Summary
En strømlinjeformet tilnærming til screening for ekspresjon av rekombinante membranproteiner i Escherichia coli basert på fusjon til grønt fluorescerende protein blir presentert.
Abstract
Produksjon av rekombinante membranproteiner for strukturelle og funksjonelle studier forblir teknisk utfordrende på grunn av lave nivåer av ekspresjon og den iboende ustabilitet av mange membranproteiner gang oppløst i vaskemidler. En protokoll er beskrevet som kombinerer ligation uavhengig kloning av membran proteiner som GFP fusjoner med uttrykk i Escherichia coli oppdaget av GFP fluorescens. Dette gjør at konstruksjonen og screening av flere membran protein / varianter å identifisere kandidater som er egnet for videre investering av tid og krefter. GFP reporter anvendes i en primær skjermen av ekspresjon ved å visualisere GFP fluorescens etter SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). Membranproteiner som viser både et høyt ekspresjonsnivå med minst mulig tap som indikert ved fravær av frie GFP, er valgt for en sekundær skjerm. Disse konstruksjoner blir skalert og en total membranfraksjon fremstilt og oppløseliggjøred i fire forskjellige vaskemidler. Etter ultrasentrifugering for å fjerne detergent-uoppløselig materiale, er lysatene analysert ved fluorescens deteksjon størrelseseksklusjons-kromatografi (FSEC). Å overvåke størrelsen utelukkelse profil av GFP fluorescens gir informasjon om mono-dispersitet og integriteten til membran proteiner i ulike vaskemidler. Protein: kombinasjoner vaskemiddel som eluer med en symmetrisk topp med liten eller ingen fri GFP og minimum aggregering er kandidater for påfølgende rensing. Ved hjelp av den ovennevnte metode, den heterologe ekspresjon i E. coli av SED (form, forlengelse, divisjon, og sporulering) proteiner fra 47 forskjellige arter av bakterier ble analysert. Disse proteiner har typisk ti transmembrandomener og er essensielle for celledelingen. Resultatene viser at produksjonen av SEDS orthologues i E. coli var svært variabel med hensyn til uttrykket nivåer og integriteten av de GFP-fusjonsproteiner. Eksperimentet jegdentified en undergruppe for videre etterforskning.
Introduction
Det har blitt anslått at membranproteiner utgjør omtrent 20-30% av gener kodet i alle sekvenserte genomer 1, inkludert den humane genom 2. Gitt deres avgjørende rolle i mange biologiske prosesser, for eksempel transport av metabolitter, energiproduksjon og som narkotika mål, er det stor interesse i å bestemme deres tredimensjonale struktur. Men i forhold til løselige proteiner, membranproteiner er svært underrepresentert i Protein Data Bank. Faktisk av de 99 624 frigitte strukturer i PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) bare 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) er klassifisert som membran proteiner. Dette gjenspeiler de tekniske vanskelighetene med å jobbe med membran proteiner som er naturlig uttrykt ved relativt lave nivåer; rhodopsin er en av noen få unntak 3,4. Over-uttrykk av rekombinant versjons i heterologe celler resulterer ofte i misfolding og dårlig målretting til membranen som begrenser den totale produksjonsnivå. Velge den beste vaskemiddel for utvinning og oppløsning av en membran protein gang uttrykt gjør påfølgende rensing vanskelig og krever forsiktig optimalisering.
Escherichia coli er fortsatt det mest brukte uttrykket vert for membran proteiner står for 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) av strukturer løst til dato som er nesten utelukkende fra bakteriekilder. Spesifikk E. coli-stammer, C41 (DE3) og C43 (DE3), har blitt isolert som ikke fører til overuttrykk av membran proteiner og dermed unngå virkningene av toksisitet observert for andre BL21 stammer 5,6. Innstiller nivået av rekombinant membranprotein ekspresjon synes å være kritisk for å optimalisere produksjonsnivået 6,7.
6-8. Derfor er en fremgangsmåte for ekspresjon screening av multiple membranproteiner i parallell avgjørende. En ofte brukt metode er å smelte proteinet til grønt fluorescerende protein (GFP) som muliggjør ekspresjon som skal spores uten behov for å rense proteinet. På denne måte kan informasjon om ekspresjonsnivået, stabilitet og oppførsel i forskjellige vaskemidler vurderes med små mengder av en ikke-renset materiale 9-12.
I denne artikkelen beskriver vi en strømlinjeformet protokoll for kloning og ekspresjon screening av membranproteiner i E. coli ved hjelp av fusjon til GFP som reporter for produksjon og påfølgende karakterisering av vaskemiddel: protein complexes (figur 1).
Protocol
1. Bygging av ekspresjonsvektorer
- Bruk PCR Infusion kloning å bygge opp til 96 ekspresjonsplasmidene parallelt ved hjelp av vektorer pOPINE-3C-GFP og Popin-N-GFP som legger enten spaltbare C-terminal eller N-terminale GFP-His6 fusjoner til sekvensene 13 henholdsvis.
Merk: Valget av vektor er diktert av topologien av proteinet siden GFP trenger å bli uttrykt i cytosol, og dermed for et protein med en cytosoliske N-terminus og ekstracellulære C-terminus vi vil bruke Popin-N-GFP og etter et ekstracellulært N-terminale og cytosolisk C-terminalen i vi ville bruke pOPINE-3C-GFP. Hvor begge termini er cytosoliske vil vi bruke pOPINE-3C-GFP, med mindre det er funksjonelt grunn til ikke å merke den C-terminale ende. - Amplifisere DNA-sekvenser som koder for membranproteiner med primere som omfatter de følgende utvidelser vist:
pOPINE-3C-GFP (Forward primer - AGGAGATATACCATG; Revers primer - CAGAACTTCCAGTTT) og Popin-N-GFP (Forward primer - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; Revers primer - ATGGTCTAGAAAGCTTTA). - Analysere PCR-reaksjon ved hjelp av agarose-gelelektroforese. Når rene PCR-produkter er innhentet, tilsett 5 U DpnI til hver brønn (pass opp i 5 mL av 1x DpnI reaksjon buffer). Rens PCR produktene ved å bruke magnetiske kuler i en 96-brønners format.
Merk: DpnI tilsettes for å fjerne templaten vektor; Dette trinnet er ikke nødvendig dersom genomisk DNA anvendes som mal. - Tilsett 1 pl (100 ng) av passende lineariserte vektoren til hver brønn i en PCR-plate.
- Ved hjelp av en multikanalpipette add x mikroliter av renset PCR sette inn til de aktuelle brønnene av PCR plate. Sikre at alle produkter er i størrelsesorden 10-250 ng.
- Legg (9-x) pl vann til brønnen og overføre hele 10 ul til et rør inneholdende den tørre-ned-fusjons reagens. Permisjon i 30 sek.
- Bland innholdet kort ved å pipettere opp og ned. Overføringreaksjonene tilbake til den opprinnelige PCR-plate og tetning.
- Inkuber i 30 minutter ved 42 ° C i en termosykler.
- Umiddelbart overføre reaksjonene til is så snart reaksjonen er fullført og tilsett 40 ul TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
- Fryse på en gang eller forvandle seg kompetente celler. For transformasjon, bruke 3 mL av den fortynnede reaksjon per 50 mL delmengde av høy kompetanse (> 5 x 10 9 transformanter / mikrogram) kompetente E. coli-celler.
- Tilsett 1 ml LB-agar supplementert med 50 ug / ml karbenicillin per brønn i en 24-brønners vevskulturplate (for kloning, forberede brønner på 2 x antall konstruksjoner).
- Etter utvekst, Etter utvekst plate ut 25 ul og 25 ul av en 1 i 5 fortynning av kulturprøver i agar som inneholdt 24-brønners vevskulturplater.
- Spre cellene ved forsiktig vipping av platen.
- Tørk platen med lokket av i 10-15 min ved 37 ° C eller i et flow hette ved romtemperatur.
- Sett på lokket og snu platen opp ned og inkuberes over natten ved 37 ° C.
- Plukk to kolonier og mini-prep vektorene.
- PCR verifisere konstruksjoner ved hjelp av konstruksjonen spesifikk revers primer og en vektor bestemt fremover primer (f.eks pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).
2. Transformasjon av E. coli E Xpression Stammer
Merk: Før du utfører denne protokollen, E. coli-kompetente celler som er gjort, aliquotted og lagret frosset ved -80 ° C som beskrevet tidligere 13. Membran protein uttrykk er rutinemessig vist i to stammer, Lemo21 (DE3) og C41 (DE3) pLysS. For å lette tolkningen av resultatene kan det være nyttig å inkludere en positiv kontroll, f.eks et plasmid som uttrykker GFP eller en membran protein fusjonert til GFP kjent for å uttrykke og en tom vektor negativ kontroll.
- Tine aliquotted E. coli på is. Tilsett 3 mL av mini-prepped ekspresjonsplasmidet til hver delmengde av kompetente celler.
- Inkuber blandingen på is i 30 min.
- Heat-sjokk cellene i 30 sek ved 42 ° C.
- Tillate cellene å gjenopprette på is i 2 minutter og deretter legge 300 ul av strømkraft til hvert rør.
- Inkuber i 1 time i et 37 ° C statisk inkubator.
- Klargjør LB-agar i en 24-brønners vevkulturplate, supplert med 50 ug / ml karbenicillin og 35 ug / ml kloramfenikol. Legg rhamnose til en endelig konsentrasjon på 0,25 mM til brønnene som inneholdt Lemo21 (DE3).
Merk: Hvis produktet er sannsynlig å være toksisk brønnene som inneholdt C41 (DE3) pLysS kan kompletteres med 1% (w / v) glukose. - Overføring 30 mL av celler fra transformasjon mix på LB Agarplater. Spre og tørk platen som beskrevet i 1.13 til 1.15.
3. Utarbeidelse av Night startkulturer
Merk: Alltid forberede natten kulturer dagen etter transformasjon aldri fra en gammel transformasjon plate.
- Legg 0,7 ml buljong strøm til hver brønn i en 96-brønners dyp brønn plate supplert med 50 ug / ml karbenicillin og 35 ug / ml kloramfenikol. Legg rhamnose til brønnene inneholdende Lemo21 (DE3) til en sluttkonsentrasjon på 0,25 mM. Eventuelt supplerer C41 (DE3) pLysS med 1% (w / v) glukose; se ovenfor (2.6 note).
- Plukk en koloni fra overnatter transformasjon plater i hver brønn. Forsegl blokk med en gasspermeabel forsegling.
- Rist blokk ved 250 rpm i en inkubator med en stor kaste (for eksempel en 25 mm bane) eller ved 600 rpm i en inkubator med en liten kaste (for eksempel en 4,3 mm bane) ved 37 ° C over natten.
4. Vekst og Induksjon av kulturer
- Tilsett 3 ml av kraft buljong supplert med 50 ug / ml karbenicillin og 35 ug / ml kloramfenikol til hvert well av 24-brønners dyp-brønnplate. Legg L-rhamnose (og glukose) som beskrevet i kapittel 3.1. Bruke 3 ml av kulturen for å tillate innhøsting i duplikat, og for å tillate en viss fordampning av vann gjennom den gasspermeabel forsegling.
- Sette opp uttrykket kulturer ved å tilsette 150 ul av Lemo21 (DE3) eller C41 (DE3) pLysS over natten kulturer til hver brønn i 24-brønners dyp-brønn blokker.
- Rist blokkene ved 37 ° C inntil den gjennomsnittlige OD ved 595 nm er ~ 0.5 gjennom platen.
- Indusere ekspresjon ved å tilsette IPTG til kulturene til en endelig konsentrasjon på 1,0 mM IPTG.
- Dyrke kulturer over natten (18-20 t) med risting ved 20 ° C.
5. Analyse av Expression av In-gel fluorescens
- Innhøsting i duplikat. Transfer 1 ml kultur fra hver brønn inn i en firkantet godt, konisk bunn, 96-brønn dype brønnen blokken.
Merk: innhøstings i duplikat i tilfelle brudd av blokken, eller for å tillate testing av en vekselstrømve vaskemiddel hvis ønskelig. - Avtette blokkene og høste cellene ved sentrifugering ved 6000 xg i 10 min.
- Snu blokken og dekanter media. Pek på blokken forsiktig på et papirhåndkle for å drenere øvrige media.
- Forsegle plater og butikk ved -80 ° C i minst 20 min. Eventuelt lar forsøket på dette punkt, og blokken behandlet når det passer.
- De-frost pelletene i 20 minutter ved romtemperatur.
- Bruke enten en flerkanals pipette eller en orbital shaker (1000 rpm i 10 min) ved 4 ° C for å resuspendere cellene helt i 200 ul lyseringsbuffer (50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCl 10 mM Imidazol 1% v / v Tween 20, justere pH til 8,0 ved anvendelse av NaOH).
- Tilsett 20 pl av DLPI løsning (20 ul DNaseI (4000 enheter / ml), 20 mg lysozym og 20 ul protease inhibitor cocktail i et sluttvolum på 2 ml vann). Inkuber i 10 minutter med rysting (~ 1000 rpm) ved 4 ° C.
- Inkuber i 60 minutter med rysting (~ 1000 rpm) ved 4 ° C.
- Sentrifuger dyp brønn blokk på 6000 xg i 30 min ved 4 ° C.
- Overføring 10 ul av det klarede lysat til en mikrotiterplate og tilsett 10 ul SDS-PAGE-gel lastebuffer (100 mM Tris, pH 6,8, 4% vekt / volum SDS, 0,2% w / v bromfenol blå, 10% v / v β merkaptoetanol, og 20% v / v glyserol). ADVARSEL! Må ikke koke prøven.
- Lasten 10 ul prøve fra trinn 5.11 / brønn over på SDS-PAGE-gel (e) og er drevet ved 100-120 V (konstant spenning) i et kaldt rom inntil fargestoffet fram når bunnen (2-2,5 time).
- Plasser gel på en imager (f.eks med et blått lys filter for å oppdage GFP fusjonsproteiner). Eksponeringstiden blir valgt for å sikre at de skarpeste bånd ikke blir mettet.
6. Oppskalering av cellekulturer
- Forvandle en delmengde av kompetent
- Plukk en koloni i 10 ml kraft buljong (supplert som beskrevet i kapittel 3) og vokse over natten ved 37 ° C.
- Fortynne 5 ml av natten kultur i 500 ml kraft buljong.
- Voks med rysting ved 250 rpm ved 37 ° C inntil OD ved 595 nm er ~ 0,5.
- Indusere ekspresjon ved tilsetning av IPTG til en sluttkonsentrasjon på 1,0 mM.
- Vokse over natten med risting ved 250 rpm ved 20 ° C.
- Høste cellene ved sentrifugering ved 5000 xg i 15 min.
- Kast supernatant. Cellepelletene kan lagres ved -80 ° C.
7. Utarbeidelse av membraner
- Tine-celler (om nødvendig) ved romtemperatur og resuspendert i 1 x PBS pH 7,5 til et volum på 5 ml pr gram cellepelleten; Øke volumet som nødvendig til viskositet reduseres til en rennende konsistens. Legg MgCl2 til sluttkonsentrasjon på 1 mM, DNAse I til sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml, og énpre-pakket proteasehemmer tablett per 20 g cellepellet. Bryte åpne celler ved hjelp av en kjølt celle disrupter ved et trykk på 30 KPSI.
- Pellet ubrutte celler og rester ved 30.000 g i 15 min ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et ultrasentrifugerøret.
- Samle det totale membranfraksjonen ved spinning nedover supernatanten i en ultrasentrifuge ved 200.000 xg i 1 time ved 4 ° C.
- Kast supernatanten.
- Re-suspendere membranpelleten i iskalde 10 ml PBS pH 7,5 ved hjelp av en celle homogenisator. 1 ml resuspenderte membranene er nødvendig for hver detergent. Eventuelt på dette stadiet, flash fryse membranen suspensjon i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.
8. Solubilisering og analyse av membranfraksjonen
- Tine membranfraksjon (om nødvendig), og for hver detergent som skal anvendes for oppløsning, alikvoter 900 ul av membransuspensjonen til et 1,5 ml polyallomer mikro centrifuge tube.
- Tilsett 100 ul av hver nylaget vaskemiddel (10% vekt / volum oppløsninger av DDM, DM, Cymal-6 og LDAO) til en sluttkonsentrasjon på 1% til den angitte 1,5 ml rør. For solubilisering av eukaryot membranproteiner kolesterol hemisuccinat (0,2% sluttkonsentrasjon) tilsettes til vaskemidler.
- Inkuber blandingen ved 4 ° C i 1 time med svak omrøring.
- Pellet vaskemiddel uløselige fraksjon med en benketopp ultrasentrifuge, som sikrer rør er minst halvfullt, på 150.000 g ved 4 ° C i 45 minutter og beholde supernatanten.
Merk: Effektiviteten av vaskemiddel solubilisering kan estimeres ved bruk av en fluorescerende plateavleser ved å måle GFP fluorescens av de solubiliserte membraner med vaskemiddel uoppløselige fraksjon ble resuspendert i samme volum av PBS. - Analyser mono-dispersitet av forskjellig vaskemiddel: membran protein komplekser bruker fluorescens-oppdages størrelse utelukkelse kromatografi (FSEC).
- For FSEC analyse, ekvilibrere en størrelseseksklusjonskolonne med en bred fraksjoneringsområde, for eksempel 5000 til 5.000.000 i molekylvekt, med rennende buffer (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) ved en strømningshastighet på 0,3 ml / min . Bruk denne buffer for alle prøvene, dvs. det er ikke endret for hvert vaskemiddel testet.
- Injisere 100 ul av solubiliserte membraner på kolonnen ved en strømningshastighet på 0,3 ml / min. Overvåke elueringsprofil bruker fluorescens optikk (eksitasjon ved 488 nm og emisjon på 512 nm). Hvis en inline fluorescens monitor ikke er tilgjengelig, samle fraksjonene og lese fluorescens i en plateleser.
- Import elueringsvolum og fluorescens intensitet data i et regneark program for grafisk display.
- Analyser rester oppløseliggjorte membran materiale ved in-gel fluorescens som beskrevet i kapittel 5.
Representative Results
SEDS familie av proteiner (form, forlengelse, divisjon, og sporulering) er avgjørende for bakteriell celledeling. Disse integrerte proteiner har typisk ti transmembrane domener med begge amino- og karboksyterminaler inne i cellen. Å eksemplifisere protokollen beskrevet ovenfor, ble 47 SED orthologues klonet inn i vektoren pOPINE-3C-EGFP. En liten skala ekspresjon skjermen av konstruksjonene ble utført i to E .coli-stammer, Lemo21 (DE3) dyrket i nærvær av 0,25 mM rhamnose å blokkere ekspresjon utett og C41 (DE3) pLysS, som blir rutinemessig brukt for ekspresjon av membran proteiner 5-8.
Vaskemiddel oppløst lysater av induserte kulturer ble analysert ved hjelp av SDS-polyakrylamid-elektroforese. Ved hjelp av in-gel fluorescens for å visualisere uttrykt GFP-fusjonsproteiner viste at det mellom de to stammene 38 av de 47 SED konstruksjoner ble fremstilt. Interessant var det forskjeller mellom de to uttrykk stammer. Av de 38 uttrykt konstruerer, bare 18 ble produsert i begge stammer, 14 bare uttrykt i Lemo21 (DE3) og 6 bare i C41 (DE3) pLysS. Totalt var det en høyere suksessrate for Lemo21 (DE3) sammenlignet med C41 (DE3) pLysS (38 vs 24). Men den observasjon at noen proteiner syntes å være stammespesifikk betyr at screening både er nyttig.
Representative data for 24 av de 47 SED-konstruksjonene er vist i figur 1. Intensiteten av båndene gir en indikasjon på nivået av ekspresjon, f.eks fusjonsproteinet i brønn C4 i figur 1A og 1B er uttrykt godt i begge stammer imidlertid den ytterligere lavmolekylære bånd tyder på at proteinet er delvis nedbrutt. I mange baner er det et bånd som tilsvarer i størrelse til GFP alene. En kvalitativ vurdering av integriteten av proteinet kan bli utført ved å se på intensiteten av fusjonsprotein i forhold til den frie GFP;f.eks G4 og H4 er helt brutt ned til gratis GFP i C41 (DE3) pLysS (figur 1B), mens i Lemo21 (DE3) det er noen intakt protein (figur 1A). For 14 av de 38 uttrykte proteiner intensiteten av den frie GFP båndet er lik den av fusjonsproteinet, for 21 intensiteten av den frie GFP båndet er større enn den av fusjonsproteinet, og en mindre del av fusjonsproteinene (3 / 38 uttrykt) f.eks F6 og G6 i figur 1A har relativt liten fri GFP forhold til fusjonsproteinet.
To av konstruksjoner som uttrykkes godt i de primære skjermen B5 (høy intensitet band gratis GFP og fusjonsproteiner) og G6 (litt fri GFP) ble uttrykt og en total membranfraksjonen forberedt fra 500 ml cellekultur. Resuspenderte membranene ble delt i aliquoter og analysert ved fluorescens-detektert størrelsesutelukkende kromatografi (FSEC). De FSEC profilene er presentert i Figure 2A og 2B og viser at de to SED proteiner oppfører seg forskjellig i de fire vaskemidler som ble testet. I ett tilfelle (Figur 2A: sample B5) proteinet ga bare en symmetrisk topp med lite aggregering i DDM som ville derfor være vaskemiddel av valget for påfølgende rensing. I motsetning til den andre fusjonsprotein (figur 2B: prøve G6) ga en lignende profil i alle vaskemidler som ble testet.
Figur 1: Diagram av arbeidsflyt for screening membran protein uttrykk i E. coli ved hjelp av en GFP reporter.
Figur 2: Primær skjerm av membran protein uttrykk ved hjelp av in-gel fluorescens. E. coli-celler ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og geleer avbildes med blå Epi belysning og en 530/28 filter. Resultatene er vist i 24 konstrukter (merket A4-H6 basert på deres posisjon i en 96-brønns plate). Posisjonene til de bandene gratis GFP og GFP fusjonsproteiner er indikert. (A) Proteiner uttrykt i Lemo21 (DE3). (B) Proteiner uttrykt i C41 (DE3) pLysS.
Fig. 3: Sekundær skjermen av membranprotein ekspresjon ved hjelp av fluorescens-detektert størrelsesutelukkende kromatografi (FSEC) Total membran-fraksjoner ble ekstrahert i fire ulike detergenter, og det oppløste membranproteinene analysert ved størrelseseksklusjons-kromatografi ved anvendelse av et FPLC-system forbundet med en fluorescensdetektor. FSEC profiler for (A) membranprotein B5 og (B)
Discussion
I den protokoll som er beskrevet i denne artikkelen, er ligering uavhengig kloning inn i en vektor GFP reporter kombinert med fluorescensdeteksjon å screene hurtig den relative ekspresjon av multiple membranproteiner i E. coli. Vektorer kan gjøres i fire dager med primær screening uttrykket tar en ytterligere uke. I gel-fluorescens av vaskemiddel-lysater av hele celler blir brukt til å rangere ekspresjon hardt for ytterligere analyse i en sekundær skjerm. Den primære uttrykket skjermen som presenteres krever ikke noe spesialutstyr, bortsett fra en risteinkubator egnet for dyrking av celler i dype brønn blokker. All annen væskebehandling som involverer 96-brønners SBS platene kan utføres ved hjelp av flerkanals pipetter. Protokollen kan lett modifiseres for å inkludere andre E. coli-stammer dyrket under forskjellige betingelser (f.eks uttrykk lavere temperatur). I tilfelle av LEMO21 (DE3) titrering av nivået av rhamnose (fra 0 til 2,0 mM)tilsettes til å modulere hastigheten av transkripsjon kan øke nivået av ekspresjon av noen membranproteiner 7. Andre enn DDM vaskemidler kan brukes for ekstraksjon i primærskjerm om strengere vaskemidler kan solubilisere proteiner fra inklusjonslegemer og dermed gi falske positiver. Jo mer utdype det første skjermbildet blir, jo mer tidkrevende eksperimentet.
Den sekundære skjermen innebærer fremstilling av en total membranfraksjon fra uttrykket treff som er identifisert i den primære skjermen. Dette er et kritisk punkt som det vil bekrefte lokaliseringen av fusjonsproteinene til membranen av E. coli-celler. Etterfølgende ekstraksjon av GFP-fusjonsprotein i forskjellige vaskemidler overvåkes av fluorescens-detektert størrelsesutelukkende kromatografi av solubilisert materiale for å vurdere mono-dispersitet av detergent-proteinkomplekser. Dette er et annet kritisk punkt siden det identifiserer den mest passende rengjøringsmiddel forsolubilisering av membranprotein for påfølgende nedstrøms prosessering. Erfaring viser imidlertid at ytterligere optimalisering av valget av vaskemiddel (e) kan være nødvendig under rensing og krystallisering. Bevis på ensartet oppførsel i forskjellige vaskemidler, inkludert de med en forholdsvis liten micelle størrelse (f.eks LDAO) synes å være god indikator på en tilbøyelighet til å danne godt diffraksjon krystaller i det minste for prokaryote membranproteiner 14. Den profil som er vist på membranprotein i figur 2B i denne forbindelse vises svært gunstig.
Den største fordelen med å bruke et GFP reporter er at det gir en rask utlesning av ekspresjon i ikke-renset prøver. En ulempe er at de GFP-fusjonsproteinet må fjernes under rensing av proteinet for krystallisering. I tilfelle av vektorene som brukes her, muliggjør en rhinovirus 3C-protease for spalting av GFP. Alternativt er det ukomplisertå re-klone kandidat proteiner, som er identifisert i skjermen, i vektorer som bare legger et polyhistidin eller annen affinitetsmarkør for påfølgende rensing. Dette forutsetter at fusjon til GFP er ikke nødvendig for ekspresjon. Hoved alternativ til å bruke fusjon til GFP for påvisning av membran protein uttrykk og oppløseliggjøringen er å legge til bare en histidin tag. Men denne metoden krever vanligvis starter med en membranfraksjon 15 som for evaluering av mange varianter ville bli meget tidkrevende.
I sammendraget, det viktigste formålet med protokollen som er beskrevet i denne artikkelen er å gi et stort antall av membran protein sekvensvarianter å være raskt evaluert i form av uttrykk og vaskemiddel solubilisering og prioritert for dypere analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
| pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
| C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/) | 60444-1 | |
| LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H | |
| In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 | |
| Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 | |
| CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 | |
| DDM (n-Dodecyl β-maltoside) | Generon | D97002 | |
| DM (n-Decyl β-maltoside) | Generon | D99003 | |
| LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 | |
| E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl | Thermo Scientific | 4672030 | |
| Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS | |
| Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS | |
| Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS | |
| 24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 | |
| BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 | |
| NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX | |
| XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 | |
| Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 | |
| Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 | |
| ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 | |
| Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 | |
| Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | ||
| Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm | Shel Lab | SSI5R-HS | |
| Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R | |
| TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) | Constant systems | PL083016 | |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |
References
- Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).
- Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L.
- Okada, T., et al. X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles. J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
- Schlegel, S., et al. Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3). J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).
- Chun, E., et al. Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. Structure. 20 (6), 967-976 (2012).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).
- Busso, D., et al. Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study. J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Low, C., et al. High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).
