Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i Published: January 6, 2015 doi: 10.3791/52357
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 4, 4, 3, 4, 1
1Oxford Protein Production Facility, Research Complex at Harwell, 2Protein Crystallography Group, Ruhr University, 3MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge Biomedical Campus, 4Membrane Protein Laboratory, Diamond Light Source

Summary

En rationaliserad strategi för screening för uttryck av rekombinanta membranproteiner i Escherichia coli baserat på fusion till grönt fluorescerande protein presenteras.

Abstract

Produktionen av rekombinanta membranproteiner för strukturella och funktionella studier förblir tekniskt utmanande på grund av låga nivåer av uttryck och den inneboende instabilitet många membranproteiner gång löses i tvättmedel. Ett protokoll beskrivs som kombinerar tion oberoende kloning av membranproteiner som GFP fusioner med uttryck i Escherichia coli som upptäckts av GFP fluorescens. Detta möjliggör konstruktion och uttryck screening av flera membranprotein / varianter att identifiera sökande som är lämpliga för vidare investering i tid och ansträngning. GFP reporter används i en primär screening av expression genom att visualisera GFP fluorescens efter SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Membranproteiner som visar både en hög expressionsnivå med minimal nedbrytning såsom indikeras genom frånvaro av fritt GFP, väljs ut för en sekundär screening. Dessa konstruktioner skalas och totalt membranfraktion beredd och lösad i fyra olika tvättmedel. Efter ultracentrifuge att avlägsna tvättmedel-olösligt material, är lysat analyseras med fluorescensdetektion storleksuteslutningskromatografi (FSEC). Övervakning av storleksuteslutnings profilen genom GFP fluorescens ger information om mono-dispersiteten och integritet membranproteiner i olika tvättmedel. Protein: kombinationer rengöringsmedel som elueras med en symmetrisk topp med liten eller ingen fri GFP och minimal aggregation är kandidater för efterföljande rening. Med hjälp av denna metod, den heterologa uttryck i E. coli i SED (form, töjning, division, och sporulering) proteiner från 47 olika arter av bakterier analyserades. Dessa proteiner har normalt tio transmembrandomäner och är essentiella för celldelning. Resultaten visar att produktionen av SEDS ortologer i E. coli var mycket varierande med avseende på expressionsnivåerna och integriteten hos de GFP fusionsproteiner. Experimentet identified en delmängd för vidare undersökning.

Introduction

Det har uppskattats att membranproteiner svarar för cirka 20-30% av de gener kodade i alla sekvenserade genom en, inklusive det mänskliga genomet 2. Med tanke på deras avgörande roll i många biologiska processer, exempelvis transport av metaboliter, energiproduktion och som läkemedelsmål, det finns stort intresse i att bestämma deras tredimensionella struktur. Men jämfört med lösliga proteiner, membranproteiner är mycket underrepresenterade i Protein Data Bank. Faktum av de 99.624 släppt strukturer i det preliminära budgetförslaget ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) Endast 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) klassificeras som membranproteiner. Detta återspeglar de tekniska svårigheterna med att arbeta med membranproteiner som är naturligt uttrycks på relativt låga nivåer; rodopsin är en av några få undantag 3,4. Överuttryck av rekombinant versionsi heterologa celler resulterar ofta i felveckning och dålig inriktning till membranet som begränsar den totala produktionsnivån. Välja den bästa rengöringsmedel för utvinning och upplösning av ett membranprotein gång uttryckt gör efterföljande rening svårt och kräver noggrann optimering.

Escherichia coli är fortfarande den mest använda expressionsvärd för membranproteiner som svarar för 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) av strukturer löste hittills som är nästan uteslutande från bakteriella källor. Specifik E. coli-stammar, C41 (DE3) och C43 (DE3), har isolerats som inte leder till överuttryck av membranproteiner och därmed undvika effekterna av toxicitet observerats för andra BL21 stammar 5,6. Tuning nivån av rekombinant membranproteinuttryck verkar vara avgörande för att optimera produktionsnivån 6,7.

6-8. Därför är det viktigt med en metod för expression screening av multipla membranproteiner parallellt. En vanligen använd metod är att fusera proteinet till grönt fluorescerande protein (GFP) som möjliggör uttryck som ska spåras utan behovet att rena proteinet. På så sätt kan information om uttrycksnivå, stabilitet och beteende i olika tvättmedel bedömas med små mängder un-renat material 9-12.

I den här artikeln beskriver vi en strömlinjeformad protokoll för kloning och uttryck screening av membranproteiner i E. coli använder fusion till GFP som reporter för produktion och efterföljande karakterisering av tvättmedel: protein complexes (Figur 1).

Protocol

1. Konstruktion av expressionsvektorer

  1. Använd PCR Infusion kloning att bygga upp till 96 uttryckningsplasmider parallellt med hjälp av vektor pOPINE-3C-GFP och Popin-N-GFP som lägger antingen klyvbara C-terminala eller N-terminala GFP-His6 fusioner till sekvenserna 13 respektive.
    Obs: Valet av vektor bestäms av topologin av proteinet eftersom GFP behöver uttryckas i cytosolen, sålunda för ett protein med ett cytosoliskt N-terminalen och den extracellulära C-terminalen vi skulle använda popin-N-GFP och för en extracellulär N-terminalen och cytosolisk C-terminalen i vi skulle använda pOPINE-3C-GFP. Om båda ändarna är cytosoliskt skulle vi använda pOPINE-3C-GFP såvida det inte finns funktionellt skäl inte att märka C-terminalen.
  2. Förstärka DNA-sekvenser som kodar för membranproteiner med primers innehåller följande tillägg visas:
    pOPINE-3C-GFP (Forward primer - AGGAGATATACCATG, Omvänd primer - CAGAACTTCCAGTTT) och Popin-N-GFP (Forward primer - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG, Omvänd primer - ATGGTCTAGAAAGCTTTA).
  3. Analysera PCR-reaktionen genom agarosgelelektrofores. När rena PCR-produkter har erhållits, tillsätt 5 U Dpnl till varje brunn (make up 5 fil 1x Dpnl reaktionsbuffert). Rena PCR-produkter med användning av magnetiska pärlor i en 96-brunnsformat.
    OBS: Dpnl läggs till avlägsna mall vektor; detta steg är inte nödvändigt om genomiskt DNA används som templat.
  4. Tillsätt 1 l (100 ng) av den lämpliga linjäriserade vektorn till varje brunn i en PCR-platta.
  5. Med hjälp av en flerkanalspipett add x il renat PCR infoga till lämpliga brunnar av PCR plattan. Se till att alla produkter är i intervallet 10-250 ng.
  6. Lägg till (9-x) il vatten till brunnen och överföra hela 10 pl till ett rör innehållande det torra-ner in-fusionsreagens. Låt stå i 30 sek.
  7. Blanda innehållet i korthet genom att pipettera upp och ned. Överföringreaktionerna tillbaka till den ursprungliga PCR-platta och sigill.
  8. Inkubera under 30 minuter vid 42 ° C i en termocykler.
  9. Överför omedelbart reaktionerna till is så snart reaktionen är fullbordad och tillsätt 40 pl TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
  10. Frys på en gång eller omvandlas till kompetenta celler. För transformation, använd 3 pl av den utspädda reaktions per 50 ^ alikvot av hög kompetens (> 5 x 10 9 transformanter / ug) kompetent E. coli-celler.
  11. Tillsätt 1 ml LB-agar kompletterad med 50 | ig / ml karbenicillin per brunn i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta (för kloning, förbereda brunnarna under 2 x antal konstruktioner).
  12. Efter utväxt, Efter utväxt platta ut 25 | il och 25 pl av en 1 i 5 spädning av kulturen har laddats in i agar innehållande 24-brunnars vävnadskulturplattor.
  13. Sprid cellerna genom att försiktigt luta plattan.
  14. Torka plattan med locket av under 10-15 min vid 37 ° C eller i en flow huva vid rumstemperatur.
  15. Sätt tillbaka locket och vrida plattan upp och ned och inkubera över natten vid 37 ° C.
  16. Plocka två kolonier och mini-prep vektor.
  17. PCR verifiera konstruktioner med hjälp av konstruktionen specifika omvända primer och en vektor specifik framåt primer (t.ex. pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).

2. Transformation av E. coli E Xpression Stammar

Obs: Innan du utför detta protokoll, E. coli kompetenta celler görs, alikvoterades och lagrades fryst vid -80 ° C såsom beskrivits tidigare 13. Membranproteinuttryck rutinmässigt screenas i två stammar, Lemo21 (DE3) och C41 (DE3) pLysS. För att underlätta tolkningen av resultaten kan det vara till hjälp att inkludera en positiv kontroll, t ex en plasmid som uttrycker GFP eller ett membranprotein fuserat till GFP kända för att uttrycka och en tom vektor negativ kontroll.

  1. Tina aliquotted E. coli på is. Lägg 3 pl mini-förberedd expressionsplasmid till varje portion av kompetenta celler.
  2. Inkubera blandningen på is i 30 minuter.
  3. Värmechockpromotorer cellerna under 30 sek vid 42 ° C.
  4. Låt cellerna att återhämta sig på is i 2 min och sedan lägga 300 ìl av makt buljong till varje rör.
  5. Inkubera i 1 timme i en 37 ° C statisk inkubator.
  6. Förbered LB agar i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta, kompletterat med 50 | ig / ml karbenicillin och 35 | ig / ml kloramfenikol. Lägg ramnos till en slutlig koncentration av 0,25 mM till brunnarna innehållande Lemo21 (DE3).
    Obs: Om produkten kommer sannolikt att vara giftiga brunnarna innehåller C41 (DE3) pLysS kan kompletteras med 1% (vikt / volym) glukos.
  7. Överför 30 ìl av celler från omvandlingen blandningen på LB-agarplattor. Sprid och torka plattan enligt beskrivningen i 1,13-1,15.

3. Beredning av natten startkulturer

OBS: förbereda alltid övernattkulturer dagen efter omvandlingen aldrig från en gammal omvandling platta.

  1. Lägg 0,7 ml effekt buljong till varje brunn i en 96-brunnars djupbrunnsplatta kompletterat med 50 | ig / ml karbenicillin och 35 | ig / ml kloramfenikol. Lägg ramnos till brunnarna innehållande Lemo21 (DE3) till en slutlig koncentration av 0,25 mM. Eventuellt komplettera C41 (DE3) pLysS med 1% (vikt / volym) glukos; se ovan (2.6 anmärkning).
  2. Välj en koloni från övernattningstransformationsplattorna i varje brunn. Täta blocket med ett gaspermeabelt tätning.
  3. Skaka blocket vid 250 rpm i en inkubator med en stor kast (t.ex. en 25 mm bana) eller vid 600 rpm i en inkubator med en liten kast (t.ex. en 4,3 mm bana) vid 37 ° C över natten.

4. Tillväxt och Induktion av kulturer

  1. Tillsätt 3 ml effekt buljong kompletterad med 50 pg / ml karbenicillin och 35 | ig / ml kloramfenikol till varje well av 24-brunnars djupbrunnplatta. Lägg L-ramnos (och glukos) som beskrivs i avsnitt 3.1. Använd 3 ml odlings att tillåta avverkning i två exemplar och möjliggöra viss avdunstning av vatten genom gaspermeabla förseglingen.
  2. Sätt upp expressionskulturer genom tillsats 150 pl av Lemo21 (DE3) eller C41 (DE3) pLysS nattskulturer till varje brunn i de 24-brunnars djup well block.
  3. Skaka blocken vid 37 ° C tills den genomsnittliga OD vid 595 nm är ~ 0,5 genom plattan.
  4. Inducera expression genom tillsats av IPTG till kulturerna till en slutlig koncentration av 1,0 mM IPTG.
  5. Odla kulturer över natten (18-20 h) med skakning vid 20 ° C.

5. Analys av Expression av In-gel fluorescens

  1. Skörd i duplikat. Överför 1 ml av kultur från varje brunn i en fyrkant väl, konisk botten, 96-håls djup väl blocket.
    Anm: Skörd i duplikat i händelse av brott av blocket eller att tillåta testning av ett alterve diskmedel om så önskas.
  2. Täta blocken och skörda cellerna genom centrifugering vid 6000 xg under 10 minuter.
  3. Vänd blocket och dekan media. Knacka blocket försiktigt på en pappershandduk för att dränera återstående media.
  4. Täta plattorna och förvara vid -80 ° C under minst 20 min. Eventuellt lämna experimentet vid denna punkt och blocket bearbetas när det passar.
  5. De-frost pellets i 20 minuter vid rumstemperatur.
  6. Använd antingen en multikanalpipett eller en orbitalskakare (1000 rpm under 10 min) vid 4 ° C för att resuspendera cellerna helt i 200 | il lysbuffert (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl 10 mM Imidazol 1% volym / volym Tween 20, justera pH till 8,0 med användning av NaOH).
  7. Lägg 20 ul av DLPI lösning (20 | il DNasI (4000 enheter / ml), 20 mg lysozym och 20 | il proteasinhibitorcocktail i en slutlig volym av 2 ml vatten). Inkubera i 10 minuter med skakning (~ 1000 rpm) vid 4 ° C.
    8. n -Dodecyl β-D-maltosid (DDM).
  8. Inkubera under 60 min med skakning (~ 1000 rpm) vid 4 ° C.
  9. Centrifugera djupbrunnsblock vid 6000 xg under 30 min vid 4 ° C.
  10. Överför 10 ul av den klarnade lysatet till en mikrotiterplatta och tillsätt 10 | il av SDS-PAGE-gel-laddningsbuffert (100 mM Tris, pH 6,8, 4% vikt / volym SDS, 0,2% vikt / volym bromfenolblått, 10% volym / volym β merkaptoetanol, och 20% vol / vol glycerol). VARNING! Koka inte provet.
  11. Belastning 10 pl av prov från steg 5,11 / brunn på SDS PAGE-gel (er) och kördes vid 100-120 V (konstant spänning) i ett kallt rum tills färgen når botten (2-2,5 h).
  12. Placera gelen på en imager (t.ex. med en blå-ljusfilter för att upptäcka de GFP fusionsproteiner). Exponeringstiden är valt för att säkerställa att de ljusaste banden inte är mättade.

6. Uppskalning of Cell Cultures

  1. Förvandla en delmängd av kompetent
  2. Välj en koloni i 10 ml av makt buljong (kompletterad som beskrivs i avsnitt 3) och växa över natten vid 37 ° C.
  3. Späd 5 ml av natten kultur i 500 ml ström buljong.
  4. Väx med skakning vid 250 rpm vid 37 ° C tills OD vid 595 nm är ~ 0,5.
  5. Inducera expression genom att tillsätta IPTG till en slutkoncentration av 1,0 mM.
  6. Väx över natten med skakning vid 250 rpm vid 20 ° C.
  7. Skörda cellerna genom centrifugering vid 5000 xg under 15 min.
  8. Släng supernatanten. Cellpellettar kan lagras vid -80 ° C.

7. Beredning av membran

  1. Tina celler (om så är nödvändigt) vid rumstemperatur och återsuspendera i 1 x PBS, pH 7,5 vid en volym av 5 ml per gram cellpellet; Öka volymen vid behov tills viskositeten minskar till en rinnande konsistens. Lägg MgCl2 till en slutlig koncentration av 1 mM, DNAs I till slutlig koncentration av 10 | ig / ml och enfärdigförpackade proteashämmare tablett per 20 g cellpellet. Break öppna celler med användning av en kyld cell disrupter vid ett tryck av 30 kpsi.
  2. Pelletera obrutna celler och rester vid 30000 g under 15 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett ultracentrifugeröret.
  3. Samla upp den totala membranfraktionen genom att spinna ned supernatanten i en ultra-centrifug vid 200.000 xg under 1 h vid 4 ° C.
  4. Kassera supernatanten.
  5. Återsuspendera membran pelleten i iskall 10 ml PBS pH 7,5 med användning av en cellhomogenisator. 1 ml återsuspenderade membran krävs för varje tvättmedel. Eventuellt, i detta skede, blixt frysa membransuspensionen i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.

8. Solubilisering och Analys av membranfraktionen

  1. Tina membranfraktion (om nödvändigt), och för varje tvättmedel som skall användas för solubilisering, alikvot 900 pl av membransuspension i ett 1,5 ml polyallomer mikrocentrifugeGE röret.
  2. Lägg 100 | il av varje nyframställd tvättmedel (10% vikt / volym lösningar av DDM, DM, Cymal-6 och LDAO) till en slutlig koncentration av 1% till den angivna 1,5 ml rör. För solubilisering av eukaryot membranproteiner kolesterolhemisuccinat (0,2% slutlig koncentration) kan tillsättas till tvätt- och rengöringsmedel.
  3. Inkubera blandningarna vid 4 ° C under 1 h med mild omröring.
  4. Pellets detergenten olösliga fraktionen med en bänkultracentrifug, som säkerställer rör är åtminstone halvfull, vid 150000 g vid 4 ° C under 45 min och bibehålla supernatanten.
    Obs: Effektiviteten av tvättmedel lösningsgörande kan uppskattas med hjälp av en fluorescerande plattläsare genom att mäta GFP fluorescens av de upplösta membran med tvättmedlet olösliga fraktionen suspenderades i samma volym PBS.
  5. Analysera mono-dispersiteten av olika rengöringsmedel: membranproteinkomplex med hjälp fluorescens-detekterade gelkromatografi (FSEC).
  6. För FSEC analys jämvikta en storleksuteslutningskolonn med ett brett fraktioneringsområde, t ex 5000 till 5.000.000 i molekylvikt, med rinnande buffert (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) vid en flödeshastighet av 0,3 ml / min . Använd denna buffert för alla prover, dvs det är inte ändras för varje testad diskmedel.
  7. Injicera 100 pl av solubiliserade membraner på kolonnen med en flödeshastighet av 0,3 ml / min. Övervaka elueringsprofil använder fluorescensoptik (excitation vid 488 nm och emission vid 512 nm). Om en infogad fluorescens bildskärm inte är tillgänglig, samla fraktionerna och läs fluorescens i en plattläsare.
  8. Importera elueringsvolym och fluorescensintensitet data till ett kalkylprogram för grafisk display.
  9. Analysera återstående solubiliserade membranmaterial genom in-gel fluorescens som beskrivs i avsnitt 5.

Representative Results

Den SEDS familj av proteiner (form, töjning, division, och sporulering) är avgörande för bakterie celldelning. Dessa integrerade proteiner har normalt tio transmembrandomäner med både amino- och karboxitermini inuti cellen. För att exemplifiera det protokoll som beskrivits ovan, var 47 SEDS ortologer klonas in i vektorn pOPINE-3C-EGFP. En liten skala expressions skärm av konstruktionerna genomfördes i två E .coli-stammar, Lemo21 (DE3) odlades i närvaro av 0,25 mM ramnos blockera läckande uttryck och C41 (DE3) pLysS, som rutinmässigt används för uttrycket av membran proteiner 5-8.

Detergent solubiliserades lysat av inducerade kulturer analyserades med SDS-polyakrylamidelektrofores. Använda i-gel fluorescens att visualisera uttryckta GFP fusionsproteiner visade att mellan de två stammarna 38 av de 47 SEDS konstruktioner producerades. Intressant det fanns skillnader mellan de två uttrycks stammarna. Av de 38 uttryckt konstruktioner, endast 18 producerades i båda stammarna, 14 endast uttryckt i Lemo21 (DE3) och 6 endast i C41 (DE3) pLysS. Sammantaget var det en större framgång för Lemo21 (DE3) jämfört med C41 (DE3) pLysS (38 vs 24). Men iakttagelsen att vissa proteiner verkade vara stamspecifik innebär att screening både är användbart.

Representativa data för 24 av de 47 SEDS konstruktioner visas i figur 1. Intensiteten av banden ger en indikation på nivån av uttryck, t.ex. fusionsproteinet i väl C4 i figur 1A och 1B uttrycks väl i båda stammarna dock ytterligare lågmolekylära banden tyder på att proteinet är delvis försämrad. I många körfält finns ett band som motsvarar i storlek till GFP ensam. En kvalitativ bedömning av integriteten av proteinet kan utföras genom att titta på intensiteten av fusionsprotein i förhållande till den fria GFP;t.ex. G4 och H4 är helt bryts ned till fritt GFP i C41 (DE3) pLysS (Figur 1B) medan det i Lemo21 (DE3) finns en viss intakt protein (Figur 1A). För 14 av de 38 uttryckta proteinerna intensiteten av den fria GFP bandet är liknande till det av fusionsproteinet, för 21 intensiteten av den fria GFP bandet är större än den för fusionsproteinet och en minoritet av fusionsproteinerna (3 / 38 uttryckt) t.ex. F6 och G6 i fig 1A har relativt liten fri GFP jämfört med fusionsproteinet.

Två av de konstruktioner som uttryckte bra i primära skärm B5 (högintensiva band gratis GFP och fusionsproteiner) och G6 (lite fritt GFP) uttrycktes och totalt membranfraktion framställt från 500 ml cellkultur. Resuspenderade membran uppdelades i alikvoter och analyserades genom fluorescens-detekterad storleksuteslutande kromatografi (FSEC). De FSEC profilerna presenteras i Figure 2A och 2B respektive och visar att de två SEDS proteiner beter sig annorlunda i de fyra tvättmedel testade. I ett fall (Figur 2A: prov B5) proteinet gav bara en symmetrisk topp med lite aggregering i DDM som därför skulle vara tvättmedlet i valet för efterföljande rening. Däremot den andra fusionsprotein (Figur 2B: prov G6) gav en liknande profil i alla tvättmedel testade.

Figur 1
Figur 1: Diagram över arbetsflöde för screening membranproteinuttryck i E. coli med hjälp av en GFP reporter.

Figur 2
Figur 2: Primär skärm av membranproteinuttryck med användning av i-gel-fluorescens. E. coli-celler analyserades med SDS-PAGE och geler avbildas med Blå Epi belysning och ett 530/28 filter. Resultaten visas i 24 konstruktioner (märkta A4-H6 baserat på deras position i en 96-brunnar). Positionerna för banden för fri GFP och GFP-fusionsproteiner är indikerade. (A) Proteiner uttryckta i Lemo21 (DE3). (B) Proteiner uttryckta i C41 (DE3) pLysS.

Figur 3
Figur 3:. Sekundär skärm av membranproteinuttryck med användning av fluorescens-detekterad storleksuteslutande kromatografi (FSEC) Totala membranfraktioner extraherades i fyra olika detergenter och de solubiliserade membranproteiner analyserades genom storlekssorterande kromatografi med användning av ett FPLC-system kopplat till en fluorescensdetektor. FSEC profiler för (A) membranprotein B5 och (B)

Discussion

I det protokoll som beskrivs i den här artikeln, är ligation oberoende kloning i en GFP reporter vektor kombination med fluorescensdetektion för att snabbt screena det relativa uttrycket av flera membranproteiner i E. coli. Vektorer kan göras i fyra arbetsdagar med primär uttryck screening tar ytterligare en vecka. I-gel fluorescens av detergentlysat av hela celler används för att rangordna uttryck träffar för vidare analys i en sekundär skärm. Den primära expressions skärm som presenteras inte kräver någon specialutrustning förutom en skakinkubator lämplig för odling av celler i djupa well block. Alla andra vätskehanterande involverar 96-brunnars SBS plattorna kan utföras med användning av multikanalpipetter. Protokollet kan lätt ändras för att inkludera andra E. coli-stammar odlas under olika uttrycksförhållanden (t.ex. lägre temperatur). I fallet med den LEMO21 (DE3) titrering av den nivå av ramnos (0-2,0 mM)tillsatt modulera transkriptionshastigheten kan öka nivån av uttryck av vissa membranproteiner 7. Andra än DDM Rengöringsmedel kan användas för utvinning i den primära skärmen men hårdare tvättmedel kan lösa proteiner från inklusionskroppar och därmed ge falska positiva. Tydligt, desto mer utarbeta startskärmen blir, desto mer tidskrävande experimentet.

Den sekundära skärm innebär förbereder en total membranfraktion från uttrycket hits som identifierats i den primära skärmen. Detta är ett kritiskt steg eftersom det kommer att bekräfta lokaliseringen av fusionsproteinerna till membranet av E. coli-celler. Efterföljande extraktion av GFP-fusionsproteinet i olika detergenter övervakas genom fluorescens-detekterad storleksuteslutningskromatografi av solubiliserade materialet för att bedöma mono-dispersitet av detergent-protein-komplex. Detta är ytterligare ett viktigt steg eftersom det identifierar den mest lämpliga tvättmedel försolubilisering av membranprotein för efterföljande nedströms bearbetning. Erfarenheten visar dock att ytterligare optimering av valet av tvättmedel (s) fortfarande kan krävas under rening och kristallisering. Bevis på enhetligt beteende i olika rengöringsmedel inklusive de med en relativt liten micell storlek (t.ex. LDAO) verkar vara bra indikator på en benägenhet att bilda väl brytande kristaller åtminstone för prokaryota membranproteiner 14. I detta avseende den profil som visas för membranprotein i figur 2B visas mycket god.

Den främsta fördelen med att använda en GFP reporter är att den ger en snabb avläsning av uttryck i un-renade prover. En nackdel är att GFP fusionsproteinet måste avlägsnas under reningen av proteinet för kristallisation. I fallet med de vektorer som används här, en rhinovirus 3C proteasstället möjliggör klyvning av GFP. Alternativt är det okompliceratatt åter-klon kandidatproteiner, som identifierats i skärmen, i vektorer som bara lägger ett polyhistidin eller annan affinitetsmarkör för efterföljande rening. Detta förutsätter att fusion till GFP är inte nödvändigt för uttryck. Huvud alternativ till att använda fusion till GFP för detektion av membranproteinuttryck och solubiliseringen är att lägga bara histidinmärkning. Emellertid detta tillvägagångssätt kräver typiskt börjar med en membranfraktion 15, som för utvärdering av många varianter skulle bli mycket tidskrävande.

Sammanfattningsvis är det huvudsakliga syftet med det protokoll som beskrivs i den här artikeln för att möjliggöra ett stort antal membranprotein sekvensvarianter att snabbt utvärderas vad gäller uttryck och tvättmedel lösningsgörande och prioriteras för djupare analys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pOPIN-N-GFP addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS Lucigen (http://lucigen.com/) 60444-1
LEMO21(DE3) New England Biolabs C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns Clontech/Takara 639688
Power broth Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets Roche 11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail  Roche 11836170001
L-Rhamnose monohydrate Sigma-Aldrich 83650
Protease Inhibitor Cocktail  Sigma-Aldrich P8849
DNAse 1 Sigma-Aldrich DN25
Lysozyme Sigma-Aldrich L7651
Cholesterol hemisuccinate Sigma-Aldrich C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) Anatrace C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside) Generon D97002
DM (n-Decyl β-maltoside) Generon D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) Generon D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl Thermo Scientific  4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer Anachem LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS Anachem L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip Anachem L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks Porvair sciences 360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard Life Technologies LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well Life Technologies WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell Life Technologies WR0100
Vibramax 100 Heidolph 544-21200-00
Tension rollers attachment Heidolph 549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor Beckman Coulter 393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor Beckman Coulter 393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors  Beckman Coulter B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column GE Healthcare 17-5172-01 
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm Shel Lab  SSI5R-HS
Innova44R incubator New Brunswick /Eppendorf Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) Constant systems PL083016
L-Rhamnose monohydrate Sigma 83650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).
  3. Okada, T., et al. X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles. J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).
  4. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
  5. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  6. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  7. Schlegel, S., et al. Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3). J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).
  8. Chun, E., et al. Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. Structure. 20 (6), 967-976 (2012).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).
  11. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  12. Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).
  13. Busso, D., et al. Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study. J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).
  14. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  15. Low, C., et al. High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).

Tags

Mikrobiologi membranproteiner grönt fluorescerande protein fluorescensdetektion, Uttryck screening
Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bird, L. E., Rada, H., Verma, A.,… More

Bird, L. E., Rada, H., Verma, A., Gasper, R., Birch, J., Jennions, M., Lӧwe, J., Moraes, I., Owens, R. J. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (95), e52357, doi:10.3791/52357 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter