller nikotin blir 200 | il / brunn.
- Täck plattan och inkubera i 3 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tvätta K562-celler genom att tillsätta 10 ml DPBS och centrifugera vid 400 xg under 8 minuter vid RT.
- Resuspendera cellerna med 10 ml DPBS och räkna K562-celler.
- Förbered CFSE working-lösning genom att tillsätta en pl CFSE stamlösning till 1 ml DPBS.
- Tillsätt 1 ml av CFSE arbetslösning till 1 ml av K562 cellsuspension innehållande 1 - 2 x 10 7 celler. Skaka och inkubera exakt 2 min vid RT.
- Omedelbart till 200 pl av FBS. Skaka och inkubera exakt 2 min vid RT.
- Tillsätt 10 ml RPMI fullständigt medium och centrifugera röret vid 400 xg under 8 minuter vid RT.
- Avlägsna RPMI supernatanten och bryta pelleten och suspendera cellerna med 10 ml RPMI komplett medium och räkna CFSE-märkta K562-celler.
- Tvätta PBMC genom centrifugering av plattan vid 300 xg under 3 min vid RT. Aspirera supernatanten genom dekantering av vätskan. Sätt tillbaka locket och vortexblanda botten av plattan. Lägg 200 | il RPMI fullständigt medium och upprepa tvättsteg en gång till.
- Lägg CFSE-märkta K562-celler vid ett förhållande av 1:15 (100000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) till varje provbrunn av PBMC plattan och ytterligare Incubate för 5 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tvätta cellblandningen genom centrifugering vid 300 xg under 3 min vid RT. Aspirera supernatanten genom att kasta vätskan. Placera lock och vortexblanda botten av plattan.
- Lägg 200 l av rinnande buffert och upprepa tvättsteget beskrivs i steg 10,14 en gång.
- Lägg 95 pl av rinnande buffert följt av 5 pl av 7AAD till varje brunn för en total volym av 100 | il / brunn. Inkubera plattan i mörker vid RT i 15 min.
- Tillsätt 100 fil av rinnande buffert till varje brunn och överföra hela volymen av cellsuspension från varje brunn i plattan till klustret rören och förvärva proverna på flödescytometer.
- Bestäm andelen 7AAD-positiva och CFSE-positiva celler med användning av flödescytometri analysprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten presenteras som medelvärde ± standardfel av medelvärdet (fyra prover från givare). Studentens t-test mellan behandlade och obehandlade kontrollprover utfördes med Excel programvara samt t-test jämförelser för alla behandlingar med sina motsvarande kontroller. Den statistiska signifikans indikerades genom: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
För att mäta effekten av exponering för WS-CM och nikotin, var PBMC behandlades med olika koncentrationer av WS-CM och nikotin för 3 timmar eller 24 timmar. Celldöd mättes med robust och tillförlitlig 7AAD färgningsmetod, som 7AAD interkalerar i dubbelsträngade nukleinsyror och kan tränga cellmembran av döende eller döda celler 16. En dosberoende ökning av celldöd observerades med WS-CM vid 24 h, med en nära 80% celldöd detekterades vid 4 ug / ml equi-nikotin enheter (Figur 1A). En jämförbar grad av celldöd varnoterade endast vid 3000 ug / ml nikotin (Figur 1B). Eftersom vi utsätts PBMC under 3 timmar med WS-CM och nikotin för att bedöma deras inverkan cytokininduktion och förmåga att döda målceller, var det nödvändigt att fastställa om WS-CM orsakar betydande cytotoxicitet efter 3 h behandling. PBMC behandlades med 5 mikrogram / ml equi-nikotin enheter av WS-CM upplevde inte signifikant toxicitet (<5%, Figur 1A). Behandling med nikotin under 3 h orsakade mätbara (8%) celldöd endast vid 2000 | ig / ml (Figur 1B). Således gjorde exponering för WS-CM eller nikotin vid de angivna doserna och behandlingsperioder inte orsaka betydande cytotoxicitet under experimentella betingelser.
För att mäta de immunmodulerande effekter var PBMC stimulerades med LPS för olika tidsperioder, och de utsöndrade cytokiner mättes med CBA-analysen. För att optimera LPS stimulering tiden utsätts vi PBMC till LPS stimulering för 4 timmar, 24 tim, 48 tim, och 72 timmar, och utsöndrade cytokiner mättes. Till exempel, LPS stimulering under 24 timmar gav maximal utsöndring av cytokinerna IL-6 och IL-8 (Figur 2), och längre tidsperioder resulterade inte i ytterligare ökningar (IL-6) eller minskar (IL-8) i cytokin sekretion. Liknande resultat erhölls med andra utsöndrade cytokiner såsom IL-10, IL-1β och TNF-α (data ej visade).
Pilottidskursexperiment antydde att maximal produktion av cytokiner i svaren till TLR-4 stimulering genom LPS sker med 24 tim, och därmed, utsöndrades cytokiner mätt vid 24 tim i alla efterföljande experiment. Behandling med WS-CM och nikotin, följt av stimulering av TLR-4-receptorn med LPS, resulterade i en dosberoende minskning av utsöndrade cytokiner (Figur 3). Behandling med WS-CM gav kraftig minskning av IFN-γ (Figur 3A), TNF (Figur 3B), IL-10 (figur 3C </ Strong>) och IL-6 (fig 3D) vid låga equi-nikotin enheter (1,56 | ig / ml). Dämpning av cytokiner var också tydlig med nikotin. Men undertryckandet av cytokiner med nikotin inträffade vid betydligt högre doser, och graden av undertryckande varierade mellan enskilda cytokiner. Till exempel, verkade IFN-γ vara signifikant undertryckas med nikotin vid 50 | ig / ml, medan IL-6 undertrycktes vid den högsta koncentrationen (4 mg / ml) testas (Figurie 3D). Därefter mätte vi IL-8-nivåer i samma prover med användning av en ELISA-analys. IL-8-utsöndring effektivt undertryckt i WS-CM-exponerade PBMC; medan nikotin s undertryckande effekterna var signifikant vid 2 mg / ml (Figur 4).
Nivåerna av intracellulära cytokiner kvantifierades i WS-CM och nikotinbehandlade celler vid stimulering med LPS. Tidigare stimulerade vi PBMC under 3 dagar och sattes Golgiplug under de sista 6 h av inkubation för att mätaintracellulära cytokiner 14. Vi har nu minskat betydligt inkubationstiden genom att kombinera stimulering med LPS och Golgi plugg till totalt 6 timmar och mätte intracellulära cytokin-positiva celler (Figur 5). Figur 5 visar en dosberoende minskning av IFN-γ-positiva celler procent ( figur 5A), TNF-α-positiva celler (figur 5B) i både nikotin och WS-CM- exponerade PBMC, medan en dosberoende reduktion procent i MlP-1α-positiva celler (figur 5C) observerades i WS-CM -exposed PBMC. I denna analys observerade vi en minskning i antalet intracellulära cytokin-positiva celler efter exponering för WS-CM vid lägre equi-nikotin enheter (1,56 | ig / ml). Både utsöndrade cytokin och intracellulära cytokinanalyser visade liknande resultat i form av IFN-γ nivåer eller IFN-γ-positiva celler.
Som en funktionell åtgärd, förmågan hos WS-CM- och nikotinbehandlade PBMC att döda mål-K562 celler bestämdes. Figur 6A avbildar representativa flödescytometriska rådata från 7AAD-positiv färgning av målet (CFSE-märkta K562) celldöd genom kontroll, WS-CM-exponerade, och nikotinbehandlade PBMC. Siffrorna i rutan representerar procent 7AAD-positiva CFSE-märkta K562-celler. Exponering för 1,56 ng / ml WS-CM reducerade signifikant dödande förmåga effektorceller i PBMC jämfört med kontroll och de lägre doser. Nikotin behandling vid låga och höga doser interfererade inte med den celldödande. Figur 6B visar en dosberoende minskning i procent K562 celldödande från flera givare i ett enda experiment.
Figur 1. Celldöd av PBMC efter exponering för ökande koncentrationer av equi-nikotin enheter av WS-CM (^ g / ml) och nikotin (^ g / ml). (A) och med nikotin under 3 h och 24 h (B). Celldöd mättes genom 7AAD färgning. Varje punkt representerar medelvärdet ± SD Felstaplar av fyra donatorer från ett representativt experiment. Den statistiska signifikansen indikeras genom: * P <0,05; ** P <0,005, *** P <0,0005.
Figur 2. Utsöndring av IL-6 och IL-8 genom PBMC stimulerade med LPS vid olika tidpunkter. PBMC stimulerades med LPS under 4 h, 24 h, 48 h och 72 h. Nivåer av IL-6 och IL-8 cytokiner i cellkultursupernatanterna bestämdes med användning Human inflammatoriska cytokinet Kit (CBA-kit) och flödescytometri. Dessa data omfattar stänger medelvärdet ± SD fel från en av de två oberoende experiment med användning av PBMC från tre olika donatorer. Den statistiska significance indikeras genom: * P <0,05; ** P <0,005.
Figur 3. Reduktion av cytokinutsöndring genom PBMC behandlade med ökande koncentrationer av equi-nikotin enheter av WS-CM (^ g / ml) och nikotin (^ g / ml) efter LPS-stimulering. PBMC exponerades för olika koncentrationer av WS-CM och nikotin under 3 h och stimulerades med LPS under 24 h. Nivåer av IFN-γ (A), var TNF (B), IL-10 (C), och IL-6 (D) cytokiner i cellkultursupernatanterna bestämdes med användning av en Th1 / Th2 CBA-analys och flödescytometri. Dessa data representerar medelvärde ± SD felstaplar de från en av de tre oberoende experiment med PBMC från fyra olika givare. Den statistiska signifikansen indikeras genom: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Högre con koncentrationer av WS-CM var också statistiskt signifikant med *** P <0,0005.
Figur 4. Dämpning av IL-8-utsöndring genom PBMC behandlades med ökande koncentrationer av equi-nikotin enheter av WS-CM (^ g / ml) och nikotin (^ g / ml) efter LPS-stimulering. PBMC exponerades för WS-CM och nikotin, stimulerade med LPS i 24 h, och utsöndrade IL-8 mättes med ELISA. Dessa data representerar barer medelvärdet ± SD fel från en av de tre oberoende experiment med PBMC från fyra olika givare. Den statistiska signifikansen indikeras genom: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Högre koncentrationer av WS-CM var också statistiskt signifikant med *** P <0,0005.
.jpg "/>
Figur 5. Reduktion av intracellulära cytokin-positiva celler i PBMC som behandlats med ökande koncentrationer av equi-nikotin enheter av WS-CM (^ g / ml) och nikotin (^ g / ml). PBMC exponerades för varierande koncentrationer av WS-CM och nikotin under 3 h och stimulerades med LPS och Golgiplug för 6 tim. Fordonet kontroll för WS-CM och nikotin var RPMI komplett medium. Intracellulär IFN-γ-positiva (A), TNF-α-positiva (B), och MIP-1α-positiva (C) celler kvantifierades genom flödescytometri. Dessa data representerar barer medelvärdet ± SD fel från en av de fyra oberoende experiment med PBMC från fyra olika givare. Den statistiska signifikansen indikeras genom: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Högre koncentrationer av WS-CM var också statistiskt signifikant med *** P <0,0005.
Figur 6. Reduktion av PBMC mål dödande förmåga med exponering för ökande koncentrationer av equi-nikotin enheter av WS-CM (^ g / ml) och nikotin (^ g / ml). PBMC behandlades med angivna koncentrationer av WS-CM och nikotin för tre h, och CFSE-märkta K562-celler tillsattes sedan som målceller och inkuberades under ytterligare 5 h. Celler färgades med 7AAD och flödescytometri användes för att mäta döda förmåga. Figur 6A visar den representativa flödescytometri resultat med procent dödande visas i gated rutorna. Pilen indikerar minskad procent dödandet i 1,56 g / ml exponeras WS-CM. Figur 6B visar representativa medelvärde ± SD felstaplar från fyra oberoende experiment med PBMC från fyra olika givare. Den statistiska signifikansen indikeras av: ** P <0,005; *** P <0,0005. Högre koncentrationer av WS-CM var också statistiskt signifikant with *** P <0,0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi och andra har tidigare visat att behandling av PBMC med TPPS trycker flera svar, bland annat uttryck och utsöndring av cytokiner och funktionella åtgärder såsom målcellen dödade 14. De experimentella metoder som beskrivs i det tidigare arbetet kräver längre inkubationsperioder och var blygsam i storlek 14. Med tanke på de potentiella tillämpningar av denna attraktiva ex vivo modell för grundforskning och tillämpad forskning, undersökte vi om någon av de analysparametrar i dessa flerstegs biologiska analyser skulle kunna optimeras. Här presenterar vi förenklade metoder för att mäta TLR-förmedlade immunsvar med en TPP-behandlad ex vivo PBMC modell.
Isolering av livskraftiga PBMC är en viktig förutsättning för dessa ex vivo-analyser. Med tanke på den enskilde variabilitet och fysiologisk status i potentiella donatorer, det är perfekt att få PBMC som är lyhörd. För denna studie, vi isolerad PBMC från allmänt friska vuxna individer med hjälp av en tidigare publicerad metod 15. Vidare, i denna studie för att minimera variabiliteten mellan givarna, uteslutna vi de med allergier, infektioner, eller som tog några recept eller över disk läkemedel såsom acetylsalicylsyra. Dessutom är isolering av PBMC från nytaget blod önskvärd, eftersom det säkerställer en optimal livsduglighet och funktionalitet av cellerna i efterföljande experiment.
Tidigare metoder som används stimulering med TLR-agonister för 67-72 h för att mäta intracellulära cytokiner och utsöndrade cytokiner 14. Ett tidsförlopp av cytokinutsöndring i TLR-stimulerade celler (under kontrollbetingelser utan WS-CM eller nikotin) föreslog att maximal utsöndring förekom vid 24 tim. Dessutom vi kombinerat inkubation med TLR agonister och Golgiplug och minskat tiden för inkubation till totalt 6 h för att mäta intracellulära cytokiner. Även om detta krävs en separat analys för att mätacytokin-positiva celler, uppgifterna är mer robust jämfört med föregående metod 14. I överensstämmelse med de tidigare resultaten, WS-CM tryckte starkt induktionen av intracellulära och utsöndrade cytokiner. Således ledde dessa ändringar till väsentligt minskad analystider och gav mycket liknande resultat som de som beskrivs i litteraturen. Medan vi har utnyttjat flödescytometri och ELISA-metoder för att utvärdera cytokinnivåer kan andra tekniker såsom realtid kvantitativ polymerase chain reaction (RT-qPCR) också användas som ett kompletterande teknik.
Historiskt rikta celldöd genom effektor PBMC utnyttjade radiomärkta metoder (t.ex. analys 51 Cr-frisättning). Den metod som beskrivs i denna rapport eliminerar användningen av radioaktiviteten och sysselsätter lastning celler med ett fluorescerande färgämne vars närvaro skulle kunna övervakas med flödescytometri. En annan fördel med det beskrivna förfarandet häri är att det är relativt snabb och kan vara ADAPTEd till hög kapacitet analyser. Eftersom inkubationstiden för mål- och effektorceller är 5 tim, kan denna analys fyllas i 8 tim. Detta i kontraster med andra publicerade metoder, som är mer engagerade eftersom de kräver isolering av subtyper av PBMC och aktivering / stimulering under en period av flera dagar, eller analys av NK-celler och K562 cell konjugat för att övervaka cytotoxicitet 17,18. En annan fördel med den nuvarande metoden är att den använder frysförvarade PBMC direkt som effektorceller, vilket ger större flexibilitet.
Sammanfattningsvis beskrev vi flera analyser för att bestämma effekten av TLR-medierat immunsvar i brännbara TPP-behandlade PBMC, som kan tillämpas med lätthet för att testa olika föreningar. Användningen av frysförvarade komponenter möjliggör betydande flexibilitet, och tillsammans med etablerade tekniker såsom flödescytometri, CBA-analyser, och ELISA, robust och jämna resultat kunde erhållas snabbt över olika laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete är finansierat av RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) under ett forskningssamarbete avtal med Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad är en heltidsanställd för RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
