Abstract
Kombinationen af patch clamp optagelser fra to (eller flere) synaptisk koblede neuroner (parrede optagelser) i akutte præparater hjernen skive med samtidig intracellulær biocytin fyldning giver en korreleret analyse af deres strukturelle og funktionelle egenskaber. Med denne metode er det muligt at identificere og karakterisere både præ- og postsynaptiske neuroner ved deres morfologi og elektrofysiologiske respons mønster. Forbundne optagelser tillader studere tilslutningsmuligheder mønstre mellem disse neuroner samt egenskaber både kemisk og elektrisk synaptisk transmission. Her giver vi et trin-for-trin beskrivelse af de procedurer, der er nødvendige for at opnå pålidelige parrede optagelser sammen med en optimal genvinding af neuron morfologi. Vi vil beskrive, hvordan par af neuroner forbundet via kemiske synapser eller gap junctions er identificeret i hjernen skive præparater. Vi vil skitsere, hvordan neuroner rekonstrueres for at få deres 3D-morfologi dendritic og aksonal domæne og hvordan synaptisk kontakter identificeres og lokaliseres. Vi vil også drøfte de forbehold og begrænsninger den parrede optagelse teknik, især dem der er forbundet med dendritiske og axonale trunkeringer under udarbejdelsen af hjerneskiver fordi disse stærkt påvirke tilslutningsmuligheder skøn. Men på grund af alsidigheden af den parrede optagelse tilgang vil det fortsat være et værdifuldt værktøj til at karakterisere forskellige aspekter af synaptisk transmission på identificerede neuronale mikrokredsløb i hjernen.
Introduction
Neuronale mikrokredsløb mellem to synaptisk sammenkoblede neuroner er byggestenene i store netværk i hjernen og er de grundlæggende enheder af synaptisk informationsbehandling. En forudsætning for karakterisering af sådanne neuronale mikrokredsløb er at kende morfologi og funktionelle egenskaber af både for- og postsynaptiske partner neuroner, typen af den synaptiske forbindelse (r) og dets struktur og funktionelle mekanisme. Men i mange studier af synaptiske forbindelser mindst en af de neuroner i et mikrokredsløb er ikke godt karakteriseret. Dette skyldes de relativt uspecifikke stimulationsregimer ofte bruges i studier af synaptisk forbindelse. Derfor de strukturelle og funktionelle egenskaber af den præsynaptiske neuron enten ikke identificeres på alle eller kun en forholdsvis lille udstrækning (dvs. ekspressionen af markørproteiner etc.). Forbundne optagelser i kombination med intracellulær farvning af markører such som biocytin, neurobiotin eller fluorescerende farvestoffer er bedre egnet til at studere små neuronale mikrokredsløb. Denne teknik gør det muligt at undersøge mange strukturelle og funktionelle parametre for en morfologisk identificerede synaptisk forbindelse på samme tid.
De såkaldte "enhedsstat" monosynaptiske forbindelser mellem to neuroner er blevet undersøgt i både subkortikale hjerneområder 1-10 ved hjælp akutte præparater skive. Oprindeligt blev skarpe mikroelektroder anvendt i disse eksperimenter; senere blev patch clamp optagelse ansat for at opnå optagelser af synaptiske signaler med et lavere støjniveau og en forbedret tidsopløsning.
En væsentlig teknisk fremskridt var brugen af infrarøde differential interferens kontrast (IR-DIC) optik 11-14, en mikroskopisk teknik, væsentligt forbedret synligheden og identifikation af neuroner i hjernen skive, så det blev muligt to få optagelser fra visuelt identificeret synaptiske forbindelser 15-17. I almindelighed er parrede optagelser udført i akutte præparater slice; kun meget få publikationer er tilgængelige rapportering optagelser fra synaptisk forbundne neuroner in vivo 18-20.
Den vigtigste fordel ved parrede optagelser er, at en funktionel karakterisering kan kombineres med en morfologisk analyse på både lys- og elektronmikroskopiske niveau (se f.eks., 7,16,21). Efter histokemisk behandling, er den dendritiske og axonal morfologi synaptisk forbundet neuron par spores. Efterfølgende er det muligt at kvantificere morfologiske træk såsom længde, fysisk tæthed, orientering, forgrening mønster etc. Disse parametre kan så danne grundlag for en objektiv klassificering af en specifik synaptisk forbindelse. Derudover, i modsætning til de fleste andre teknikker, der anvendes til at studere neuronale connectivity, parret optagelser tillader også identifikation af synaptiske kontakter om ensartet synaptiske forbindelser. Dette kan gøres direkte ved hjælp af en kombination af lys og elektronmikroskopi 16,21-27 eller ved hjælp af calcium billeddannelse 28,29 af dendritiske Torner. Men med den sidstnævnte fremgangsmåde kun excitatoriske men ikke hæmmende forbindelser kan studeres, da det kræver calciumindstrømning via postsynaptiske receptor-kanaler.
Ud over en detaljeret analyse af synaptisk transmission ved en defineret neuronale mikrokredsløb parret optagelser også give studiet af synaptisk plasticitet regler 30,31 eller - i kombination med agonist / antagonist ansøgning - modulering af synaptisk transmission af neurotransmittere, såsom acetylcholin 32 og adenosin 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer er udført i overensstemmelse med EU-direktivet om beskyttelse af dyr, den tyske dyreværnsloven (Tierschutzgesetz) og retningslinjerne fra Federation of European Laboratory Animal Science Association.
1. Set-up for Elektrofysiologi
Før man starter med parret optagelse, en elektrofysiologi set-up skal bygges. En kort beskrivelse, hvordan en sådan opsætning er samlet er angivet nedenfor:
- Installer et anti-vibration bord, hvorpå mikroskopet, manipulatorer og alt andet udstyr vil blive placeret.
BEMÆRK: vibration eller enhver anden form for bevægelse skal være så lille som muligt, når der optages fra synaptiske forbindelser, fordi det kræver en ændring af pipetter (søgning elektrode erstattes ved at optage elektrode). - Placer en Faraday bur rundt om anti-vibration bord for at reducere elektrisk støj. Tilslut alt udstyr inde i Faraday CAGE med elektrisk jord.
- Installer et mikroskop med en motoriseret fokus akse, der er baseret på en motoriseret XY-bord på den anti-vibration bord i henhold til producentens retningslinjer. Dette gør det muligt pålideligt at flytte mikroskopet til neuroner, der ikke er i det samme synsfelt som det er tilfældet for translaminar forbindelser i neocortex.
- Installer et videokamera på kameraet havnen i mikroskopet og slutte den til analog og / eller digital skærme til at observere forberedelse skive og bevægelsen af elektroder. Brug et kamera, der kan skiftes mellem en lav- og en high-power forstørrelse for at få et overblik og et close-up billede af henholdsvis den synaptisk koblede neuronal celle par. Dette hjælper også til at styre bevægelsen af patch elektroder.
- Installer en prøve tabel med en indsat til badet kammer (boret internt fra en Perspex blok) til fremstilling hjerne skive. Denne model tabel skal ikke have forbindelse tilmikroskop, dvs skal fastgøres til luften bordet og mikroskopet skal kunne manøvreres under den.
- Mount to (eller flere, hvis det kræves) høj præcision mikromanipulatorer der kan flyttes i alle tre dimensioner. Installer patch-clamp forforstærker på manipulatorer og forbinde dem til de vigtigste forstærker.
BEMÆRK: Hvis der kan installeres kræves yderligere manipulatorer for fx mere end to forforstærkere, ekstracellulære stimulering elektroder, lægemiddel-leveringssystemer mv - Placer badkammeret i prøven tabellen. Installer en løsning indløb og udløb og forbinde dem til perfusionssystemet.
- Brug en peristaltisk pumpe for at opretholde perfusion af optagelsen kammer med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF; Tabel 1) ved en stabil strømningshastighed på 4 - 6 ml / min for optimal skive levedygtighed.
BEMÆRK: Du må ikke overstige denne flow betydeligt, da det vil resultere i turbulens i ASCF og dermed bevægelse af skive. Installer holdere til temperaturføleren og Ag / AgCl jordelektrode på prøven bordet. Dette er nødvendigt for, at sonden og elektroden til prøve badet i kammeret. - For en god synlighed af neuroner i forberedelsen skive bruge infrarød belysning i mikroskopet. Dette reducerer lysdiffraktion og dermed slørede billeder. Sørg for, at mikroskopet er udstyret med differentiale kontrast interferens optik for at opnå en "3D'-lignende visualisering. Dette vil hjælpe lappe neuroner og tillade målretning neuroner dybt i skive (60 pm eller dybere).
- Under eksperimentet holde hjerneskiver i en eksperimentel kammer med et dækglas i bunden. Placer en "platin harpe 'på toppen af skive for at forhindre skiver flyde. En platin harpe er fremstillet af U-formede, fladtrykt platintråd med strenge af tandtråd limet på det.
- Hold ACSF perfusion udsnittet ved en temperatur på 32-35 ° C for at sikre optimal styring af iltning og pH. Dette kan gøres ved at opvarme en opløsning med et Peltier installeret tæt på ACSF indstrømning ind i badet kammer.
BEMÆRK: Brug ultratynde cover glider så selv mikroskop kondensatorer med et højt numerisk blænde og kort arbejdsafstand kan være fokuseret på prøven. Dette er nødvendigt for en optimal belysning af udsnittet.
For et billede og en beskrivelse af en elektrofysiologi set-up optimeret til parrede optagelser i forberedelsen hjernen skive se figur 4 i Ref. 34.
2. Brain Slice Forberedelse
- Mildt bedøve dyret, hvorfra hjernevæv skal tages med isofluran (slutkoncentration <0,1%).
BEMÆRK: Andre bedøvelsesmidler kan også anvendes. Anvendelse af bedøvelsesmiddel skal være i overensstemmelse med den respektive dyr udvalgets anbefalinger og regler. Sørg altid for, at dyret ikke er irriteret eller stresset efter tilsætningbedøvelsesmidlet. - Halshugge dyret, åbne kraniet og fjerne hjernen så hurtigt som muligt efter proceduren i Refs. 34,35.
- Overfør hjernen til afkølet (4 ° C) kunstig cerebrospinalvæske beluftet med en blanding af carbogen gas med 95% O2 og 5% CO2.
- Isoler hjernen region, der skal undersøges.
BEMÆRK: De parametre, for at opnå optimal bevarelse og minimal trunkering af dendritter og axoner af præ- og postsynaptiske neuroner bør fastsættes forud for hvert neuronal tilslutning og udviklingsstadiet under efterforskning. I et optimalt dissekeret hjerne skive, er Axon af den præsynaptiske neuron ikke forpligtet til at være parallel med skive overflade. I stedet bør de pege ind i skiver med en flad vinkel. Det gælder for den apikale dendritceller af postsynaptiske pyramideneuroner; dette bør kontrolleres under lysmikroskop. Dette er især vigtigt for ikke-lokale eller translaminar synaptiske forbindelser, dvs.., hvor præ- og postsynaptiske somata er mere end 200 um hinanden og sandsynligheden for dendritiske og axonale trunkeringer sandsynligvis være væsentligt højere end for lokale forbindelser. - Overfør hjernen til microtome kammer. Baseret på empiriske resultater, der forskellige ekstracellulære udskæring løsninger anvendes afhængigt af dyrets alder (se tabel 2 og 3, nyttige oplysninger også kan findes under ' http://www.brainslicemethods.com/ «).
- Trim hjernen indtil målregionen er synlig.
- For at opnå skiver med en god celle synlighed, skæres 300-400 um tykt hjerneskiver hvis dyret er modne (> 3 uger). Hvis dyret er umodne (1 st til 2. postnatal uge for mus og rotter) skiver kan skæres op til en tykkelse på ~ 600-800 um uden væsentlig forringelse celle visibility.
BEMÆRK: Dette vil forbedre stabiliteten af 'umodne' skiver og reducere antallet af mulige trunkeringer af langtrækkende dendritiske og axonale soeskende. - Overfør skiver fra mikrotomen kammer til inkubation kammer fyldt med udskæring opløsning beluftet med en blanding af 95% O2 og 5% CO2. Hold skiver i rugekammeret i mindst 30 min til 1 time, enten ved stuetemperatur eller ved ~ 30 ° C, afhængigt af forsøget.
3. parret Patch-clamp optagelse og biocytin Påfyldning
Afhængigt af synaptisk forbindelse tre forskellige metoder anvendes til at finde synaptisk koblede neuroner. Hvis forbindelsen sandsynligheden er lav (som kan forventes for de fleste excitatoriske forbindelser), gør følgende:
- Neuronal forbindelser med en lav tilslutning
- Fyld patch pipetter med en indre opløsning af sammensætningen opførti tabel 4 for alle optagelser i helcelle-konfiguration tilføje biocytin ved koncentrationer mellem 3 -. 5 mg / ml til det indre (pipette) opløsning for at opnå gode farvningsresultater for præ- og postsynaptiske neuroner. Lad biocytin diffus i cellen i mindst 15-30 min (afhængig af størrelsen af neuron).
BEMÆRK: Du må ikke tilføje biocytin til løsningen anvendes i 'Søger' pipetter nævnt nedenfor. - Patch en formodet postsynaptisk neuron i helcelle-mode. Brug patch pipetter med en lang og slank skaft. Dette letter manøvredygtighed af pipetten under målet og reducerer bevægelsesartefakter, der kan opstå, når elektroden er indført i udsnittet.
- Derefter lappe en potentiel præsynaptisk neuron i en celle-attached konfiguration med en "søger" patch pipette på 8-10 MOhm modstand og en lille spids diameter. Med disse pipetter etablere en "løs" celle-vedhæftet patch. Fill 'søger' pipette med en indre opløsning, i hvilken K + erstattes af Na + (tabel 5) for ikke at depolarisere neuroner under søgningen efter en præsynaptisk celle.
BEMÆRK: "løs" sæl modstand er ikke i GQ området, men typisk omkring 30-300 MQ. - Hold membranpotentialet under "løs" forsegling ca. -30 til -60 mV i strømtang tilstand. Derefter anvende store strømimpulser (0,2-2 na) for at fremkalde et aktionspotentiale i den potentielle præsynaptiske celle. Overhold denne handling potentiale som en lille spikelet på spændingen respons.
- Indstil stimulation frekvens til 0,1 Hz for at forhindre nedslidning af en postsynaptiske respons. Brug lavere stimulering frekvenser i tilfælde af hjernevæv meget umodne eller den synaptiske forbindelse ikke meget pålidelige.
- I tilfælde af "postsynaptiske" neuron reagerer ikke på stimulering af testet «præsynaptiske 'neuron, lappe en ny neuron i "løs" sæl mode. Udskift ikke den "søger" patch-elektrode, så længe tætning med en modstand på> 30 MOhm er etableret. Test op til 30 potentielt præsynaptiske neuroner i denne måde.
BEMÆRK: For at undgå at beskadige neuron under den søgende procedure med løs patch clamp, kun blidt sug bør anvendes på den søgende pipette forhold, der gælder for hele-celle patch pipette. - Hvis stimulation i "løs" sæl tilstand resulterer i en EPSP / IPSP med en latenstid <5 ms i den postsynaptiske neuron fjerne 'søger' pipette fra den præsynaptiske neuron.
- Erstat "søger" patch pipette med en patch-elektrode fyldt med biocytin-holdige, regelmæssig intern løsning. Sikre denne optagelse patch pipette har en modstand på 4-8 MQ; jo større soma størrelse lavere elektrodemodstanden kan være.
- Patch den præsynaptiskeneuron og rekord i hel-celle, strøm-clamp-tilstand. Fremkalde aktionspotentialer ved løbende injektion i præsynaptiske neuroner og registrere den postsynaptiske respons. Gemme data på en computer til senere offline analyse.
- Fyld patch pipetter med en indre opløsning af sammensætningen opførti tabel 4 for alle optagelser i helcelle-konfiguration tilføje biocytin ved koncentrationer mellem 3 -. 5 mg / ml til det indre (pipette) opløsning for at opnå gode farvningsresultater for præ- og postsynaptiske neuroner. Lad biocytin diffus i cellen i mindst 15-30 min (afhængig af størrelsen af neuron).
- Neuronal forbindelser med en høj tilslutning
BEMÆRK: neuronale mikrokredsløb med en høj tilslutning ratio (> 30%) anvender en anden procedure for at finde synaptiske forbindelser. Denne procedure er skitseret nedenfor og bruges ofte til hæmmende synaptisk forbindelse, har i gennemsnit en højere tilslutning forhold end excitatoriske forbindelser 36. Det bør ikke anvendes, når tilslutning nøgletallet falder til under denne værdi.- Patch en præsynaptisk neuron direkte i helcelle-mode. Derefter lappe en potentiel postsynaptisk neuron, også i helcelle tilstand. Begge celler bør være under strømtang kontrol. Fremkalde et aktionspotentiale i den præsynaptiske celle. Overvåg prospektive postsynaptiske neuron til en postsynaptic potentiale.
- Hvis neuron viser ikke et svar på præsynaptiske stimulation, lappe en ny neuron i hel-celle-tilstand ved hjælp af en patch-elektrode fyldt med regelmæssig intern løsning. Hvis der findes en forbindelse, skal du ikke ændre patch pipette, men fortsætte med optagelsen. Fortsæt derefter som i trin 3.1.9.
- Neuronale forbindelser via gap junctions
BEMÆRK: For at søge efter elektriske (gap-junction) forbindelser bruge følgende fremgangsmåde, som er en modificeret udgave af den, der anvendes for lav-sandsynlighed forbindelser.- Patch en postsynaptisk neuron i helcelle-patch clamp-konfiguration.
- Efterfølgende lappe en formodet præsynaptisk neuron i løs tætning konfiguration (lav tætning modstand 30-300 MOhm) under anvendelse af en "søge" patch pipette 7-10 MOhm modstand. Denne pipette skal fyldes med den modificerede høj Na + intern løsning til løs-sæl stimulation.
- Inject 100-300 ms lange hyperpolarisering strømimpulser via "løs" sæl; pipetten kommando potentiale bør indstilles til omkring -60 til -70 mV. Overhold en gap junction-forbindelse, hvis denne stimulation resulterer i en lille hyperpolariserende reaktion i "postsynaptiske 'neuron.
- Repatch den "præsynaptiske" neuron i hel-celle-funktion og fortsætte som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: For at sikre en god farvning af axonale og dendritiske processer, bruge protokollen nedenfor. Denne protokol er beskrevet i korte træk her imidlertid en detaljeret protokol for histokemisk behandling bruges i vores laboratorium givet i Ref. 37.
4. Histokemisk Processing
- Overfør hjernen skive med parret af synaptisk koblede neuroner i et hætteglas indeholdende 4% paraformaldehyd opløst i 0,1 M phosphatbuffer og fiksere skive i 24 timer. Til elektronmikroskopi, fiksere skive anvendelse af 2,5% glutaraldehyd og 1% paraformaldehyd.
- Den næste dag overføres skiverne i normal phosphatbuffer indeholdende ingen fiksativ. Vask skiver med phosphatbuffer til 6 - 8 gange for 10 - 15 minutter hver for at fjerne overskydende fiksermiddel.
- Inkuber skiver i 20 minutter i en 3% H 2 O 2 opløsning i 0,1 M phosphatpuffer for at minimere den endogene peroxidase reaktion. Overhold stærk bobledannelse. Reaktionen fortsætte, indtil ingen yderligere bobler produceres. Derefter skylles skiverne i 0,1 M phosphatpuffer til 6 - 8 gange (10 minutter hver) for at fjerne eventuelle resterende H 2 O 2.
- Immuncytokemiske og kromogene reaktioner
Visualisering af biocytin fyldt neuroner er baseret på en streptavidin-biotinyleret peberrodsperoxidase katalyseret med diaminobenzidin; dette giver en mørk bundfald, der frembringer en sprød pletten med en høj rumlig opløsning. Følgende procedurer anvendes til kromogene reaktion: <ol> - Forbered ABC løsningen som pr fremstilling protokol. Tilføj til 14,55 ml phosphatbuffer suppleret med 150 pi 10% Triton X100 (tabel 6, kun til lysmikroskopi), og opløsningen opbevares i ca. 30 minutter i mørke. Inkuber skiver i denne opløsning O / N før brug.
- Inkuber skiver i ABC-opløsning på et rysteapparat i 1 time ved stuetemperatur og i mørke. Efterfølgende holde skiver O / N ved 4 ° C i et køleskab. Den næste morgen, inkuberes skiver ved stuetemperatur i yderligere en time.
- Efter dette skylles skiver mindst fire gange i 10 minutter hver i phosphatpuffer. Derefter inkuberes på et rysteapparat i ca. 30 minutter i mørke i 2 ml af en nikkel-intensiveret 3-3'-diaminobenzidin opløsning (tabel 7). Vær meget forsigtig, når du håndterer diaminobenzidin og brug kun under stinkskabet; det er ekstremt kræftfremkaldende selv ved meget lave koncentrationer.
- Tilføj 6,5 pi 3% H 2 O 2 til diaminobenzidin-holdigeopløsning. Overvåg kromogene reaktion under et lysmikroskop indtil brune-sorte farvede neuroner er klart synlige. Derefter standse reaktionen straks ved vask skiver flere gange i phosphatpuffer.
- Mount skiver med farvede neuroner på lim, silan-belagt Histobond eller gelatinerede standard objekt dias.
- Hold dias i et fugtigt kammer med mindst 80% luftfugtighed O / N. Den næste dag, lad skiver lufttørre i yderligere 10 min. Forud for indlejring, overførsel slides i opløsninger med stigende koncentrationer af ethanol (20 - 100%) for at dehydrere dem.
BEMÆRK: dehydrering proces bør være langsom ellers forvridninger i dendritiske og axonale processer forventes at forekomme 37. Hvis en alternativ indlejring procedure er valgt, fx en med glycerol-baserede Moviol en dehydrering er ikke påkrævet; men dette vil sandsynligvis resultere i en inhomogen komprimering af den pågældende del og dermed en forvrænget neuronal morpholoGy. - Endelig inkuberes i 10 minutter i xylol, indkapsle skiverne i en hydrofob indlejringsmedium til lysmikroskopi og placere en ultratynd dækglas på toppen. Lad slides tørre i 20 min ved stuetemperatur.
5. Neuronal Genopbygning og Synaptic Kontakt Lokalisering
- Undersøg dias med biocytin-mærkede neuroner under et lysmikroskop udstyret med et 60X / 100X olieimmersionslinse mål og en kondensator med en høj numerisk apertur for optimal rumlig opløsning. Sørg for, at axonal boutons og dendritiske Torner er klart synlige.
- Trace neuroner eller synaptisk koblede neuron par ved hjælp af et kommercielt neuron sporingssystem (se tabel for specifikke materialer / udstyr) for at opnå 3D neuronale rekonstruktioner. Foretag sporing manuelt under konstant visuel inspektion for at opdage selv små axonale eller dendritiske soeskende. For parrede optagelser fra synaptisk koblede neuroner manuel sporing er stadig den metodevalg, fordi tildelingen af fx en axonal profil til enten præ- eller postsynaptiske neuron kræver betydelige genopbygning oplevelse.
- Hvis det er nødvendigt, at tællinger af axonale boutons og / eller dendritiske Torner. Fordi pigge eller endda rygsøjlen undertyper og axonale boutons kan udvise en specifik fordeling og tæthed i forhold til f.eks kortikale lag eller område, kan dette være med til at karakterisere neuronale celletyper.
- For synaptisk koblede neuron par, tjek den præsynaptiske Axon og postsynaptiske dendritter nære appositions på højeste forstørrelse til rådighed. Observerer axonal bouton og en postsynaptisk dendritisk rygsøjlen eller aksel er i samme fokusplan, kan betragtes som en putativ synaptisk kontakt. Markere denne kontaktperson i genopbygningen.
- Ret de neuronale rekonstruktioner for svind i alle tre rumlige dimensioner i det relevante afsnit i opsporing program.
BEMÆRK: Under fiksering, histokemisk behandlingog dehydrering betydelig mekanisk deformation og krympning forekomme; dette vil påvirke axonale og dendritiske længde målinger og alvorligt fordreje deres rumlige arrangement. Svind korrektionsfaktorer for indlejringsmediet er ~ 1.1 for x- og y-retninger og ~ 2,1 til z-retningen 37. - For en kvantitativ morfologisk analyse bruge en dataanalyse program for neurofysiologi (se tabel for specifikke materialer / udstyr).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forbundne optagelser er den foretrukne metode til en grundig karakterisering af morfologisk identificerede ensrettede eller gensidige synaptiske forbindelser samt gap junction (elektriske) forbindelser (figur 1). Et eksempel på et parret optagelse i lag 4 af somatosensoriske tønde cortex, er vist i figur 1A. Både ensrettet excitatoriske og inhibitoriske synaptiske forbindelser kan karakteriseres (figur 1B, C). Endvidere parrede optagelser muligt at optage fra tovejs synaptiske forbindelser, dvs. fra forbindelser, hvor både neuroner i et par er præ- og postsynaptiske til hinanden. Dette er illustreret i figur 1D, som viser optagelser fra en inhibitorisk interneuron og en excitatorisk neuron. Fremkalde en handling potentiale i excitatoriske neuron (røde spor) resulterer i en EPSP i den postsynaptiske hæmmende interneuron (sorte spor). Men når en handling potentiale er evoKed i interneuron kan en IPSP registreres i den excitatoriske neuron. Figur 1E viser, at det også er muligt at optage fra neuroner koblet via gap junction eller via et gap junction og en Synapse. Gensidige og gap junction-forbindelser kan kun identificeres ved Forbundne elektrofysiologiske optagelser så langt, men ikke af en anden teknik.
Kombinationen af biocytin fyldning af koblede neuroner via patch-pipetten og elektrofysiologiske optagelser tillader en korrelation af morfologiske egenskaber af neuroner til synaptiske egenskaber. Efter histokemiske processing neuroner er synlige som mørke strukturer i fikseret skive (figur 2A). Derefter registreres neuronal celle par kan rekonstrueres morfologisk og kan identificeres af de neuronale celletyper. Desuden er det muligt at identificere antallet og placeringen af formodede synaptiske kontakter (figur 2A højre paneler og Figure 2B indsat). The neuron pair vist i figur 2B er gensidigt forbundet og dermed synaptiske kontakter er etableret på både neuroner. I vores hænder, var formodede, lette mikroskopisk identificerede synaptiske kontakter bekræftet som sande synaptiske kontakter med elektronmikroskop med en 80-90% nøjagtighed 16,21,26.
Figur 3 viser et eksempel på et parret optagelse fra en præsynaptisk pyramideformet neuron i neocorticale lag 6 af cylinderen cortex og en excitatorisk spiny neuron i lag 4. Denne translaminar neuronal mikrokredsløb har en lav forbindelse sandsynlighed, men kan identificeres ved anvendelse af den søgende beskrevet i trin 3.1.1 - 3.1.9 for neuronale forbindelser med en lav tilslutning. Med den parrede optagelse teknik er det muligt at identificere synaptiske forbindelser med en meget lav tilslutning som det er tilfældet med nogle langtrækkende translaminar forbindelser (dette eksempel) eller forbindelser mellem neurons i forskellige kortikale »søjler« (inter-søjleformede synaptiske forbindelser).
Figur 1. Forbundne optagelser fra synaptisk koblet celle par. (A) Venstre, IR-DIC billede af en hjerne skive. Højre, en interneuron (øverst) og en excitatorisk neuron (nederst). (B) en præsynaptisk virkningspotentiale (øverst) i en excitatorisk neuron fremkalder en monosynaptisk excitatorisk postsynaptisk potentiale (EPSP) i en anden excitatoriske neuron (nederst). (C) en virkningspotentiale (øverst) i en præsynaptisk inhiberende interneuron fremkalder en monosynaptisk hæmmende postsynaptisk potentiale (IPSP) i en excitatorisk neuron (nederst). (D) et aktionspotentiale (øverst til venstre) i en præsynaptisk excitatorisk neuron fremkalder en EPSP (nederst til venstre) i en inhiberende interneuron. Til gengæld et aktionspotentialei den hæmmende interneuron (øverst til højre) fremkalder en IPSP i excitatoriske neuron (nederst til højre). (E) En række hyper- og depolariserende spændingstrin fremkaldt af de nuværende injektioner i en neuron (øverst til venstre) er afspejlet i en gap-junction koblet anden neuron (nederst til venstre). Desuden en præsynaptisk virkningspotentiale (øverst til højre) i den første neuron fremkalder en tidlig lille depolarisering (småaks, indsat) efterfulgt af en sen dyb hyperpolarisering (IPSP) i membranpotentialet af den anden neuron (nederst til højre). Scale barer i (B) også finder anvendelse på (C). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Identifikation af synaptiske kontakter og morfologiske reconstruction af biocytin fyldt celle par. (A) Venstre, energibesparende mikrofotografi af et gensidigt koblet celle par bestående af en spiny stjerneformet og en hurtigt spiking interneuron i lag 4, der var fyldt med biocytin under optagelse. Light mikroskopisk identificerede formodede excitatoriske synaptiske kontakter mellem den præsynaptiske spiny neuron og den postsynaptiske interneuron er markeret med grønne prikker. Formodede gensidige inhibitoriske synaptiske kontakter, er angivet med blå prikker. Højre, høj effekt billeder af synaptiske kontakter. Grøn åbne cirkler, excitatoriske kontakter; blå cirkler, hæmmende kontakter. Layer grænser blev bestemt ved cytoarchitectonic struktur farvede hjerne skive under lav effekt mikroskop. (B) Neurolucida rekonstruktion af den samme celle par er vist i (A) og figur 1C. Blå, interneuron axon; rød, interneuron soma og dendritceller; grøn, spiny neuron axon; hvid, spiny neuron soma og dendritceller. Indsættelsenviser de somatodendritiske rum i præ- og postsynaptiske neuroner sammen med de formodede synaptiske kontakter. Barrel konturer blev identificeret i lav effekt lyse-field mikrofotografier fremstillet af den akutte hjerne skive. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Et repræsentativt synaptisk forbindelse med meget lav tilslutning ratio. (A) en præsynaptisk virkningspotentiale (øverst) i et lag 6 pyramideformet celle fremkalder en monosynaptisk excitatorisk postsynaptisk potentiale (nederst) i et lag 4 star pyramideformet neuron. Bemærk den lange latenstid (> 3,0 ms) af denne trans-laminar forbindelse sammenlignet med lokale intra-laminar forbindelser (≈1.0 ms). (B) Postsynaptiske response af lag 4 stjernet pyramideformet neuron til to aktionspotentialer ved 10 Hz fremkaldt i et lag 6 pyramideformede celler. Bemærk lettelse af denne forbindelse kortvarig sammenlignet med den kortsigtede depression af lokale forbindelser (data ikke vist). (C) Udvidet dybdeskarphed billeddannelse af den samme forbindelse som i (A, B). Indsat, den somato / dendritiske domæne af et lag 4 stjernet pyramideformet neuron. Bemærk tilstedeværelsen af en fremtrædende apikal dendritceller markeret med en pil. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCI | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4,5 |
| NaHCO3 | 2.1 | |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 2 | 0,294 |
| MgCI2 | 1 | 0,095 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasset med 95% O2 og 5% CO2 | ||
Tabel 1. Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for perfusion under optagelse.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCI | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4,5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCI2 | 5 | 0,476 |
| Myo-inositol | 3 | 0,54 |
| Na-pyruvat | 2 | 0,22 |
| Ascorbinsyre (vitamin C) | 0.4 | 0.07 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasset med 95% O2 og 5% CO2 | ||
Tabel 2. Ekstracellulær løsning til akutte hjernen skiver af umodne dyr.
| mM | g / L | |
| Saccharose | 206 | 70,51 |
| KCI | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4,5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCI2 | 3 | 0,286 |
| Myo-inositol | 3 | 0,54 |
| Na-pyruvat | 2 | 0,22 |
| Ascorbinsyre (vitamin C) | 0.4 | 0.07 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasset med 95% O2 og 5% CO2 | ||
Tabel 3. Ekstracellulær løsning til akutte hjernen skiver af modne dyr (sucrose saltvand).
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| K-gluconat | 135 | 31,622 | 1,5811 |
| KCI | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Phosphocreatin | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Juster pH til 7,3 med KOH | |||
| Osmolaritet ~ 300 mOsmol / L | |||
| Tilføj 3-5 mg / ml biocytin | |||
Tabel 4. Low chlorid pipette løsning.
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| Na-gluconat | 105 | 22.92 | 1.146 |
| NaCl | 30 | 1.76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Phosphocreatin | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Juster pH til 7,3 med NaOH | |||
| Osmolaritet ~ 300 mOsmol / L | |||
Tabel 5. High Napipette løsning til at søge synaptisk koblede neuroner.
| forholdet | ml | |
| reagens A | 1 | 0,15 |
| reagens B | 1 | 0,15 |
| 10% Triton X100 | 1 | 0,15 |
| 0,1 M phosphatbuffer | 97 | 14.55 |
| Holdes i 30 minutter i mørke før brug | ||
Tabel 6. ABC opløsning histokemisk reaktion.
| vægt | volumen | |
| 3-3'-diaminobenzidin | 10 mg | - |
| 0,1 M phosphatbuffer | - | 20 ml |
| 1% (NH4) 2 Ni (SO 4) 2 | - | 5 - 10 pi |
| 1% CoCl2 | - | 5 pi |
| 1% (NH4) 2 Ni (SO4) 2 og 1% CoCI2 tilsættes dråbevis under omrøring af opløsningen. | ||
Tabel 7. Opløsning til diaminobenzidin (DAB) reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forbundne optagelser fra synaptisk koblet excitatoriske og / eller hæmmende neuroner er en meget alsidig fremgangsmåde til undersøgelse af neuronale mikrokredsløb. Ikke alene denne fremgangsmåde, at man kan estimere synaptisk forbindelse mellem neuron typer, men også gør det muligt at bestemme de funktionelle egenskaber af forbindelsen og morfologi præ- og postsynaptiske neuroner. Endvidere kan agonist og / eller antagonist let anvendes til neuroner i slice præparater. Dette gør det muligt at undersøge virkningerne af neuromodulatorer på egenskaberne af synaptisk transmission 32 eller en grundig karakterisering af en defineret enhedsstat synaptisk forbindelse ved hjælp f.eks kvantemekaniske analyse af synaptisk frigivelse 16,17,38,39. Finding af kemiske og / eller elektrisk (gap junction) synaptiske forbindelser er den mest kritiske trin i denne protokol. Vi har derfor angivet forskellige fremgangsmåder til at finde synaptiske forbindelser, afhængigt af konnektivitet forholdet og detstype (kemisk / elektrisk).
En væsentlig ulempe ved slice præparater er ofte væsentlig afkortning af langtrækkende axonale projektioner således at kun små dele af den samlede axonal længde Axon inddrives. For nogle pyramideformede celletyper, graden af trunkering kunne op til 90% eller endnu mere, når man tager fremspring til andre corticale områder eller subkortikale regioner i betragtning. Dette gør fremstillingen skive uegnet til undersøgelse af synaptiske forbindelser mellem neuroner cellelegemer, som er mere end> 300 um hinanden. Men i akutte præparater skive, lokale axonale fremskrivninger, navnlig lokale interneuroner generelt genvindes med en relativt lav grad af dendritiske og axonal trunkering (~ 10% eller mindre) på grund af den begrænsede horisontale og vertikalt felt span af deres axonale dorne . Forbindelser vedrørende disse typer af neuroner kan derfor karakteriseres med en høj grad af nøjagtighed og reliability og giver stort set korrekte tilslutningsmuligheder skøn. Med undtagelse af disse lokale synaptiske forbindelser, absolutte værdier for tilslutningsmuligheder forhold mellem to neuron typer opnået i slice præparater er meget problematisk, især for neuroner med store inter-somatiske afstande som i translaminar eller ikke-lokale, langtrækkende intralaminære synaptiske forbindelser . Dette problem forværres, når udskæring betingelser ikke er optimeret til en given synaptisk forbindelse på et defineret alder. For mere realistiske tilslutningsmuligheder anslået nye metoder såsom tæt elektron mikroskopiske rekonstruktioner 40 og strukturel AXO-dendritiske overlapning 41 er blevet udviklet. Men selv disse teknikker nødt til at tage hensyn til den høje diversitet hæmmende interneuroner og også excitatoriske neuroner.
Et yderligere problem med tilslutningsmuligheder skøn er, at distale synaptiske kontakter, fx dem på apikal tot pyramideneuroner, kanundslippe opdagelse. Målt på soma amplituden af deres synaptisk respons er meget lille og vil sandsynligvis forsvinde i støj (Qi et al., 2014 i indsendelse). Men denne type problem ikke begrænset til den parrede optagelse tilgang, men vil også forekomme med andre teknikker, der anvendes til at studere synaptisk forbindelse.
I de seneste år lys-induceret aktivering af neuronale mikrokredsløb (dvs. ved foto-frigivelse af bur glutamat eller ved aktivering af channelrhodopsin) er blevet anvendt til at undersøge neuronal forbindelse, selv på en større skala 42-52. Med disse optiske metoder er det imidlertid ikke muligt at identificere de strukturelle egenskaber af den præsynaptiske neuron type. Desuden kan antallet og placeringen af synaptiske kontakter, der er etableret af neuronal forbindelse ikke kan identificeres, i det mindste ikke til dato. Forbundne optagelser på den anden side tillader karakterisering af både præ- og postsynaptiske NEURpå typer i en synaptisk mikrokredsløb. Dette er særlig vigtigt, eftersom mange undersøgelser har vist, at både GABAerge interneuroner og excitatoriske neuroner er meget forskellige med hensyn til deres morfologi og synaptisk fysiologi 53-56. Således identifikation af både præ- og postsynaptiske neuroner er en forudsætning for en beskrivelse af en synaptisk forbindelse 57. Endelig parrede optagelser tillader registrering af forskellige konfigurationer af synaptisk forbindelse (gensidige forbindelser, sameksisterende gap junctions og kemiske synapser). Derfor vil den parrede optagelse teknik forblive en vigtig metode til at studere neuronale mikrokredsløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
References
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D. Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. Fellin, T., Halassa, M. 67, Springer Verlag. 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single 'barrel' of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
