Abstract
La combinaison d'enregistrements patch clamp de deux (ou plus) des synapses des neurones couplés (enregistrements appariés) dans aiguës préparations de tranches de cerveau avec remplissage simultané de la biocytine intracellulaire permet une analyse corrélée de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. Avec cette méthode, il est possible d'identifier et de caractériser les neurones pré- et post-synaptiques par leur morphologie et leur profil de réponse électrophysiologique. Enregistrements appariés permettent l'étude des modes de connectivité entre ces neurones ainsi que les propriétés à la fois la transmission synaptique chimique et électrique. Ici, nous donnons une description étape par étape des procédures requises pour obtenir des enregistrements appariés fiables avec une récupération optimale de la morphologie des neurones. Nous allons décrire comment paires de neurones connectés via les synapses chimiques ou de jonctions lacunaires sont identifiés dans les préparations de tranches de cerveau. Nous allons exposer comment les neurones sont reconstruits pour obtenir leur morphologie 3D de la Dendritic et le domaine axonale et comment contacts synaptique sont identifiés et localisés. Nous discuterons également les mises en garde et les limites de la technique d'enregistrement couplé, en particulier ceux associés à troncatures dendritiques et axonales lors de la préparation des tranches de cerveau parce que ces affectent fortement les estimations de connectivité. Toutefois, en raison de la polyvalence de l'approche d'enregistrement jumelé il restera un outil précieux pour caractériser les différents aspects de la transmission synaptique au microcircuits neuronaux identifiés dans le cerveau.
Introduction
Microcircuits neuronaux entre deux neurones synaptiquement couplés sont les blocs de construction de réseaux à grande échelle dans le cerveau et sont les unités fondamentales de synaptique traitement de l'information. Une condition préalable pour la caractérisation de ces microcircuits neuronaux est de connaître la morphologie et les propriétés fonctionnelles des deux partenaires neurones pré- et post-synaptiques, le type de la connexion synaptique (s) et sa structure et son mécanisme fonctionnel. Cependant, dans de nombreuses études de connexions synaptiques au moins l'un des neurones dans un microcircuit ne est pas bien caractérisé. Il en résulte des protocoles de stimulation relativement non spécifiques souvent utilisées dans les études de la connectivité synaptique. Par conséquent, les propriétés structurelles et fonctionnelles du neurone présynaptique sont identifiées soit pas du tout ou seulement dans une mesure relativement faible (par exemple, l'expression des protéines marqueurs, etc.). Enregistrements appariés en combinaison avec coloration intracellulaire de marqueurs sUCH que biocytine, neurobiotin ou colorants fluorescents sont mieux adaptés pour l'étude de petites microcircuits neuronaux. Cette technique permet d'enquêter sur de nombreux paramètres structurels et fonctionnels d'une connexion synaptique identifiée morphologiquement en même temps.
Les soi-disant connexions monosynaptiques «unitaire» entre deux neurones ont été étudiés dans les deux régions corticales et sous-corticales du cerveau 1-10 utilisant des préparations de tranche aigus. Initialement, microélectrodes tranchants ont été utilisés dans ces expériences; plus tard, l'enregistrement patch clamp a été utilisée pour obtenir des enregistrements de signaux synaptiques avec un niveau de bruit inférieur et une résolution temporelle améliorée.
Un progrès technique important est l'utilisation de contraste d'interférence différentiel à infrarouges (IR-DIC) 14.11 optique, une technique microscopique qui améliore considérablement la visibilité et l'identification des neurones dans la tranche de cerveau de sorte qu'il devient possible to obtenir des enregistrements de connexions synaptiques identifiés visuellement 15-17. En général, les enregistrements appariés sont effectuées dans des préparations de tranche aigus; que très peu de publications sont disponibles enregistrements de rapports de neurones reliés par des synapses in vivo 18-20.
L'avantage le plus important d'enregistrements appariés est le fait qu'une caractérisation fonctionnelle peut être combiné avec une analyse morphologique à la fois la lumière et de l'électron niveau microscopique (voir, par exemple., 7,16,21). Après le traitement histochimique, la morphologie dendritique et axonale de la paire de neurones reliés par des synapses est tracée. Par la suite, il est possible de quantifier les caractéristiques morphologiques telles que la longueur, la densité spatiale, l'orientation, patron de ramification, etc. Ces paramètres peuvent alors fournir une base pour une classification objective d'une connexion synaptique spécifique. En outre, contrairement à la plupart des autres techniques utilisées pour l'étude de rappro neuronalestivité, jumelé enregistrements permettent également l'identification des contacts synaptiques pour les connexions synaptiques unitaires. Cela peut être fait directement à l'aide d'une combinaison de microscopie optique et électronique 16,21-27 ou en utilisant l'imagerie calcique 28,29 des épines dendritiques. Toutefois, cette dernière approche ne excitateur mais pas des connexions inhibitrices peuvent être étudiés car elle nécessite l'influx de calcium par les canaux des récepteurs post-synaptiques.
En plus d'une analyse détaillée de la transmission synaptique chez un microcircuit couplé enregistrements neuronaux définies permettent également l'étude des règles de plasticité synaptique 30,31 ou - en combinaison avec une application agoniste / antagoniste - la modulation de la transmission synaptique par les neurotransmetteurs tels que l'acétylcholine et de l'adénosine 32 33.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la directive de l'UE pour la protection des animaux, la Loi sur la protection des animaux allemand (Tierschutzgesetz) et les lignes directrices de la Fédération de l'Association européenne des sciences des animaux de laboratoire.
1. Mise en place d'électrophysiologie
Avant de commencer avec enregistrement jumelé, un électrophysiologie set-up doit être construit. Un bref aperçu comment un tel set-up est assemblé est donné ci-dessous:
- Installez une table anti-vibration sur lequel le microscope, les manipulateurs et tout autre équipement seront placés.
REMARQUE: Vibration ou tout autre type de mouvement doit être aussi petit que possible lors de l'enregistrement de connexions synaptiques, car cela nécessite un changement de pipettes (recherche électrode remplacé par l'électrode d'enregistrement). - Placez une cage de Faraday autour de la table anti-vibrations pour réduire le bruit électrique. Connectez tous les équipements à l'intérieur du Faraday cage avec le sol électrique.
- Installez un microscope avec un axe de mise au point motorisée qui est basé sur une table xy motorisée sur la table anti-vibration selon les directives du fabricant. Ceci permet de se déplacer de manière fiable le microscope pour les neurones qui ne sont pas dans le même champ de vision comme ce est le cas pour les connexions translaminaires dans le néocortex.
- Installer une caméra vidéo sur le port de la caméra du microscope et le connecter à des écrans analogiques et / ou numériques d'observer la préparation de tranche et le mouvement des électrodes. Utilisez un appareil photo, qui peut être commuté entre un faible et un grossissement de haute puissance pour obtenir une vue d'ensemble et une image en gros plan, respectivement, de la paire neuronale synaptiquement couplé cellulaire. Cela permet également de contrôler le mouvement des électrodes de patch.
- Installez une table d'échantillons contenant un encart pour la chambre de bain (foré en interne d'un bloc en plexiglas) pour la préparation de tranches de cerveau. Cette table de spécimen ne doit pas être connectée à lamicroscope, ce est à dire, doit être fixé à la table d'air et le microscope doit être manoeuvrable en dessous.
- Montez deux (ou plus si nécessaire) micromanipulateurs de haute précision qui peuvent être déplacés dans les trois dimensions. Installez patch-clamp préamplificateur sur les manipulateurs et les connecter à l'amplificateur principal.
NOTE: Si manipulateurs supplémentaires nécessaires peuvent être installés pour, par exemple, plus de deux pré-amplificateurs, des électrodes de stimulation extracellulaire, les systèmes de délivrance de médicaments, etc. - Placer la chambre de bain dans la table pour spécimen. Installez une entrée de solution et de sortie et les connecter au système de perfusion.
- Utilisation d'une pompe péristaltique pour maintenir la perfusion de la chambre d'enregistrement à liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF; tableau 1) à une vitesse d'écoulement stable de 4 à 6 ml / min pour la viabilité optimale tranche.
REMARQUE: Ne pas dépasser ce débit significativement que cela se traduira par la turbulence dans le FCSA et donc le mouvement de la tranche. Installation de supports pour la sonde de température et Ag / AgCl électrode de masse sur la table pour spécimen. Cela est nécessaire pour permettre à la sonde et l'électrode de goûter à la salle de bain dans la chambre. - Pour une bonne visibilité des neurones dans la préparation de tranches utiliser un éclairage infrarouge dans le microscope. Cela réduit diffraction de la lumière et donc le flou. Assurez-vous que le microscope est équipé de différentiels optiques de contraste d'interférence pour obtenir un «visualisation 3D'-like. Cela aidera à patcher neurones et permettrait de cibler les neurones profonds dans la tranche (60 um ou plus profond).
- Pendant l'expérience, conserver des tranches de cerveau dans une chambre expérimentale avec une lamelle de verre au fond. Placez un 'harpe platine »en haut de la tranche pour éviter tranches de flotter. Une harpe de platine est fabriqué à partir en forme de U, un fil de platine aplatie avec des chaînes de fil dentaire collés sur elle.
- Gardez l'ACSF perfuser la tranche à une température de 32-35 ° C pour assurer optcontrôle de iMAL de l'oxygénation et de pH. Cela peut se faire en chauffant la solution à un dispositif Peltier installé à proximité de l'entrée de l'ACSF dans la chambre de bain.
REMARQUE: Utilisez couvercle glisse ultra-mince de sorte que même les condenseurs de microscope avec une ouverture numérique élevée et à courte distance de travail peuvent être axées sur l'échantillon. Cela est nécessaire pour un éclairage optimal de la tranche.
Pour une image et une description d'un set-up de l'électrophysiologie optimisé pour les enregistrements appariés dans la préparation de tranches de cerveau voir Figure 4. Ref 34.
2. tranche de cerveau Préparation
- Légèrement anesthésier l'animal à partir duquel le tissu cérébral doit être pris avec de l'isoflurane (concentration finale <0,1%).
REMARQUE: Les autres anesthésiques peuvent également être utilisés. L'utilisation de l'anesthésie doit se conformer aux recommandations et règles du comité animale respective. Toujours se assurer que l'animal ne est pas irritée ou sous contrainte après l'ajoutl'anesthésique. - Décapiter l'animal, ouvrir le crâne et le cerveau retirer aussi rapidement que possible en utilisant la procédure décrite dans les références 34,35..
- Transférer le cerveau en refroidie (4 ° C) liquide céphalo-rachidien artificiel aérée avec un mélange de gaz avec du carbogène 95% O 2 et 5% de CO 2.
- Isoler la région du cerveau qui devrait être étudié.
REMARQUE: Les paramètres pour obtenir une conservation optimale et troncature minimale de dendrites et des axones des neurones pré- et post-synaptiques doit être déterminé à l'avance pour chaque connexion neuronale et le stade de développement de l'enquête. Dans une tranche de cerveau disséqué de façon optimale, l'axone du neurone présynaptique est pas nécessaire pour être parallèle à la surface de la tranche. Au contraire, ils doivent pointer dans les tranches avec un angle faible. La applique pour la dendrite apicale de neurones pyramidaux post-synaptiques; ce doit être vérifiée au microscope optique. Ceci est particulièrement important pour le non-local ou tconnexions synaptiques ranslaminar, ce est à dire., où somata avant et post-synaptique sont plus de 200 um à part et la probabilité de troncatures dendritiques et axonales est susceptible d'être sensiblement plus élevé que pour les connexions locales. - Transférer le cerveau à la chambre microtome. Sur la base de résultats empiriques, différentes solutions de tranchage extracellulaire sont utilisés en fonction de l'âge de l'animal (voir les tableaux 2 et 3, de l'information utile peut également consulter la rubrique ' http://www.brainslicemethods.com/ ').
- Couper le cerveau jusqu'à ce que la région cible est visible.
- Pour obtenir des tranches avec une bonne visibilité de la cellule, couper 300-400 um d'épaisseur des tranches de cerveau si l'animal est mature (> 3 semaines). Si l'animal est immature (1 er au 2 ème semaine postnatale pour les souris et les rats) tranches peut être coupé jusqu'à une épaisseur d'environ 600 à 800 um sans altérer sensiblement Visib cellulaireilité.
NOTE: Cela permettra d'améliorer la stabilité de tranches «immatures» et de réduire le nombre de troncatures possibles de longue portée dendritique et collatérales axonales. - Transférer les tranches de la chambre microtome à une chambre d'incubation rempli avec une solution de tranchage aérée avec un mélange de 95% O 2 et 5% de CO 2. Garder les tranches dans la chambre d'incubation pendant au moins 30 min à 1 h à la température ambiante ou soit à ~ 30 ° C, en fonction du type d'expérience.
3. jumelés Patch-Clamp Enregistrement et biocytine Remplissage
Selon le type de connexion synaptique trois approches différentes sont utilisées pour trouver les neurones synaptiquement couplés. Si la probabilité de connexion est faible (comme on peut s'y attendre pour les connexions les plus excitateurs), procédez comme suit:
- Connexions neuronales avec une connectivité à faible
- Remplissez les pipettes de patch avec une solution interne de la composition énumérésdans le tableau 4 pour tous les enregistrements dans la configuration cellule entière ajouter biocytine à des concentrations comprises entre 3 -. 5 mg / ml pour le (pipette) solution interne pour obtenir de bons résultats de coloration pour les neurones pré- et post-synaptiques. Soit biocytine diffuse dans la cellule pendant au moins 15 à 30 min (selon la taille du neurone).
NOTE: Ne pas ajouter biocytine à la solution utilisée dans les pipettes 'Recherche' mentionnés ci-dessous. - Patch un neurone post-synaptique putative en mode cellule entière. Utilisez pipettes de patch avec une tige longue et mince. Ceci facilite la maniabilité de la pipette de l'objectif et de réduire des artefacts de mouvement qui peuvent se produire lorsque l'électrode est introduite dans la tranche.
- Puis, patcher un neurone présynaptique potentiel dans une configuration cellule attachée en utilisant un 'chercher' pipette de patch de 8-10 résistance de MQ et un petit diamètre de pointe. Avec ces pipettes établir un patch joint de cellule «lâche». Fill la 'recherche' pipette avec une solution interne dans lequel K + est remplacé par Na + (tableau 5) afin de ne pas dépolariser les neurones pendant la recherche d'une cellule présynaptique.
NOTE: La résistance d'étanchéité «lâche» ne est pas dans la gamme de GQ, mais généralement autour de 30 à 300 MQ. - Tenez le potentiel de membrane sous le sceau «lâche» à environ -30 à -60 mV en mode pince de courant. Ensuite, appliquez de grandes impulsions de courant (0,2 à 2 nA) pour susciter un potentiel d'action dans la cellule présynaptique potentiel. Observer ce potentiel d'action en tant que petit épillet sur la réponse de tension.
- Réglez la fréquence de stimulation à 0,1 Hz pour éviter délabré d'une réponse post-synaptique. Utiliser des fréquences de stimulation plus faibles dans le cas du tissu cérébral est très immature ou la connexion synaptique pas très fiable.
- Dans le cas où le neurone "postsynaptique" ne répond pas à la stimulation de la neu testé 'présynaptique'ron, patcher un nouveau neurone en mode d'étanchéité «lâche». Ne pas remplacer la 'recherche' électrode de patch tant que le joint avec une résistance de> 30 MQ est établi. Testez jusqu'à 30 neurones présynaptiques potentiellement de cette façon.
NOTE: Pour éviter d'endommager le neurone au cours de la procédure de recherche avec lâche patch clamp, seulement légèrement aspiration doit être appliqué à la pipette de recherche par rapport à celui appliqué à la pipette de patch à cellules entières. - Si la stimulation dans les résultats «lâche» du mode d'étanchéité dans un EPSP / IPSP avec une latence <5 ms dans le neurone post-synaptique retirer la 'recherche' pipette de l'neurone présynaptique.
- Remplacez le 'chercher' pipette de patch avec une électrode de patch rempli de solution interne régulier contenant biocytine. Veiller à ce patch d'enregistrement pipette comporte une résistance de 4-8 MQ; plus la taille de soma plus la résistance de l'électrode peut être.
- Patcher le présynaptiqueneurone et record en cellule entière, mode courant-clamp. Susciter des potentiels d'action par injection de courant dans les neurones présynaptiques et enregistrer la réponse post-synaptique. Stocker les données sur un ordinateur pour une analyse ultérieure hors ligne.
- Remplissez les pipettes de patch avec une solution interne de la composition énumérésdans le tableau 4 pour tous les enregistrements dans la configuration cellule entière ajouter biocytine à des concentrations comprises entre 3 -. 5 mg / ml pour le (pipette) solution interne pour obtenir de bons résultats de coloration pour les neurones pré- et post-synaptiques. Soit biocytine diffuse dans la cellule pendant au moins 15 à 30 min (selon la taille du neurone).
- Connexions neuronales avec une connectivité haute
NOTE: Pour microcircuits neuronaux avec un taux de connectivité haute (> 30%) utiliser une procédure différente pour trouver connexions synaptiques. Cette procédure est décrite ci-dessous et est souvent utilisé pour la connexion synaptique inhibitrice qui ont, en moyenne, un taux de connectivité supérieure à 36 connexions excitatrices. Il ne doit pas être utilisé lorsque le rapport de la connectivité est inférieure à cette valeur.- Patch un neurone présynaptique directement dans le mode cellule entière. Puis, patcher un neurone post-synaptique potentiel, également en mode cellule entière. Les deux cellules doivent être sous le contrôle de pince de courant. Déclencher un potentiel d'action dans la cellule présynaptique. Surveiller le neurone post-synaptique prospective pour une postsynaptic potentiel.
- Au cas où le neurone ne montre pas une réponse à la stimulation présynaptique, patcher un nouveau neurone en mode cellule entière utilisant une électrode de patch rempli avec une solution interne régulier. Si une connexion ne est trouvée, ne changez pas la pipette de patch, mais procéder à l'enregistrement. Ensuite, procédez comme à l'étape 3.1.9.
- Connexions neuronales via gap-jonctions
REMARQUE: Pour rechercher (écart-jonction) connexions électriques utiliser la procédure suivante qui est une version modifiée de celui utilisé pour les connexions à faible probabilité.- Patch un neurone post-synaptique dans la configuration patch clamp cellule entière.
- Par la suite, patcher un neurone présynaptique putative dans la configuration lâche-joint (faible résistance de joint de 30 à 300 MQ) en utilisant un 'chercher' pipette de patch de 7-10 résistance de MQ. Cette pipette doit être rempli avec la solution interne modifiée haute Na + pour la stimulation lâche-joint.
- Inject 100-300 ms longues impulsions actuelles hyperpolarisants via le sceau «lâche»; le potentiel de commande de pipette devrait être fixé à environ -60 à -70 mV. Observez une connexion écart de jonction si cette stimulation des résultats dans une petite réponse hyperpolarisant dans le neurone "post-synaptique.
- Repatcher le neurone «présynaptique» dans le mode cellule entière et procéder comme décrit ci-dessus.
REMARQUE: Pour assurer une bonne coloration des processus axonales et dendritiques, utiliser le protocole ci-dessous. Ce protocole est décrit en bref ici, cependant, un protocole détaillé pour le traitement histochimique utilisée dans notre laboratoire est donnée dans la réf. 37.
4. Traitement histochimique
- Transférer la tranche de cerveau avec la paire de neurones synapses couplées dans un flacon contenant 4% de paraformaldehyde dissous dans du tampon phosphate 0,1 M et fixer la tranche pendant 24 heures. Pour la microscopie électronique, fixer la tranche en utilisant 2,5% glutaraldéhyde et 1% de paraformaldehyde.
- Le jour suivant, transférer les tranches dans un tampon de phosphate ne contenant pas de fixateur normale. Laver tranches avec un tampon phosphate pour 6-8 fois pendant 10 - 15 min chacun pour enlever l'excès de fixateur.
- Incuber tranches pendant 20 min dans un 3% de H 2 O 2 en solution 0,1 M de tampon phosphate afin de minimiser la réaction de la peroxydase endogène. Observer la formation de bulles forte. Continuer la réaction jusqu'à ce qu'aucun autre bulles sont produites. Ensuite, rincer les tranches dans 0,1 M de tampon phosphate de 6-8 fois (pendant 10 min chacun) pour enlever tout reste de H 2 O 2.
- Réactions immunocytochimiques et chromogènes
La visualisation des neurones biocytine-rempli est basé sur une réaction streptavidine-peroxydase de raifort biotinylée catalysée avec de la diaminobenzidine; ce qui produit un précipité noir qui produit une tache croustillant avec une haute résolution spatiale. Les procédures suivantes sont utilisées pour la réaction chromogène: <ol> - Préparer la solution ABC selon le protocole du fabricant. Ajouter à 14,55 ml de tampon phosphate additionné 150 pi 10% de Triton X100 (tableau 6; seulement pour la microscopie optique) et maintenir la solution pendant environ 30 minutes dans l'obscurité. Incuber tranches dans cette solution O / N avant utilisation.
- Incuber tranches en solution ABC sur un agitateur pendant 1 heure à température ambiante et dans l'obscurité. Par la suite, garder des tranches O / N à 4 ° C dans un réfrigérateur. Le lendemain matin, les tranches incuber à température ambiante pendant une heure supplémentaire.
- Après cela, rinçage des tranches d'au moins quatre fois pendant 10 minutes chaque dans du tampon phosphate. Ensuite, incuber sur un agitateur pendant environ 30 min à l'obscurité dans 2 ml d'une solution 3-3'-diaminobenzidine-nickel intensifié (tableau 7). Soyez très prudent lors de la manipulation diaminobenzidine et utiliser uniquement sous la hotte; il est extrêmement cancérigène même à des concentrations très faibles.
- Ajouter 6,5 pi 3% de H 2 O 2 contenant au-diaminobenzidinesolution. Surveiller la réaction chromogène sous un microscope optique jusqu'au neurones taché de brun-noir sont clairement visibles. Ensuite, arrêter la réaction immédiatement par lavage tranches à plusieurs reprises dans un tampon phosphate.
- Tranches Mount neurones colorés sur adhésif, Histobond silane enduits ou diapositives d'objets standards gélatinisées.
- Gardez les lames dans une chambre humide avec au moins 80% d'humidité O / N. Le lendemain, laisser les tranches sécher à l'air pendant encore 10 min. Avant l'intégration, diapositives de transfert dans des solutions avec des concentrations croissantes de l'éthanol (20 à 100%) afin de les déshydrater.
NOTE: Le processus de déshydratation devrait être lente contraire des distorsions dans les processus de dendritiques et axonales sont susceptibles de se produire 37. Si une procédure d'intégration alternatif est choisi, par exemple, une avec le Moviol à base de glycérol, un déshydratation ne est pas nécessaire; mais cela est susceptible d'entraîner une compression non homogène de la tranche et donc une morpholo neuronale déforméegy. - Enfin, incuber pendant 10 min dans du xylol, intégrer les tranches dans un milieu d'enrobage hydrophobe pour la microscopie optique et placez un lamelles ultra-minces sur le dessus. Laissez sécher les diapositives pendant 20 min à température ambiante.
5. neuronale reconstruction et Synaptic Contact localisation
- Examiner les lames avec les neurones de biocytine marqué sous un microscope optique équipé d'un objectif 60X / 100X à immersion d'huile et d'un condenseur avec une ouverture numérique élevée pour la résolution spatiale optimale. Veiller à ce que axonale boutons et épines dendritiques sont clairement visibles.
- Trace neurones ou paires de neurones synaptiquement couplés en utilisant un neurone commerciale système de traçage (voir le tableau de matériaux spécifiques / Équipement) pour obtenir des reconstructions 3D neuronales. Effectuer le traçage manuellement sous inspection visuelle constante pour détecter même petite axonale ou des collatéraux dendritiques. Pour les enregistrements appariés de neurones synaptiquement couplés traçage manuel est encore la méthode dechoix parce que l'attribution de par exemple, un profil axonale soit le neurone pré ou post-synaptique requiert de l'expérience de reconstruction substantielle.
- Si nécessaire, faire des chefs d'accusation de boutons axonales et / ou épines dendritiques. Parce épines ou même sous-types de la colonne vertébrale et boutons axonales peuvent présenter une répartition et la densité spécifique concernant par exemple, couche corticale ou de la zone, ce qui pourrait aider à caractériser les types de cellules neuronales.
- Pour paires de neurones couplés synaptique, vérifiez l'axone présynaptique et les dendrites postsynaptiques pour les gros appositions au plus fort grossissement disponibles. Observer un bouton axonale et une colonne vertébrale ou arbre dendritique postsynaptique est dans le même plan focal peut être considéré comme un contact synaptique putatif. Marquer ce contact dans la reconstruction.
- Corrigez les reconstructions neuronaux pour le retrait dans les trois dimensions spatiales dans la section appropriée du programme de traçage.
REMARQUE: lors de la fixation, le traitement histochimiqueet la déshydratation mécanique déformation substantielle et retrait se produisent; cela va affecter les mesures de longueur axonales et dendritiques et sévèrement déformer leur disposition spatiale. Retrait des facteurs de correction pour le milieu d'inclusion sont ~ 1,1 pour x et y et ~ 2.1 pour la direction z 37. - Pour une analyse quantitative morphologique utiliser un programme d'analyse de données pour la neurophysiologie (voir le tableau de matériaux spécifiques / Équipement).
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Representative Results
Enregistrements liés sont la méthode de choix pour une caractérisation approfondie des connexions synaptiques uni ou bidirectionnels morphologiquement identifiées ainsi que jonctions lacunaires connexions (électriques) (Figure 1). Un exemple d'un enregistrement couplé à la couche 4 du cortex somato-sensoriel du canon est représentée sur la Figure 1A. Les deux excitateurs unidirectionnel et connexions synaptiques inhibiteurs peuvent être caractérisées (figure 1B, C). En outre enregistrements appariés permettent d'enregistrer à partir de connexions synaptiques, soit bidirectionnels, de connexions dans lequel les deux neurones dans une paire sont pré- et post-synaptique à l'autre. Ceci est illustré sur la figure 1D, ce qui montre les enregistrements provenant d'un interneurone inhibiteur et un neurone excitateur. Susciter un potentiel d'action dans le neurone excitateur (traces rouges) se traduit par une EPSP dans le interneurone inhibitrice postsynaptique (traces noires). Cependant, quand un potentiel d'action est evoked dans le interneurone, un IPSP peut être enregistré dans le neurone excitateur. figure 1E montre qu'il est également possible d'enregistrer à partir de neurones couplés via écart de jonction ou via une jonction des lacunes et une synapse chimique. Connexions de jonction réciproques et d'écart ne peuvent être identifiés par des enregistrements électrophysiologiques appariés jusqu'à présent mais pas par toute autre technique.
La combinaison de remplissage biocytine de neurones couplés via la pipette de patch et les enregistrements électrophysiologiques permet une corrélation de propriétés morphologiques des neurones aux propriétés synaptiques. Après neurones traitement histochimiques sont visibles comme des structures sombres dans la tranche obsédé (figure 2A). Ensuite, la paire de cellules neuronales enregistré peut être reconstruit morphologiquement et les types de cellules neuronales peut être identifié. En outre, il est possible de déterminer le nombre et l'emplacement des contacts synaptiques putatifs (panneaux de droite Figure 2A et Figure 2B encadré). La paire de neurone le montre la figure 2B est réciproquement connecté et contacts synaptiques sont donc établi sur les deux neurones. Dans nos mains, putatifs, légers contacts synaptiques microscope identifiés ont été confirmés comme de véritables contacts synaptiques avec le microscope électronique avec un 80 - degré de précision de 90% 16,21,26.
La figure 3 montre un exemple d'un enregistrement apparié à partir d'un neurone pyramidal présynaptique dans la couche du néocortex 6 du cortex du canon et un neurone épineux excitateurs dans la couche 4. Ce microcircuit neuronale translaminaire a une probabilité de liaison faible, mais peut être identifié en utilisant le procédé de recherche décrit dans 3.1.1 - 3.1.9 pour les connexions neuronales avec une connectivité à faible. Avec la technique d'enregistrement jumelé il est possible d'identifier les connexions synaptiques avec une connectivité très faible comme ce est le cas de certaines connexions à longue portée translaminaire (cet exemple) ou des connexions entre neurons situées dans différents «colonnes» corticales (connexions synaptiques entre les colonnes).
Figure 1. enregistrements paires de paires de cellules synaptiquement couplés. (A) Gauche, l'image IR-DIC d'une tranche de cerveau. Droit, interneurone (en haut) et un neurone excitateur (en bas). (B) Un potentiel d'action présynaptique (en haut) dans un neurone excitateur suscite un potentiel post-synaptique excitateur monosynaptique (EPSP) dans un autre neurone excitateur (en bas). (C) Une potentiel d'action (en haut) dans un interneurone inhibitrice présynaptique évoque un potentiel post-synaptique inhibitrice monosynaptique (IPSP) dans un neurone excitateur (en bas). (D) Un potentiel d'action (en haut à gauche) dans un neurone excitateur présynaptique évoque une EPSP (en bas à gauche) interneurone inhibitrice. A son tour, un potentiel d'actiondans le interneurone inhibitrice (en haut à droite) déclenche une IPSP dans le neurone excitateur (en bas à droite). (E) Une série de mesures de tension et hyper dépolarisants provoquées par injections de courant dans un neurone (en haut à gauche) se traduit par un écart-jonction second neurone couplé (en bas à gauche). En outre, un potentiel d'action présynaptique (en haut à droite) dans le premier neurone évoque une petite dépolarisation précoce (épillet, encadré) suivie d'une hyperpolarisation profonde tardive (IPSP) dans le potentiel de membrane de la deuxième neurone (en bas à droite). Barres d'échelle dans (B) se appliquent également à (C). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Identification des contacts synaptiques et Reconstr morphologiqueuction des paires de cellules biocytine-rempli. (A) Gauche, de faible puissance microphotographie d'une paire de cellules réciproquement couplée comprenant un stellaire épineux et un interneurone rapide dopage dans la couche 4 qui ont été remplies avec biocytine pendant l'enregistrement. Contacts légers microscope identifiés putatifs excitateurs synaptiques entre les neurones épineux présynaptique et postsynaptique interneurone sont marqués par des points verts. Contacts synaptiques inhibitrices réciproques putatifs sont indiqués par des points bleus. À droite, des images de haute puissance de contacts synaptiques. Cercles verts, contacts excitateurs; cercles vides bleus, des contacts d'inhibition. frontières de couche ont été déterminées par la structure cytoarchitectoniques de la tranche de cerveau colorées sous le microscope de faible puissance. reconstruction (B) Neurolucida de la même paire de cellules représenté en (A) et la figure 1C. Bleu, axone interneurone; rouge, interneurone soma et des dendrites; vert, axone des neurones épineux; blanc, aiguillat neurone soma et des dendrites. L'encartmontre les compartiments somatodendritiques des neurones pré- et post-synaptiques ainsi que les contacts synaptiques putatifs. contours de Barrel ont été identifiés dans les photomicrographies vif sur le terrain de faible puissance fabriqués à partir de la tranche de cerveau aiguë. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Une connexion synaptique représentant avec une très faible proportion de connectivité. (A) Un potentiel d'action présynaptique (en haut) dans une cellule pyramidale couche 6 évoque un potentiel post-synaptique excitateur monosynaptique (en bas) dans un neurone pyramidal couche 4 étoiles. Notez la longue période de latence (> 3,0 ms) de cette liaison trans-laminaire par rapport à celle des connexions intra-laminaire locales (≈1.0 msec). (B) respons postsynaptiquese de la couche 4 étoiles pyramidale neurone à deux potentiels d'action à 10 Hz suscité dans des cellules pyramidales couche 6. Notez la facilitation à court terme de cette connexion par rapport à la dépression à court terme de connexions locales (données non présentées). (C) la profondeur de l'imagerie avancée de mise au point de la même connexion comme dans (A, B). En médaillon, la somato / domaine dendritique d'un neurone pyramidal couche 4 étoiles. A noter la présence d'une dendrite apicale importante marquée par une flèche. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO 3 | 2.1 | |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 2 | 0,294 |
| MgCl 2 | 1 | 0,095 |
| Osmolarité ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gazés avec 95% O 2 et 5% de CO 2 | ||
Tableau 1. liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour la perfusion au cours de l'enregistrement.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO 3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 1 | 0,147 |
| MgCl 2 | 5 | 0,476 |
| Myo-inositol | 3 | 0,54 |
| Na-pyruvate | 2 | 0,22 |
| L'acide ascorbique (vitamine C) | 0,4 | 0,07 |
| Osmolarité ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gazés avec 95% O 2 et 5% de CO 2 | ||
Tableau 2. solution extracellulaire pour des tranches de cerveau aiguës des animaux immatures.
| mM | g / L | |
| Saccharose | 206 | 70,51 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO 3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 1 | 0,147 |
| MgCl 2 | 3 | 0,286 |
| Myo-inositol | 3 | 0,54 |
| Na-pyruvate | 2 | 0,22 |
| L'acide ascorbique (vitamine C) | 0,4 | 0,07 |
| Osmolarité ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gazés avec 95% O 2 et 5% de CO 2 | ||
Tableau 3. solution extracellulaire pour des tranches de cerveau aiguë des animaux matures (sucrose solution saline).
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| K-gluconate | 135 | 31,622 | 1,5811 |
| KCl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Phosphocréatine | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg2 + | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Ajuster le pH à 7,3 avec KOH | |||
| Osmolarité ~ 300 mOsmol / L | |||
| Ajouter 3-5 mg / ml biocytine | |||
Tableau 4. Faible solution de chlorure de pipette.
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| Na-gluconate | 105 | 22,92 | 1,146 |
| NaCl | 30 | 1,76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Phosphocréatine | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg2 + | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Ajuster le pH à 7,3 avec NaOH | |||
| Osmolarité ~ 300 mOsmol / L | |||
Tableau 5. Haute Nasolution de pipette pour la recherche neurones synaptiquement couplés.
| rapport | ml | |
| Un réactif | 1 | 0,15 |
| réactif B | 1 | 0,15 |
| 10% de Triton X100 | 1 | 0,15 |
| Tampon de phosphate 0,1 M | 97 | 14,55 |
| Conservé pendant 30 minutes dans l'obscurité avant utilisation | ||
Tableau 6. solution ABC pour la réaction histochimique.
| poids | volume | |
| 3-3'-diaminobenzidine | 10 mg | - |
| Tampon de phosphate 0,1 M | - | 20 ml |
| 1% de (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 | - | 5-10 ul |
| 1% CoCl 2 | - | 5 ul |
| 1% de (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 et 1% CoCl 2, on ajoute goutte à goutte tout en agitant la solution. | ||
Tableau 7. Solution pour diaminobenzidine (DAB) réaction.
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Discussion
Enregistrements appariés de excitateur synaptiquement couplé et / ou neurones inhibiteurs sont une approche très polyvalent pour l'étude de microcircuits neuronaux. Non seulement cette approche permet d'estimer la connectivité synaptique entre les types de neurones, mais permet également de déterminer les caractéristiques fonctionnelles de la connexion et de la morphologie des neurones pré- et post-synaptiques. En outre, un agoniste et / ou antagoniste peuvent être facilement appliqués à des neurones dans des préparations de tranche. Cela permet d'étudier les effets de neuromodulateurs sur les propriétés de la transmission synaptique 32 ou une caractérisation en profondeur d'une connexion synaptique unitaire définie en utilisant, par exemple, l'analyse quantique des synaptique libération 16,17,38,39. Trouver des électrique (écart de jonction) connexions synaptiques chimique et / ou est l'étape la plus critique de ce protocole. Nous avons donc inscrite différentes approches pour trouver des connexions synaptiques, en fonction du rapport de connectivité et sonType (chimique / électrique).
Un inconvénient majeur des préparations de tranche est la troncature souvent substantielle de longue portée projections axonales de sorte que seules de petites parties de la longueur axonale total de l'axone sont récupérés. Pour certains types de cellules pyramidales, le degré de troncature pourrait jusqu'à 90% ou même plus lors de la prise des projections vers d'autres aires corticales ou régions sous-corticales en compte. Ceci rend la préparation de tranches impropre à l'étude des connexions synaptiques entre les neurones corps cellulaires qui sont de plus de> 300 um d'intervalle. Cependant, dans des préparations de tranche aiguës, projections axonales locales, en particulier celles des interneurones locaux sont généralement récupérées avec un degré de dendritique et troncature axonale (~ 10% ou moins) relativement faible en raison de la durée de champ horizontal et vertical limité de leurs tonnelles axonales . Connexions impliquant ces types de neurones peuvent donc être caractérisés par un degré élevé de précision et Reliabilité et donné des estimations de connectivité largement correctes. A l'exception de ces connexions synaptiques locales, valeurs absolues pour les ratios de connectivité entre les types de deux de neurones obtenus dans les préparations de tranche sont hautement problématique, en particulier pour les neurones avec de grandes distances inter-somatiques comme dans translaminaire ou non-locale, longue distance intralaminaire connexions synaptiques . Ce problème est exacerbé lorsque les conditions de tranchage ne ont pas été optimisé pour une connexion synaptique donnée à un âge défini. Pour plus réalistes connectivité estimé nouvelles méthodologies telles que électrons dense reconstructions microscopiques 40 et structurelle axo-dendritique chevauchement 41 ont été développés. Toutefois, même ces techniques doivent prendre en compte la grande diversité des interneurones inhibiteurs et aussi neurones excitateurs.
Un problème supplémentaire avec les estimations de connectivité est que les contacts synaptiques distales, par exemple, ceux de touffe apicale de neurones pyramidaux, peutéchapper à la détection. Lorsqu'elle est mesurée à le soma l'amplitude de leur réponse synaptique est très petit et est susceptible de disparaître dans le bruit (Qi et al., 2014, dans la soumission). Toutefois, ce genre de problème ne est pas limité à l'approche d'enregistrement jumelé mais également se produire avec d'autres techniques utilisées pour étudier la connectivité synaptique.
Dans activation induite par la récente année-lumière de microcircuits neuronaux (ce est à dire, par photo-libération de glutamate en cage ou par l'activation de channelrhodopsin) a été utilisé pour étudier la connectivité neuronale, même sur une plus grande échelle 42-52. Cependant, avec ces approches optiques, il ne est pas possible d'identifier les propriétés structurelles du type de neurone présynaptique. En outre, le nombre et l'emplacement des contacts synaptiques établies par une connexion neuronale ne peuvent être identifiés, du moins pas à ce jour. Enregistrements appariés, d'autre part, permettent la caractérisation de deux pré et post-synaptique neursur des types dans un microcircuit synaptique. Ceci est particulièrement important puisque de nombreuses études ont montré que les interneurones GABAergiques et les neurones excitateurs sont très diverses quant à leur morphologie et la physiologie synaptique 53-56. Ainsi, l'identification de deux neurones pré- et postsynaptiques est une condition préalable à la description d'une 57 connexion synaptique. Enfin, les enregistrements appariés permettent l'enregistrement des différentes configurations de connexion synaptique (connexions réciproques, coexistant jonctions lacunaires et synapses chimiques). Par conséquent, la technique d'enregistrement couplé restera une approche importante pour l'étude de microcircuits neuronaux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
References
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D. Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. Fellin, T., Halassa, M. 67, Springer Verlag. 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single 'barrel' of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
